KR101865892B1

KR101865892B1 - 황칠나무 발효 추출물, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101865892B1
Application number: KR1020160100729A
Authority: KR
Inventors: 이승헌; 박태희; 이수영; 이재열; 박세호; 임상동
Original assignee: 비알 컨설팅 인코포레이티드
Priority date: 2016-08-08
Filing date: 2016-08-08
Publication date: 2018-06-08
Also published as: KR20180017276A

Abstract

본 발명은 황칠나무 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 황칠나무 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증 또는 미백 효과를 갖는 화장료 조성물, 이를 포함하는 화장품, 황칠나무 발효 추출물을 제조하는 방법 및 황칠나무 발효액을 제공한다. 본 발명의 새로운 화장료 조성물은 낮은 세포독성을 가지면서, 효과적으로 염증이 억제되고 멜라닌 생성이 억제된다.

Description

황칠나무 발효 추출물, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물{Dendropanax morbifera ferment extracts, Manufacturing method of the same and Cosmetics composition containing the same as an active ingredient as an active ingredient}

본 발명은 황칠나무 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 황칠나무 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증 또는 미백 효과를 갖는 화장료 조성물, 이를 포함하는 화장품 및 황칠나무 발효 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

황칠나무(Dendropanax morbifera)는 한국 특산종으로서 주로 남쪽 섬에서 자라며, 높이는 15m에 달하고 어린 가지는 녹색이며 털이 없다. 그 잎은 달걀 모양 또는 타원형으로서 어긋나고, 잎 가장자리가 밋밋하지만 어린 나무에서는 3~5개로 갈라지고 톱니가 있다. 꽃은 연한 황록색으로 6월에 피고, 양성화이며 산형꽃차례에 달린다. 꽃줄기는 길이 3~5cm이고, 작은 꽃줄기는 길이 5~10mm이며, 꽃받침은 5개로 갈라지고 꽃잎과 수술은 5개씩이며 화반에 꿀샘이 있다. 암술머리는 5개로 갈라지고 핵과는 타원형이며 10월에 흑색으로 성숙하고 암술대가 남아 있다. 황칠나무의 껍질에 상처를 내면 노란 액체가 흘러나오는데, 이것을 황칠(黃漆)이라고 하며 오래전부터 가구의 도료로 사용하였으나, 최근의 연구 결과에 따르면 항암 효과, 간세포 재생, 당뇨 치료, 경조직 세포 재생 등에 효과적인 것으로 밝혀졌다.

황칠나무와 관련한 특허를 보면, 대한민국 공개특허 제10-2011-0078527호는 황칠나무의 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물로서, 황칠나무의 추출물은 MMP-1 생성억제 효과, 콜라겐 합성증진 효과, 자외선 조사에 의한 세포독성완화 효과, 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제 효과가 있음을 보여주고 있다. 또한, 대한민국 등록특허 제10-1544176호에는 제주 황칠나무 추출물의 안정화 방법과 이의 방법으로 안정화된 황칠나무 추출물을 포함하는 미백 또는 항염 기능을 갖는 화장료 조성물에 대하여 개시하고 있다.

그러나 현재까지 황칠나무 잎 또는 수액 발효 추출물의 미백과 항염 효과에 대한 연구는 아직 미흡한 실정이며, 그에 관련된 특허는 아직 공개된 바가 없다.

따라서, 본 발명에서는 피부 세포의 독성이 거의 없으며, 천연물질인 황칠나무 잎 발효 추출물 또는 황칠나무 수액 발효 추출물을 이용하여, 미백 및 항염 기능성이 우수한 화장료 조성물 및 이를 제조하는 방법을 제안하고자 한다.

이에 본 발명자들은 황칠나무 잎 또는 수액 발효 추출물을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 황칠나무(Dendropanax morbifera) 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증 또는 미백 효과를 갖는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 황칠나무 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증 또는 미백 효과를 갖는 기능성 화장품을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 항염증 또는 미백 효과를 갖는 황칠나무 발효 추출물의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 항염증 또는 미백 효과를 갖는 황칠나무 발효액을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 황칠나무(Dendropanax morbifera) 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증 또는 미백 효과를 갖는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 황칠나무 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증 또는 미백 효과를 갖는 기능성 화장품을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 a) 황칠나무의 잎 추출물 또는 황칠나무 수액을 준비하는 단계; b) 상기 a)단계에서 준비한 황칠나무 잎 추출물 또는 황칠나무 수액에 수탁번호 KACC92132P로 표시되는 Lactobacillus plantarum ilchiwhangchil2020균 또는 수탁번호 KACC92131P로 표시되는 Lactobacillus plantarum ilchiwhangcil1785균을 처리하여 발효시키는 단계; 및 c) 상기 b)단계에서 얻어진 발효 추출물을 필터에 여과시키는 단계를 포함하는 항염증 또는 미백 효과를 갖는 황칠나무 발효 추출물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기의 방법으로 제조된 항염증 또는 미백 효과를 갖는 황칠나무 발효액을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 발효액을 유효성분으로 함유하는 항염증 또는 미백 효과를 갖는 화장품을 제공한다.

따라서, 본 발명은 황칠나무 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증 또는 미백 효과를 갖는 화장료 조성물, 이를 포함하는 화장품 및 황칠나무 발효 추출물을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 새로운 화장료 조성물은 낮은 세포독성을 가지면서, 효과적으로 염증이 억제되고 멜라닌 생성이 억제된다.

도 1은 황칠나무 잎(a)과 수액(b) 시료를 나타낸 사진이다.
도 2는 황칠나무 잎 발효 추출물(a)과 수액 발효 추출물(b)의 제조 방법을 나타낸 모식도이다.
도 3은 미생물 발효 시간에 따른 황칠나무 잎 발효 추출물의 pH변화를 나타낸 그래프이다(a: Lactobacillus K2020, b: Lactobacillus K1785).
도 4는 미생물 발효 시간에 따른 황칠나무 잎 발효 추출물의 생균 수 변화를 나타낸 그래프이다.
도 5는 미생물 발효 시간에 따른 황칠나무 수액 발효 추출물의 생균 수 변화를 나타낸 그래프이다(a: Lactobacillus K2020, b: Lactobacillus K1785).
도 6은 RAW264.7 세포에 황칠나무 잎 발효 추출물을 처리하였을 때, NO 생성(a)과 세포 생존율(b)을 나타낸 그래프이다.
도 7은 RAW264.7 세포에 황칠나무 수액 발효 추출물을 처리하였을 때, NO 생성(a)과 세포 생존율(b)을 나타낸 그래프이다.
도 8은 황칠나무 잎 발효 추출물(a)과 수액 발효 추출물(b)의 멜라닌 생성 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 황칠나무 잎 발효 추출물의 희석배수에 따른 멜라닌 생성률(a) 과 세포 생존율(b)을 나타낸 그래프이다.
도 10은 황칠나무 수액 발효 추출물의 희석배수에 따른 멜라닌 생성률(a) 과 세포 생존율(b)을 나타낸 그래프이다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

상술한 바와 같이, 황칠나무의 잎 또는 수액 발효 추출물의 미백 또는 항염증 효과에 대한 연구는 이루어진 바 없다.

본 발명은 낮은 세포독성을 가지면서, 염증을 억제하고 멜라닌 생성을 억제하는 효과가 있다.

따라서, 본 발명은 황칠나무(Dendropanax morbifera) 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증 또는 미백 효과를 갖는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 황칠나무는 높이 15m에 달하고 어린 가지는 녹색이며 털이 없다. 잎은 어긋나고 달걀모양 또는 타원형이다. 또한, 잎 가장자리가 밋밋하지만 어린나무에서는 3~5개로 갈라지고 톱니가 있다. 꽃은 6월에 연한 황록색으로 피고 양성화이며 산형꽃차례에 달린다. 꽃줄기는 길이 3~5cm이고 작은 꽃줄기는 길이 5~10mm이다. 꽃받침은 5개로 갈라지고 꽃잎과 수술은 5개씩이며 화반에 꿀샘이 있다. 암술머리는 5개로 갈라지고 핵과는 타원형이며 10월에 흑색으로 성숙하고 암술대가 남아 있다. 나무껍질에 상처를 내면 노란 액체가 나오는데 이것을 황칠이라고 하며 가구의 도료로 사용하였다. 한국 특산종으로 남쪽 섬에서 자란다.

본 발명에 있어서, 황칠나무 발효 추출물은 황칠나무의 다양한 기관 또는 부분(예: 잎, 꽃, 뿌리, 줄기, 가지, 껍질, 수액 및 종자 등)으로부터 추출 및 발효하여 얻은 것을 의미하고, 바람직하게는 잎, 줄기, 가지, 껍질, 수액 또는 뿌리로부터 얻은 발효 추출물이고, 보다 바람직하게는 잎, 줄기 또는 수액으로부터 얻은 발효 추출물이며, 가장 바람직하게는 잎 또는 수액으로부터 얻은 발효 추출물을 의미한다.

본 발명의　화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로 제조되는 데에 제한이 있는 것은 아니며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는,　화장수, 영양 크림, 수분 크림, 에센스, 아이 크림, 로션, 팩, 에센스와 같은 기초　화장품인 기능성　화장품을 제조하는 데 적용이 가능하다.

본 발명의　화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 추출물 또는 발효 추출물 이외에　화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 황칠나무 발효 추출물은 Lactobacillus속의 균으로 발효시키는 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 Lactobacillus plantarum 균으로 발효시키는 것일 수 있다. 더욱 바람직하게는 수탁번호 KACC92132P로 표시되는 Lactobacillus plantarum ilchiwhangchil2020균 또는 수탁번호 KACC92131P로 표시되는 Lactobacillus plantarum ilchiwhangcil1785균으로 발효시키는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, Oriolus versicolor , Stereum hirustum , Phellinus linteus , Aspergillus oryzae , Bacillus속 균주,　 Fomes fomentarius , Coriolus sinensis 및 Lactobacillus속 균주를 이용하여 황칠나무 발효 추출물을 제조한 결과, Lactobacillus 속 균주에서 가장 높은 항염 및 미백 효과를 나타냄을 확인하였다. 그 후, Lactobacillus 속 122종 중 9가지 균주 L. acidophilus, L. delbrueckii, L. helveticus , L. curvatus , L. plantarum , L. sakei , L. buchneri , L. fermentum 및 L. reuteri를 준비하여 항염 및 미백효과를 확인해 본 결과, Lactobacillus plantarum 균주로 발효시킨 경우, 가장 높은 항염 및 미백 효과를 확인할 수 있었다. 그 중에서 가장 높은 효과를 보인 두 종의 균주를 선별하였으며, 각각 수탁번호 KACC92132P로 표시되는 Lactobacillus plantarum ilchiwhangchil2020균 및 수탁번호 KACC92131P로 표시되는 Lactobacillus plantarum ilchiwhangcil1785균으로 명명하였다.

본 발명에서 상기 발효는 36시간 내지 60시간 발효하는 것일 수 있다. 36시간보다 적게 발효할 경우, 충분히 2차 대사 산물이 생성되지 않아 미백 또는 항염증에 효과적이지 않을 수 있으며 60시간 이상 발효할 경우, 용액 내의 산도가 감소하고 발효균의 수가 급격히 감소하는 등의 부작용이 있다.

본 발명에서 상기 황칠나무 발효 추출물은 상기 화장료 조성물의 전체 중량에 대하여 0.001 내지 30.0 중량% 함유되는 것일 수 있다. 바람직하게는 황칠나무 잎 추출물의 경우, 화장료 조성물의 전체 중량에 대하여 0.001 내지 25.0 중량% 로 함유되는 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 0.01 내지 20.0 중량%로 함유되는 것일 수 있다. 또한, 황칠나무 수액 추출물의 경우, 화장료 조성물의 전체 중량에 대하여 0.001 내지 1.5 중량% 로 함유되는 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 0.01 내지 1.0 중량%로 함유되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 황칠나무 잎 발효 추출물의 함량이 증가함에 따라 세포 독성이 나타남을 알 수 있으므로 화장품 원료로 사용 시 20 wt% 미만의 함량으로 사용하는 것이 바람직하다는 것을 확인하였다. 또한, 황칠나무 수액 발효 추출물의 함량이 1 wt% 이상이 될 경우, 미백 효능은 우수하지만 멜라노마 세포에서의 세포 독성이 강해지는 것을 확인하였으므로 황칠나무 수액 발효 추출물을 화장품 원료로 사용 시 1 wt% 미만의 함량범위에서 사용되는 것이 권장됨을 확인하였다.

본 발명은 황칠나무 발효 추출물을 함유하는 항염증 또는 미백 효과를 갖는 기능성　화장품을 제공한다.

본 발명의　화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 추출 발효물 또는 발효액 이외에　화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체를 포함할 수 있다.

본 발명은 a) 황칠나무의 잎 추출물 또는 황칠나무 수액을 준비하는 단계; b) 상기 a)단계에서 준비한 황칠나무 잎 추출물 또는 황칠나무 수액에 수탁번호 KACC92132P로 표시되는 Lactobacillus plantarum ilchiwhangchil2020균 또는 수탁번호 KACC92131P로 표시되는 Lactobacillus plantarum ilchiwhangcil1785균을 처리하여 발효시키는 단계; 및 c) 상기 b)단계에서 얻어진 발효 추출물을 필터에 여과시키는 단계를 포함하는 항염증 또는 미백 효과를 갖는 황칠나무 발효 추출물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 상기 a)단계 황칠나무 잎 추출물은 황칠나무 잎 중량대비(wt%) 10배의 정제수를 넣고, 70 내지 90℃ 온도 조건에서 2 내지 4 시간 동안 추출하는 것일 수 있다.

만약, 70℃ 온도 조건보다 낮은 온도에서 추출하거나, 2시간 이내로 추출하게 되면 황칠나무 잎으로부터 유효성분이 충분히 추출되지 않을 수 있고, 90℃ 온도조건보다 높은 온도에서 추출하게 되면 황칠나무 잎으로부터 유효성분이 변형되어 항염 또는 미백 효과가 충분하지 않을 수 있다. 또한, 4시간보다 긴 시간 동안 추출하게 되면, 유효성분 이외에 부수적인 성분들이 다량 추출되어 항염 또는 미백 효과가 효과적이지 못할 수 있다.

본 발명의 상기 b)단계 발효는 6 X 10⁸ 내지 8 X 10⁸ cfu/ml의 균수로 미생물을 접종하고, 35 내지 40℃의 온도 조건에서 36 내지 60시간 동안 발효하는 것일 수 있다.

만약, 6 X 10⁸ cfu/ml보다 적은 균으로 발효를 진행하면 충분하게 2차 대사 산물이 생성되지 않을 수 있고, 8 X 10⁸ cfu/ml보다 많은 균으로 발효를 진행하면 용액 내의 산도가 높아져 발효시간이 감소하여 유익한 발효물의 생성이 적어지는 부작용이 있을 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 황칠나무 잎/수액 발효 추출물을 두 가지 균주로 발효시켰을 때, 2일째에 가장 많은 pH 변화를 확인하였다. 또한, 2일째에 가장 많은 생균 수를 확인하였다. 이를 통해 48시간 동안 배양하는 것이 황칠나무 발효 추출물을 생산하는데 최적의 시간임을 확인하였다. 따라서 상기 b) 단계의 발효는 36 내지 60시간 동안 발효하는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 42시간 내지 54시간 동안 발효하는 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 45시간 내지 51시간 동안 발효하는 것일 수 있다.

본 발명의 상기의 방법으로 제조된 항염증 또는 미백 효과를 갖는 황칠나무 발효액을 제공한다.

상기 황칠나무 발효액은 잎 또는 수액 추출물을 발효하여 얻은 발효액일 수 있다.

본 발명은 상기 발효액을 유효성분으로 함유하는 항염증 또는 미백효과를 갖는 화장품을 제공한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 황칠나무 잎 추출물의 제조 및 황칠나무 수액 준비

실시예 1-1. 황칠나무 잎 추출물의 제조

2016년 3월 제주도특별자치도 제주시 조천읍에서 수득한 황칠나무 잎을 30℃에서 24시간 건조 후, 세절하였다. 그 후, 10배수의 정제수를 넣고 80℃에서 3시간 동안 추출하였다. 그런 다음, 이 추출물을 감압여과 하여 황칠나무 열수 추출물을 수득하였다.

실시예 1-2. 황칠나무 수액 준비

2015년 3월 제주특별자치도 서귀포시에서 수득한 황칠나무 수액을 30℃에서 24시간 건조 후, 세절하였다.

실시예 2. 발효 균주의 선별

실시예 2-1. 여러가지 발효 균주로 발효한 황칠나무 잎/수액 추출물의 항염증 또는 미백 효과

상기 실시예 1에서 제조한 황칠나무 잎 추출물 또는 수액을 발효하는데 있어서 최적의 발효 균주를 선별하기 위하여, 하기 실험을 실시하였다.

Oriolus versicolor , Stereum hirustum , Phellinus linteus , Aspergillus oryzae, Bacillus속 균주,　 Fomes fomentarius , Coriolus sinensis 및 Lactobacillus속 균주를 준비하여, 황칠나무 잎 추출물과 황칠나무 수액을 발효시켰다. 황칠나무 추출물 발효시 균수는 7 X 10⁸ cfu/ml로 접종하였고, MRS 배지에 황칠나무 잎 추출물/수액을 20wt% 비율로 제조하고, 배양액의 1%의 균(7 X 10⁸ cfu/ml)을 접종하였다. 그 후 48시간 동안 인큐베이터에서 배양하였다.

그 후, 황칠나무 잎 또는 수액 발효 추출물의 항염증 효과를 측정하기 위해 RAW264.7을 이용하여 NO assay를 실시하였고, 멜라닌 생성 억제능을 측정하기 위해 쥐 유래 멜라닌 세포주 B16-F0의 멜라닌 생성 억제능을 측정하였다.

그 결과, Lactobacillus 속 균주로 발효한 황칠나무 잎 또는 수액 발효 추출물에서 가장 우수한 항염증 효과 및 미백 효과를 나타내었다.

실시예 2-2. 여러가지 Lactobacillus 속 균주로 발효한 황칠나무 잎/수액 추출물의 항염증 또는 미백 효과

상기 실시예 2-1에서 Lactobacillus 속 균주로 발효한 황칠나무 잎/수액 추출물의 항염증 또는 미백 효과가 우수하였다. 이에, 가장 최적의 Lactobacillus 종을 확인하고자 하였다.

총 9가지 균주 L. acidophilus, L. delbrueckii , L. helveticus , L. curvatus, L. plantarum , L. sakei , L. buchneri , L. fermentum , L. reuteri를 준비하였다. 그리고 상기 실시예 2-1에서 실시한 바와 동일하게 준비된 균주로 황칠나무 잎 추출물과 황칠나무 수액을 발효시켰다. 황칠나무 추출물 발효시 균수는 7 X 10⁸ cfu/ml로 접종하였고, MRS 배지에 황칠나무 잎/수액 추출물을 20wt% 비율로 제조하고, 배양액의 1%의 균(7 X 10⁸ cfu/ml)을 접종하였다. 그 후 48시간 동안 인큐베이터에서 배양하였다.

그 후, 황칠나무 잎 또는 수액 발효 추출물의 항염증 효과를 측정하기 위해 RAW264.7을 이용하여 NO assay를 실시하였고, 멜라닌 생성 억제능을 측정하기 위해 쥐 유래 멜라닌 세포주 B16-F0의 멜라닌 생성 억제능을 측정하였다(자세한 실험방법은 이후 실시예 5 참조).

그 결과, Lactobacillus plantarum 균주로 발효한 황칠나무 잎 또는 수액 발효 추출물에서 가장 우수한 항염증 효과 및 미백 효과를 나타내었다.

본 발명자들은 Lactobacillus plantarum 균주 중 가장 우수한 항염증 효과 및 미백 효과를 나타내도록 발효시킬 수 있는 균주 2종을 선정하였으며, 각각을 Lactobacillus plantarum ilchiwhangchil2020(이하 약칭 K2020, 미생물 수탁번호: KACC 92132P), Lactobacillus plantarum ilchiwhangchil1785(이하 약칭 K1785, 미생물 수탁번호: KACC 92131P)로 명명하고 미생물 수탁기관에 수탁하였다.

실시예 3. 황칠나무 발효 추출물의 제조

실시예 3-1. 황칠나무 잎 발효 추출물의 제조

상기 실시예 1-1에서 수득한 황칠나무 잎 열수 추출물을 각각 Lactobacillus plantarum K2020와 Lactobacillus plantarum K1785를 사용하여 발효하였다. K2020 및 K1785 균주의 배양액은 MRS 배지(Difco^TM Lactobacilli MRS Broth, Becton, Dickinson and Company, USA)를 사용하였다. 황칠나무 잎 발효 추출물 제조 시 K2020 및 K1785의 균 수는 7 X 10⁸ cfu/ml로 동일하게 접종하였다.

MRS 배지에 황칠나무 잎 추출물 함량을 0, 10, 20, 30, 40 wt% 비율로 제조하고 배양액의 1%의 균(7 X 10⁸ cfu/ml)을 접종하였고, 그 이후, 48시간 동안 진탕배양기에서 배양하였다. 그 후, 배양액은 10분간 원심분리(4,000 X g)하여 균이 없는 상층액을 포집하였다. 포집한 상층액은 필터링(0.22 μm pore size)하여 최종적으로 황칠나무 잎 발효 추출물을 확보하였다.

실시예 3-2. 황칠나무 수액 발효 추출물의 제조

상기 실시예 1-2에서 수득한 황칠나무 수액을 각각 K2020과 K1785를 사용하여 발효하였다. K2020 및 K1785의 배양액은 MRS 배지를 사용하였다. 황칠나무 수액 발효 추출물 제조 시 K2020 및 K1785의 균수는 7 X 10⁸ cfu/ml로 동일하게 접종하였다.

MRS 배지에 황칠나무 수액 함량을 0, 0.5, 1.0, 2.0 wt% 비율로 제조하고 균을 접종하였고, 그 이후, 48시간 동안 진탕배양기에서 배양하였다. 그 후, 배양액은 10분간 원심분리(4,000 X g)하여 균이 없는 상층액을 포집하였다. 포집한 상층액은 필터링(0.22 μm pore size)하여 최종적으로 황칠나무 수액 발효 추출물을 확보하였다.

실시예 3-3. 황칠나무 잎/수액 발효 추출물의 명명

상기 실시예 3-1 및 3-2에서 수득한 황칠나무 잎 또는 수액 발효 추출물은 하기 표 1과 같이 명명하였다.

Sample	황칠나무 잎 함량 (%)	황칠나무 수액 함량 (%)	*Lactobacillus* K2020	*Lactobacillus* K1785	명명
A	-	-	-	-	Control (0%)
B	10	-	O	X	K2020-10%
C	20	-	O	X	K2020-20%
D	30	-	O	X	K2020-30%
E	40	-	O	X	K2020-40%
F	10	-	X	O	K1785-10%
G	20	-	X	O	K1785-20%
H	30	-	X	O	K1785-30%
I	40	-	X	O	K1785-40%
J	-	0.5	O	X	K2020-0.5%
K	-	1	O	X	K2020-1%
L	-	2	O	X	K2020-2%
M	-	0.5	X	O	K1785-0.5%
N	-	1	X	O	K1785-1%
O	-	2	X	O	K1785-2%

실시예 4. 황칠나무 잎 또는 수액 추출물의 발효조건 설정

실시예 4-1. pH변화에 따른 적정 발효일 설정

황칠나무 잎 또는 수액 발효 추출물의 적정한 발효기간을 확인하기 위하여, K2020 및 K1785 균주를 황칠나무 잎 및 수액 추출물을 함유한 MRS 배지에 접종한 후, 시간별 pH를 pH meter 기기를 이용하여 측정하였다. K2020 및 K1785 균주의 pH 변화는 배양 시간이 2일 경과하였을 때 가장 많은 변화를 보이며, 이때 가장 많은 젖산 생성을 나타내었으며, 황칠나무 잎/수액 발효 추출물의 함량에 따른 pH 변화는 미미하였다.

따라서, 도3에 나타난 바와 같이, 황칠나무 잎/수액 발효 추출물에서의 두 균주의 pH 변화는 배양 시간이 2일 지났을 때 가장 많은 변화를 보였으므로 추출물의 발효 시간은 2일로 설정하였다.

실시예4 -2. 황칠나무 잎/수액 발효 추출물의 생균수 측정

황칠나무 잎 또는 수액 발효 추출물의 생균수를 확인하기 위하여, K2020 또는 K1785 균주를 황칠나무 잎/ 수액 추출물을 함유한 MRS 배지에 접종하였다. 그 후, 하루 간격으로 MRS 배지에 균주를 10⁴배 희석하고 스프리딩(spreading) 하였다. 스프리딩 후, 배양기에서 37℃, 15시간 배양 후 생성되는 콜로니의 수를 세어 생균 수를 확인하였다.

황칠나무 잎 발효 추출물의 함량을 20 wt%, 그리고 황칠나무 수액 발효 추출물의 함량을 0.5, 1, 2 wt% 배합한 MRS 배지에 대한 생균 수 측정을 수행하였다. 그 결과, 황칠나무 잎/수액 발효 추출물의 생균 수가 2일 배양 후 최대 균의 수로 증가하였으며 그 이후부터 균 감소를 보였다(도 4 참조). 이는 Lactobacillus plantarum 균주에 의해 생성되는 젖산의 양이 증가하면서 pH가 감소하기 때문에, Lactobacillus plantarum 균주의 사멸을 유발하기 때문으로 생각된다.

황칠나무 수액 발효 추출물의 경우 황칠나무 수액 함량비의 증가에 따라 생균수가 감소하는 경향을 보였다. 그렇기 때문에 K2020과 K1785의 생균 수 감소를 보이지 않는 1 wt%을 사용하여 후속 연구를 진행하였다(도 5 참조).

또한, 균 수가 많다는 것은 황칠나무 성분에서 대사 산물 생성이 많았음을 의미하는 것이므로 본 과제에서는 Lactobacillus plantarum 균주가 가장 많이 발견된 2일 배양 후의 황칠나무 잎/수액 발효 추출물을 사용하여 연구를 진행하였다.

실시예 4-3. 황칠나무 잎/수액 발효 추출물의 젖산 분석

앞서 확인한 pH 변화와 생균 수가 젖산 생성에 기인한 것인지 확인하기 위하여, 황칠나무 잎/수액 추출물의 발효에 따른 젖산생성을 분석하였다. 젖산의 정량은 유산탈수소효소(lactic acid dehydrogenase, LDH)를 이용하여 피루브산 형성 시 NAD⁺에서 형성하는 NADH를 340 nm에서 측정하는 방법을 사용하였다. 측정되는 NADH 는 젖산의 존재를 의미하며, 당량비가 같음을 의미한다.

이미 알고 있는 젖산의 양을 달리하여 검량선을 작성하고, 유산탈수소효소의 활성을 확인한 후, 시료와 유산탈수소효소를 반응시킨 후에 340nm에서 흡광도 를 측정하여 젖산의 유무를 판단하였다. 젖산의 측정 원리는 하기 화학 반응식1에 기재하였다.

[화학 반응식1]

그 결과, 황칠나무 잎 발효 추출물의 경우 두 균주 모두 발효가 시작하고 2일째에 젖산의 가장 많이 검출되었다. 이는 생균수의 결과와 pH의 변화와 일치하는 결과로서 2일 후 생균 수가 감소하는 것은 젖산의 형성에 의한 생육환경의 변화에 기인하는 것으로 판단할 수 있다. 황칠나무 수액 발효 추출물의 경우에도 두 균주 모두 발효가 시작하고 2일째 젖산이 가장 많이 검출되었다.

실시예 4-4. 황칠나무 잎/수액 발효 추출물의 아미노산 분석

황칠나무 잎(20 wt%) 발효 추출물과 황칠나무 수액(1 wt%) 발효 추출물의 아미노산 분석을 실시하였다. 그 결과는 하기 표 2와 같다.

	K2020-20% (Sample C)	K1785-20% (Sample G)	K2020-1% (Sample K)	K1785-1% (Sample N)
Cys	0.00	0.00	0.00	0.00
ASP	88.64	121.31	117.93	117.15
GLU	270.98	336.20	327.71	315.06
ASN	38.50	80.41	83.08	77.61
SER	129.57	140.82	135.79	127.74
GLN	11.70	19.31	18.33	19.65
GLY	83.80	63.53	61.42	53.62
HIS	21.05	23.36	24.82	24.44
ARG	137.68	165.61	150.55	138.79
THR	60.66	97.63	79.28	76.56
ALA	204.31	266.05	256.99	240.55
GABA	30.30	25.78	18.88	17.93
PRO	66.10	80.35	78.82	72.44
TYR	100.06	138.34	131.69	123.11
VAL	203.77	220.09	208.13	192.79
MET	6.36	40.44	38.16	36.66
Cys2	0.00	0.00	0.00	0.00
ILE	159.92	191.60	182.09	171.07
LEU	380.56	490.17	466.57	436.37
PHE	202.36	284.00	271.08	244.26
TRP	111.95	143.00	117.10	105.78
LYS	306.53	340.46	347.62	283.48
TOTAL	2614.82	3268.45	3116.03	2875.07

주요 아미노산 성분은 glutamic acid, alanine, leucine으로 Lactobacillus plantarum 균주 특성과 무관하게 발효가 진행되는 것으로 확인되었다.

실시예 5. 황칠나무 잎/수액 발효 추출물의 항염증 또는 미백 효과 분석

실시예 5-1. 항염증 효과 분석

황칠나무 잎 또는 수액 발효 추출물의 항염증 효과를 확인하기 위하여, RAW264.7을 이용한 황칠나무 발효 추출물의 항염증 효과를 측정하기 위해 NO assay를 실시하였다.

대식 세포주 RAW264.7은 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)으로부터 분양 받아 10% FBS와 1% 항생제(페니실린/스트렙토마이신)를 첨가한 DMEM 배지(Welgene, Gyeongsan, Korea)를 이용하여 5% CO₂가 존재하는 37℃ 배양기에서 2∼3회 계대 배양한 후 사용하였다. RAW264.7 세포를 96-웰 플레이트에 1×10⁶ cells/well이 되도록 분주하여 5% CO₂ 배양기에서 20 내지 24시간 동안 예비 배양한 후 시료를 농도별로 처리하여 24시간 배양하였다.

이때, 대식 세포주 RAW264.7 cell의 염증을 유발하기 위하여 1mg/ml 농도의 lipopolysaccharide (Sigma-Aldrich, USA) 10μl를 각 웰에 주입하였다. 그 후, 상등액 100μl를 96-웰 플레이트에 옮겨 griess reagent (with 2.5% phosphoric acid, 1% sulfanilamide, 0.1% N-(1-Naphtyl) ethylenediamine) 100 μl를 각 웰에 넣어 반응시켰다. 그 후, 540nm 파장에서 ELISA 리더기로 광학 밀도(optical density)를 측정하였다. 측정한 광학 밀도는 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide)를 가한 세포에서의 광학 밀도 값과 비교하여 백분율(%)로 표시하였다.

양성 대조군으로는 리포폴리사카라이드를 가하지 않은 RAW264.7 cell에서의 광학 밀도 값이며, 음성 대조군으로는 NO 억제제로 작용하는 Lω-Nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME, Sigma-Aldrich, USA)를 가한 세포에서의 광학 밀도 값이다.

아울러, RAW264.7의 시료에 대한 세포 생존율을 측정하기 위해 MTT assay를 실시하였다. RAW264.7 세포를 96-웰 플레이트 1 X 10⁶ cells/well이 되도록 분주하여 5% CO₂배양기에서 20 내지 24시간 동안 예비 배양하고, 시료를 농도별로 처리하여 24시간 배양한 후, PBS에 녹인 MTT(5mg/ml) 용액 10μl를 각 웰에 넣고 배양기에서 4시간 동안 반응시켰다. 그 후 상등액을 제거하고, 각 웰에 100μl의 DMSO를 첨가하여 생성된 formazan crystal을 용해시켜 550nm 파장에서 ELISA 리더기로 흡광도를 측정하였다. 측정한 formazan 생성 정도는 정상적인 세포의 값과 비교하여 백분율(%)로 표시하였다.

황칠나무 잎 발효 추출물의 함량에 따른 RAW264.7 대식세포주의 NO 생성에 대한 억제효과 측정 결과, 동일 농도에서의 황칠나무 잎 발효 추출물의 함량이 증가함에 따라 NO 생성이 감소하는 것으로 나타났다(도 6a). 따라서 황칠나무 잎 발효 추출물의 농도에 비례하여 항염증 효능이 증가함을 알 수 있었다. 하지만, 고농도(0, 10배 희석)에서의 RAW264.7 대식세포주의 세포 생존율이 80% 미만임을 볼 때(도 6b), 고농도에서의 NO 생성 감소는 대식세포의 사멸에 의한 것으로 판단된다.

황칠나무 잎 발효 추출물 함량별 RAW264.7 대식세포주의 세포 생존율과 NO 생성물과의 관계를 종합적으로 볼 때, K2020-20%, K1785-20%의 조건에서 배양한 시료가 최적의 항염효과를 나타내는 것으로 확인되었다.

한편, 황칠나무 수액 발효 추출물의 함량에 따른 RAW264.7 대식세포주의 NO 생성 억제를 측정한 결과, 황칠나무 수액 발효 추출물의 농도에 비례하여 항염증 효능이 증가함을 나타났다(도 7a). 따라서, 황칠나무 수액 발효 추출물의 농도에 비례하여 항염증 효능이 증가함을 알 수 있었다. 또한, 고농도(0, 10배 희석)에서의 RAW264.7 대식세포주의 세포 생존율 또한 80% 이상을 나타내었다(도 7b).

따라서, 황칠나무 수액 발효 추출물의 RAW264.7 대식세포주의 세포 생존율과 NO 생성과의 관계를 종합적으로 보면, K2020-1%, K1785-1%, K2020-2%, K1785-2%의 조건에서 배양한 시료가 최적의 항염효과를 나타내는 것을 확인하였다.

실시예 5-2. 미백 효과 분석

황칠나무 잎 또는 수액 발효 추출물의 미백 효과를 확인하기 위하여, 쥐 유래 멜라닌 세포주 B16-F0에 대해 멜라닌 생성 억제능을 측정하였다.

쥐 유래 멜라닌 세포주 B16-F0 cell은 American Type Culture Collection (ATCC, USA)으로부터 분양 받았으며, 10% FBS와 1% antibiotics(penicillin/streptomycin)를 첨가한 DMEM 배지(ATCC, ATCC 30-2002, USA)를 이용하여 5% CO₂가 존재하는 37℃ 배양기에서 2 내지 3회 계대 배양한 후 사용하였다. B16-F0 세포를 6-웰 플레이트에 5 X 10⁵ cells/well이 되도록 분주하고, 5% CO₂배양기에서 20 내지 24시간 동안 예비 배양한 후 시료를 농도별로 처리하여 48 시간 배양하였다. 시료 처리와 함께 멜라닌 생성을 촉진시키기 위하여 1 μM α-Melanocyte stimulating hormone (Sigma-Aldrich, USA)와 100 μM 3-Isobutyl-1-methylxanthine (Sigma-Aldrich, USA)를 혼합시킨 DMEM 배지를 사용하였다. 그 후 상등액을 제거하고 따뜻한 PBS 솔루션을 각 웰 당 1,000μl씩 첨가한 후 10분간 37℃에서 배양하였다. 피펫팅(Pipeting)으로 6-웰 플레이트 표면에 붙어 있는 멜라노마 세포를 떼어내고 1.5 ml 튜브에 분주한 후 4℃로 유지된 원심분리기를 이용하여 13,000 rpm, 10분간 원심분리 하였다. 원심분리 후, 상등액을 조심스럽게 제거하고 lysis solution (1.0 N NaOH : Dimethyl sulfoxide = 9 : 1) 150μl를 넣어 멜라닌을 녹였다. 오븐에서 60℃ 조건하에 1시간 반응시킨 후, 96-웰 플레이트에 각 웰 당 100 μl씩 분주하여 ELISA 리더기(405 nm)로 광학 밀도를 측정하였다.

대조군으로는 시료와 반응하지 않은 멜라노마 세포에서의 광학 밀도를 사용하였다. 또한, 음성 대조군으로는 타이로시네이즈 생성 억제를 통한 멜라닌 억제능을 가지는 250μM arbutin (Sigma-Aldrich, USA)를 사용하였다.

아울러, B16-F0 세포의 시료에 대한 세포 생존율을 측정하기 위해 MTT assay를 실시하였다. B16-F0 세포를 24-웰 플레이트에 5 X 10⁵ cells/well이 되도록 분주하고, 5% CO₂배양기에서 20 내지 24시간 동안 예비 배양한 후 시료를 농도별로 처리하여 48시간 배양하였다. 그 후, PBS에 녹인 MTT (5 mg/ml) 용액 100μl를 각 웰에 넣고 배양기에서 4시간 동안 반응시켰다. 그 후 상등액을 제거하고, 각 웰에 500μl의 DMSO를 첨가하여 생성된 formazan crystal을 용해시켜 550nm 파장에서 ELISA 리더기로 흡광도를 측정하였다. 측정한 formazan 생성정도는 정상적인 세포의 값과 비교하여 백분율(%)로 표시하였다.

황칠나무 잎 발효 추출물의 미백 효능을 측정한 결과, 함량별 큰 차이는 없었지만 K2020-20%, K1785-20%, K2020-30%, K1785-30%가 대조군 대비 효과가 높게 나타났다(도 8a). 항염증 활성 측정 결과에서 나타난 것과 같이 추출물 30% 이상의 경우 세포 독성이 증가하였으므로 20% 발효 추출물이 적정 함량인 것으로 확인되었다.

또한, 황칠나무 수액 발효 추출물의 미백 효능을 측정한 결과, 황칠나무 수액 발효 추출물 (2%)에서의 미백 효능이 우수하지만, 연구에 사용한 멜라노마 세포의 사멸을 확인할 수 있었으므로 K2020-1%, K1785-1%가 적절한 것으로 확인되었다(도 8b).

한편, 황칠나무 잎 발효 추출물의 미백 효능 평가 결과, 각각의 균주를 이용한 발효 추출물에서 공통적으로 황칠나무 잎 추출물의 농도가 증가함에 비례하여 멜라닌 생성 억제능을 보였다(도 9a). 그 중, 동일한 농도에서 비교 시 K2020을 이용한 황칠나무 잎 발효 추출물보다 K1785를 이용한 황칠나무 잎 발효 추출물에서 멜라닌 생성 억제능이 약 10 내지 15% 정도 높은 것으로 나타났다. 이는 K2020 균주를 이용하여 발효하는 경우, pH가 더 낮아 멜라닌 세포의 사멸을 유발하기 때문으로 사료된다. K1785를 이용한 황칠나무 수액 발효 추출물의 세포 독성 또한 K2020보다 안전함을 보였다(도 9b).

황칠나무 수액 발효 추출물의 미백 효능 평가 결과, 각각의 균주를 이용한 발효 추출물에서 공통적으로 황칠나무 수액 발효 추출물의 희석 배수에 비례하여 멜라닌 생성 억제능이 증가함을 보였다(도 10a). 그 중, K2020보다 K1785에서의 멜라닌 억제능이 높음을 알 수 있는데, 이는 K1785를 발효에 사용하는 것이 적절하다는 것을 의미한다. 또한, K1785를 이용한 황칠나무 수액 발효 추출물의 세포 독성이 K2020보다 안전한 것으로 판단된다(도 10b).

제형예 　1. 유연화장수

유연화장수의 제형예는 통상의 방법에 따라 다음 표 3과 같이 제조하였다.

성분	함량( 단위:중량% )
황칠나무　잎(또는 수액) 발효 추출물 글리세린 1.3-부틸렌글리콜 PEG 1500 알란토인 DL-판테놀 이.디.티.에이-2NA 벤조페논-9 소듐 히아루로네이트 에탄올 옥틱도데세스-16 폴리솔베이트 20 방부제, 향, 색소 증류수	3.0(또는 1.0) 5.0 3.0 1.0 0.1 0.3 0.02 0.04 5.0 10.0 0.2 0.1 미량 잔량
합계	100

제형예 　2. 에센스

에센스의 제형예는 통상의 방법에 따라 다음 표 4와 같이 제조하였다.

성분	함량( 단위:중량% )
황칠나무　잎(또는 수액) 발효 추출물 글리세린 베타인 피이지 1500 알란토인 DL-판테놀 이.디.티.에이-2Na 벤조페논 - 9 히드록시에칠 셀룰로오스 소듐히아루로네이트 카르복시비닐폴리머 트리에탄올아민 옥틸도데칸올 옥틸도데세스 -16 에탄올 방부제, 향, 색소 증류수	5.0(또는 1.0) 10.0 5.0 2.0 0.1 0.3 0.02 0.04 0.1 8.0 0.2 0.18 0.3 0.4 6.0 미량 잔량
합계	100

제형예 　3. 팩

팩의 제형예는 통상의 방법에 따라 다음 표 5와 같이 제조하였다.

성 분	함량(단위:중량%)
황칠나무　잎(또는 수액) 발효 추출물 폴리비닐알콜 셀룰로오스 검 글리세린 피이지1500 사이크로데스트린 DL - 판테놀 알란토인 글리시리진산모노암모늄 니코틴아미드 에탄올 피이지 40 경화피마자유 향, 색소, 방부제 증류수	3.0(또는 1.0) 15.0 0.15 3.0 2.0 0.15 0.4 0.1 0.3 0.5 6.0 0.3 미량 잔량
합계	100

이상 본 발명의 실시예에서는 황칠나무 잎 추출물 또는 수액을 발효 시 Lactobacillus plantarum 균주를 사용하며, 발효 중에는 대사 산물로 젖산이 생성되므로 pH가 낮아짐을 확인하였다. 또한 발효 균주의 대사 작용이 배양 2일 때 가장 활발할 것으로 사료되어 배양 시간을 2일로 설정하였으며, 황칠나무 잎 발효 추출물의 경우, 원액 또는 10배 희석하여 사용하였을 때 세포 생존율이 80% 미만이므로 화장품 원료로 사용 시 적절한 희석 배수가 요구된다는 것을 확인하였다. 또한, 황칠나무 수액 발효 추출물의 경우 고농도에서의 세포 생존율이 80% 이상이므로 화장품 원료로 사용하기에 안전하다고 판단된다.

또한, 황칠나무 잎 발효 추출물의 함량이 증가함에 따라 세포 독성이 나타남을 알 수 있으므로 화장품 원료로 사용 시 20 wt% 미만의 함량으로 사용하기를 권장된다. 황칠나무 수액 발효 추출물의 함량이 1 wt% 이상이 될 경우, 미백 효능은 우수하지만 멜라노마 세포에서의 세포 독성이 강해지는 것을 확인하였으므로 황칠나무 수액 발효 추출물을 화장품 원료로 사용 시 1 wt% 미만의 함량범위에서 사용되는 것이 권장된다.

결론적으로, 본 연구를 통하여 2종의 새로운 Lactobacillus plantarum 균주 K2020과 K1785를 이용하여 황칠나무 잎 발효 추출물 및 수액 발효 추출물 제조를 위한 최적 공정을 확립하였으며, 발효액의 피부활성 관련 효능(항염, 미백)을 확인하여 화장품 원료로 사용할 수 있는 데이터를 확보하였다.

국립농업과학원 농업유전자원센터

KACC92132P,KACC92131P

20160630

Claims

삭제
삭제
삭제
삭제
황칠나무(Dendropanax morbifera) 수액을 수탁번호 KACC92131P로 표시되는 Lactobacillus plantarum ilchiwhangcil1785균으로 발효시킨 황칠나무 발효 추출물을 0.001 중량% 이상 내지 1 중량% 미만으로 함유하는 항염증 또는 미백 효과를 갖는 기능성　화장료 조성물.
제5 항의 기능성　화장료 조성물을 함유하는 항염증 또는 미백 효과를 갖는 기능성　화장품.
제6 항에 있어서,
상기 화장품은 화장수, 영양 크림, 아이 크림, 수분 크림, 로션, 팩, 에센스로부터 선택된 하나 이상의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 항염증 또는 미백효과를 갖는 기능성　화장품.
a) 황칠나무 수액을 준비하는 단계;
b) 상기 황칠나무 수액에 수탁번호 KACC92131P로 표시되는 Lactobacillus plantarum ilchiwhangcil1785균을 6 X 10⁸ 내지 8 X 10⁸ cfu/ml의 균수로 접종하고, 35℃ 내지 40℃의 온도 조건에서 42 내지 54 시간 동안 발효시키는 단계; 및
c) 상기 b)단계에서 얻어진 발효 추출물을 필터에 여과시키는 단계를 포함하는 항염증 또는 미백 효과를 갖는 황칠나무 발효 추출물의 제조 방법.
삭제
삭제
제8 항의 방법으로 제조된 황칠나무 발효 추출물을 포함하는 항염증 또는 미백 효과를 갖는 황칠나무 발효액.
삭제