KR101810410B1 - 버섯 균사체 및 청호밀 태좌의 혼합 배양 추출물의 제조방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 청호밀 태좌를 버섯 균사체와 혼합 배양한 후 추출하여 우수한 피부 개선 활성을 갖는 추출물을 제조하고, 이를 화장료로 이용하는 용도에 관한 것으로, 이러한 혼합 배양 추출물은 단순히 버섯 균사체 추출물 및 청호밀 태좌 추출물의 혼합물, 또는 호밀을 발아시킨 후 제조한 종래의 호밀 태좌 추출물에 비하여 현저히 우수한 항노화, 피부 보습, 피부 주름 및 탄력 개선 및 피부세포 재생활성을 나타낼 수 있다.

Description

버섯 균사체 및 청호밀 태좌의 혼합 배양 추출물의 제조방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물{Method for Preparing Extracts of Mixed Culture of Green Rye Placenta and Mushroom Mycelium and Cosmetic Composition Containing the Same}

본 발명은 버섯 균사체 및 청호밀 태좌의 혼합 배양 추출물의 제조방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 청호밀 태좌를 버섯 균사체와 함께 배양한 후 추출하여 우수한 피부 개선 활성을 갖는 추출물을 제조하고, 이를 화장료로 이용하는 용도에 관한 것이다.

인체의 피부는 표피, 진피 및 피하지방으로 이루어진 몸의 외피로서, 다양한 환경적인 요인에 대해 신체를 보호하는 물리적 장벽의 기능, 촉각 및 온도 조절 등의 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 피부의 방어 시스템은 외부로부터 자극이 가해지면 1차로 피지막, 2차적으로 각질층, 그리고 심한 경우에는 진피의 콜라겐 섬유가 방어하는 방식으로 작용한다.

그러나, 많은 스트레스, 환경오염 및 자외선 량의 증가로 인하여 인체 피부는 지속적인 변화를 겪게 되는데, 가장 대표적인 변화가 노화에 의한 피부 기능 저하 및 시각적 아름다움의 감소이다. 피부 노화에 의한 피부 외관의 변화로서 주름 발생, 피부 탄력 저하, 노인성 반점 형성 등을 예시할 수 있는 바, 이러한 피부 노화는 자연히 발생하는 내인성 노화, 그리고 외부 요인에 의하여 발생하는 외인성 노화로 구분된다.

내인성 노화는 주로 유전적인 요인에 의하여 발생하며, 피부 세포 및 조직의 구조 및 변화를 결정한다. 반면, 외인성 노화는 외부에서 유래된 요인으로부터 기인하는 바, 영양부족, 햇빛, 환경오염 등이 대표적인 예이며, 예방 및 회피 가능한 요인에 해당된다. 이처럼, 다양한 요인으로 인한 피부 노화의 진행에 따라 피부 건조, 주름 생성, 색소 침착, 수분 부족 현상 등이 일어나는 바, 자외선, 스트레스, 질병 상태 등에 따른 활성산소종이 생체 내 항산화 방어막을 파괴하고, 세포 및 조직을 손상시켜 노화를 촉진하게 된다. 특히, 단백질의 산화로 인하여 피부의 결합조직인 콜라겐, 히알루론산, 엘라스틴, 프로테오글라이칸, 피브로넥틴 등이 절단되어 심한 과다 염증 반응 및 피부 탄력의 저하를 유발하고, 더 나아가 DNA의 변이에 의하여 돌연변이, 암의 유발, 면역기능 저하를 일으킨다.

따라서, 피부 미용에 대한 관심이 높아지며 특히 피부 노화에 대한 관심과 노화를 늦추기 위한 다양한 시도가 이루어지고 있다.

피부 주름의 시작은 진피의 노화에서부터 진행되고 탄력섬유인 엘라스틴의 구조가 변화되어 피부는 늘어지면서 주름이 생기며, 진피의 콜라겐 및 다른 결합조직 성분을 분해시키는 MMPs(matrix metalloproteinase) 활성 증가로 인하여 콜라겐 합성이 저해되어 주름이 증가한다는 연구 결과도 보고된 바 있다. 또한, 피부 세포를 재생하거나, 피부를 구성하는 기질 성분을 증가시킴으로써 피부를 두껍게 하고, 콜라겐을 분해하는 MMPs의 생합성을 억제할 수 있는 물질 등이 주름, 탄력 감소, 색소 침착 및 수분 부족 현상 등의 피부 증상을 완화시키는 연구도 발표되었다.

현재, 피부 노화 억제를 위하여, 수퍼옥사이드 디스뮤타아제(superoxide dismutase), 카탈라아제(catalase) 등의 효소, α-토코페롤(α-tocopherol, vitamin E), β-카로틴(β-carotene), 아스코르빈산(ascorbic acid, vitamin C) 및 글루타티온(glutathione)과 같은 지용성 및 수용성 항산화제, 라디칼 소거제 등이 사용되고 있다. 상술한 성분들은 주로 피부 노화에 따른 주름 형성의 억제 효과를 갖는 반면, 최근 항노화 물질로 각광받는 비타민 A, 알파 하이드록시산 등은 진피 내 콜라겐 합성 증진을 통하여 생성된 주름을 완화시키는 치유 효과가 있다.

그러나, 전술한 성분들은 화장료와 배합할 경우, 안정성 및 피부 안전성 등에 있어서 문제점을 유발하는 등의 한계를 갖고 있다. 따라서, 최근에는 천연물질에 대한 관심이 증가하는 추세에 따라 보습력 및 노화 개선 기능, 우수한 피부 노화 개선 효과를 갖는 천연물을 이용하여 화장료 용도에 적용하고자 하는 연구가 이루어지고 있다. 특히, 천연 성분은 화학물질로부터 기인하는 부작용을 최소화하면서도 항산화, 주름완화, 미백, 가려움 완화 등의 효과를 제공할 수 있다.

이와 관련하여, 버섯은 각종 영양원이 함유된 유기물에서 영양물질을 흡수하여 이용하기 때문에 버섯에 함유된 성분의 종류 역시 다양할 뿐만 아니라, 대부분이 다당체로 이루어져 있다. 이러한 다당체는 독성물질 그리고 중금속 등으로부터 보호막의 역할을 하며, 건조지역에서 수분을 유지시키는 역할을 한다. 특히, 버섯 내에 함유된 생리활성 성분은 피부 고유의 기능을 유지하고 피부세포를 활성화시켜 피부 노화를 억제할 뿐만 아니라, 보습, 멜라닌 생성 억제 및 자외선 차단에 의한 미백 효과가 우수한 것으로 알려져 있다. 또한, 버섯 균사체는 자실체(버섯)에 영양분을 공급하며, 다량의 생리활성 성분을 함유하고 있어 잠재적인 피부 개선 효과를 갖고 있다. 상기의 점을 고려하여, 동충하초(국내특허번호 제340185호), 상황버섯(국내특허번호 제681703호), 표고버섯(국내특허번호 제1266528호) 등과 같은 각종 버섯류로부터 수득된 추출물을 화장료 제조에 활용하고 있다.

한편, 식물의 태좌는 동물 유래의 태반과 같이, 종자 육성을 주관하는 중요한 부위로 암술의 씨방 안에서 밑씨가 붙는 부위로서, 식물 세포를 성장하게 하는 생리활성 성분을 지칭하기도 한다. 이러한 식물의 태좌는 동물성 태반의 대체 원료로 개발되고 있는 바, 이는 동물성 태반의 경우에는 질병 감염, 피부자극 및/또는 알레르기 현상을 유발할 수 있으나, 식물의 태좌는 안전하고 상대적으로 저렴한 장점이 있기 때문이다. 이와 관련하여, 국내특허공개번호 제2014-11583호에는 대두로부터 분리된 태좌 조직의 배양물 또는 그 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물을, 그리고 국내특허공개번호 제2015-7464호는 검정콩, 줄무늬콩, 완두, 녹두 등의 두류 태좌 세포 배양물 또는 그 추출물을 함유하는 피부개선용 화장료 조성물을 개시하고 있다.

상술한 바와 같이, 버섯, 식물의 태좌 등을 개별적으로 이용하되, 이의 추출물, 배양물 등을 화장료 분야에 적용한 다수의 기술이 공지되어 있으나, 이러한 천연 성분마다 피부 개선 효능 및 적용 상에 한계가 있기 때문에 보다 개선된 기술에 대한 요구가 존재한다.

본 발명자는 다양한 천연 원료에 대하여 지속적인 연구를 수행한 결과, 청호밀(green rye)의 태좌를 분리 후, 이를 버섯 균사체와 함께 배양하고(즉, 혼합 배양하고), 이로부터 수득된 추출물이 현저히 강화된 피부 개선 활성(항노화, 피부 보습, 피부 탄력성 증가 및 피부세포 재생 효과)을 나타냄을 발견하였다.

따라서, 본 발명에서는 종래에 알려진 천연 원료 또는 이의 추출물에 비하여 한층 강화된 피부 개선 효과를 제공하는 천연 활성 추출물을 제조하는 방법을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 전술한 방법에 따라 수득된 천연 활성 추출물을 함유하는 화장료 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명의 일 구체예에 따르면,

a) 상황버섯, 치마버섯, 느타리버섯, 표고버섯, 영지버섯 및 동충하초로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 버섯을 균주로 하여 PDA(Potato Dextrose Agar) 평판 배지에서 계대 배양하면서 20 내지 35 ℃의 온도에서 5 내지 21일 동안 배양함으로써 버섯 균사체를 제조하는 단계;

b) 청호밀 씨방으로부터 분리된 태좌 조직을 상기 배양된 버섯 균사체와 혼합하여 25 내지 30 ℃의 온도에서 5 내지 20일 동안 배양하는 단계;

c) 상기 배양된 버섯 균사체 및 청호밀 태좌의 혼합물을 회수하는 단계; 및

d) 회수된 혼합물을 추출하는 단계;

를 포함하는 버섯 균사체 및 청호밀 태좌의 혼합 추출물을 제조하는 방법이 제공된다.

예시적 구체예에 따르면, 상기 단계 d)는,

상기 배양된 버섯 균사체와 청호밀 태좌의 혼합물에 중량 기준으로 5 내지 10배의 추출 용매를 첨가하여 수행될 수 있는 바, 이때 추출 용매는 물, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜 및 프로필렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다.

예시적 구체예에 따르면, 추출 용매로서 1,3-부틸렌글리콜 및 물의 혼합 용매를 사용할 수 있으며, 이때 1,3-부틸렌글리콜 및 물의 혼합 비(w/w)는 1 내지 5 : 9 내지 5의 범위일 수 있다.

예시적 구체예에 따르면, 상기 단계 d)는 배양된 버섯 균사체와 청호밀 태좌의 혼합물에 추출 용매를 첨가하고, 2 내지 5일 동안 침적하면서 냉각 콘덴서가 구비된 추출기를 이용하여 80 내지 100 ℃에서 8 내지 10시간 동안 끓여서 추출한 다음, 이를 여과하는 단계를 포함할 수 있다.

예시적 구체예에 따르면, 상기 버섯은 표고버섯일 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에 따르면, 상기 제조 방법에 의하여 제조된 버섯균사체 및 청호밀 태좌의 혼합 배양 추출물을 화장료 조성물의 전체 중량에 대하여 0.1 내지 10 중량%로 함유하는 화장료 조성물이 제공된다.

상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 또는 스프레이 형태의 제형을 가질 수 있다.

본 발명에 따라 제조되는 버섯균사체 및 청호밀 태좌의 혼합 배양 추출물은 항노화, 피부 보습, 피부 주름 및 탄력 개선 및 피부세포 재생효과가 우수하기 때문에, 이를 노화 방지 및 피부 개선에 효과적인 화장료를 제조하는데 유용하게 적용할 수 있다.

본 발명은 하기의 설명에 의하여 모두 달성될 수 있다. 하기의 설명은 본 발명의 바람직한 구체예를 기술하는 것으로 이해되어야 하며, 본 발명이 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 첨부된 도면은 이해를 돕기 위한 것으로, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에 있어서, 어떠한 구성 성분 또는 단계를 "포함"한다고 할 때, 이는 별도의 언급이 없는 한, 다른 구성 성분 및/또는 단계를 더 포함할 수 있음을 의미한다.

"계대 배양"은, 일반적으로 세포 또는 조직을 건강한 상태로 지속적으로 장기간 배양하기 위하여 주기적으로 세포 또는 조직의 일부를 새로운 배양 용기에 옮긴 후, 배양 배지를 교대해주면서 세포의 세대를 계속 이어 배양하는 방법을 의미할 수 있다. 한정된 공간을 갖는 배양용기 내에서 세포 수가 증가하면서 일정 시간이 경과하면 증식 영양분이 소비되거나 오염 물질이 축적되어 세포가 사멸하게 되므로, 건강한 세포의 수를 증가시키기 위한 방법으로 사용되며, 통상적으로 1회에 걸쳐 배지(배양 용기)를 교체하거나, 또는 세포군을 분할하여 배양하는 것을 1 계대라고 한다.

"버섯"은 고등균류의 일종인 담자균류에 속하며, 그 생물학적 위치는 곰팡이류에 속한다. 버섯은 포자가 발아하여 균사체(Mycelium)를 형성하고, 자실체(fruit body)로 성장하여 버섯의 모습을 갖추며, 또한 자실체는 다시 포자를 형성하는 생장과정을 되풀이한다.

"태좌(Placenta)"는 동물 유래의 태반과 같이, 종자 육성을 주관하는 중요한 부위로, 암술의 씨방 또는 자방(Ovary) 내에서 밑씨가 붙는 부분이다. 보통 씨방을 형성하는 심피(carpel)의 가장자리에 위치하는데, 때로는 심피의 중맥에도 위치한다. 또한, 씨방의 기저나, 기저로부터 씨방 안에 직립하는 기둥 모양으로 형성되는 경우도 있다.

"호밀"은 Triticeae과의 일년생 동작물(冬作物)로서 척박한 토양 조건 하에서도 양호한 생장 특성을 나타낼 수 있고, 더욱이 다른 작물을 생육하는데 부적합한 사질 토양에서도 경작이 가능한 작물이다. 호밀은 과거 유럽국가에서 열량, 단백질 및 탄수화물의 가장 중요한 공급원이었으며, 호밀의 배아는 다음 세대의 식물체를 구성하는 성분으로서 종자 중 약 2% 정도를 차지하나, 단백질, 지방질, 무기질, 비타민 등을 다량으로 함유하고 있어 영양가가 높다. 호밀은 청예, 건초, 사일레지, 방목, 녹비 등 여러 목적으로 활용되고 있으나, 주로 논에서는 벼와의 작부체계로, 밭에서는 옥수수와의 작부체계로, 가을에 파종하고 이른 봄(구체적으로 4월말에서 5월초)에 수확하여 청예 및 사일레지용으로 이용되고 있다.

"청호밀(green rye)"은 미성숙하여 녹색을 띄는 호밀을 의미할 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명은 단순히 버섯 추출물(또는 버섯 균사체의 추출물) 및 식물의 태좌 추출물을 각각 단독으로 사용하거나, 또는 이를 혼합하여 사용하기 보다는 배양 단계에서 특정 버섯 균사체를 특정 식물(즉, 청호밀)의 태좌와 조합하고, 이를 혼합 배양하는 단계를 수반한다. 이와 같이 버섯 균사체와 청호밀의 태좌를 혼합 배양하여 추출할 경우, 버섯 균사체의 추출물 및 청호밀 태좌의 추출물 각각은 물론, 버섯 균사체의 추출물과 청호밀 태좌 추출물의 혼합물(또는 조합물)에 비하여 월등히 개선된 피부 노화 억제 및 피부 개선 효과를 나타내는 예상치 못한 발견에 기초한다.

버섯 균사체의 제조

본 발명의 일 구체예에 있어서, 먼저 버섯을 선정하고, 이를 균주로 하여 버섯 균사체를 수득한다.

이와 관련하여, 버섯은 상황버섯, 치마버섯, 느타리버섯, 표고버섯, 영지버섯 및 동충하초로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

"상황버섯(Phellinuslinteus)"은 분류학적으로 소나무 비늘버섯(Hymenochaetaceae) 및 진흙버섯속(Phellinus)에 속하는 백색부후균으로서, 목질진흙버섯이라고도 하며, 동의보감에서는 상목이(桑木耳)라고도 한다. 상황버섯은 임파선 질환과 유방암 계통의 질환에 쓰였다는 기록이 있으며, 신농본초경과 본초강목, 봉황록에도 다양한 질환, 특히 소화기계 질환의 치료에 적용된 바 있다. 또한, 상황버섯은 항암효과가 뛰어난 것으로 알려져 있으며, 국내에서 대량으로 재배하고 있다. 특히, 약용으로 적용하기 위하여 달일 경우에는 노란색 또는 연한 노란색을 띄며, 풍미가 없는 것이 특징이다.

"치마버섯(Schizophyllum commune)"은 치마버섯과에 속하며, 봄부터 가을에 걸쳐 활엽수 및 침엽수의 고목, 나무토막, 용재, 그루터기 등에 속생하는 백색 목재 부후균이다. 치마버섯의 갓은 직경 1 내지 3 ㎝의 부채형 또는 조개형으로, 표면에 백색 또는 회색의 털이 조밀하게 나있으며 갓 둘레가 불규칙하게 갈라져 있다. 치마버섯은 대가 거의 없이 갓의 일부가 기주에 붙어 있고, 포자는 원통형이며, 포자문은 백색이다. 또한, 치마버섯이 생장된 부위에는 표고버섯 등의 버섯균이 생장하지 못하고, 피해 부위 전체가 엷은 흑갈색으로 착색되는 것으로 알려져 있다.

"느타리버섯(Pleurotus ostreatus)"은 느타리과에 속하며 활엽수의 고목에 군생하는데, 일반적으로는 봄부터 가을에 걸쳐서 활엽수의 그루터기나 마른 나무줄기에 발생하는 버섯이나, 드물게는 침엽수의 그루터기에도 발생한다. 느타리버섯은 국내를 비롯하여 전 세계적으로 분포하는 버섯으로서, 갓의 지름은 보통 5 내지 15 cm 정도이다. 느타리 버섯의 대는 길이 1 내지 4 cm, 굵기 1 내지 2 cm로서 갓에 대해 측생 또는 편심생이나 발생 방법에 따라서는 대가 없는 경우도 있다. 갓은 표면이 축축하며 색깔은 봉오리 무렵에는 흑회색이거나 청회색으로 일견하면 검게 보이지만 생장함에 따라서 암갈색으로 되고 마지막에는 황색이 된다. 갓의 살은 백색으로 부드러우며 버섯은 총생 또는 첩생 형태로 발생한다. 특히, 육질이 백색이고, 영양학적으로도 우수한 것으로 인정받고 있으며, 또한 혈액순환 촉진, 고혈압, 당뇨병에도 효과가 있으며 특히 항암효과 등의 약리 효과가 있는 것으로 보고되고 있다.

"표고버섯(Lentinus edodes)"은 담자균류(擔子菌類 Basidiomycetes)의 주름버섯목(―目 Agaricales) 느타리버섯과(―科 Pleurotaceae) 잣버섯속(―屬 Lentinus)에 속하는 버섯으로서, 넓은잎나무, 구체적으로, 밤나무, 졸참나무 또는 상수리나무 등의 마른나무에 자생하는 버섯이며, 균저는 지름 10cm로 납작한 반구형이나 생장하면 점점 편평하게 펼쳐지고 표면은 흑갈색으로 불규칙하게 갈라진 금이 있고 뒷면에는 많은 주름이 있다. 콜레스테롤의 수치를 내리고, 혈압을 낮추는 작용을 나타내므로, 고혈압 및 동맥경화의 예방에 유효한 것으로 알려져 있다. 이러한 표고버섯의 향기 성분은 레티오닌의 분해에 의하여 나타난다.

"영지버섯(Ganoderma lucidum)"은 담자균류의 다공균과에 속하는 버섯의 일종으로 그 자실체는 동양에서 효능이 탁월함이 인정되어 널리 약재로 사용되어 왔다. 특히, 영지 버섯의 추출물에 면역기능을 조절하고 항암 효과 및 임파구 생성 자극 효과가 있는 성분이 함유되어 있음이 보고된 바 있는 바, 영지버섯 성분 중 약리작용을 나타내는 중요한 성분들 및 면역기능에 유용한 생리활성을 갖는 물질로서 주로 트리터펜 계열과 다당체들이 이에 속하는 것으로 알려져 있다.

"동충하초"는 동절기에 곤충의 몸에 들어가 월동을 하면서 양분을 흡수하여 곤충을 죽게 하고 여름철이 되면 죽은 곤충의 몸에서 풀(버섯)을 형성하는 것에 따라 명명된 일종의 버섯이다. 동충하초속 버섯 균주는 분류학적으로 자낭균문(Ascomycota), 핵균강(Pyrenomycetes), 육자균목(Clavicipitaceae), 동충하초속(Codyceps)에 속하며 한국을 비롯한 중국, 일본 등 전 세계적으로 100 속 300여 종이 알려졌다. 이중, 밀리타리스 동충하초는 주로 나비목(Lepidoptera)의 유충 또는 번데기를 기주로 하여, 주황색의 곤봉형자좌를 형성하는 곤충기생균(Entomopathogenic fungi)의 일종이며, 자낭각은 반돌출형이며 원통형의 자낭안에 실모양의 자낭포자들이 존재한다. 동충하초는 생리 활성 성분인 코디세핀을 비롯하여, D-만니톨(D-mannitol), 퀴닉산(quinic acid) 등과 함께 다량의 다당체를 함유하고 있으며, 각종 아미노산 함량 또한 높은 것으로 알려져 있다.

예시적 구체예에 따르면, 상기 버섯으로 영지버섯, 표고버섯 및/또는 치마버섯을 사용할 수 있으며, 보다 구체적으로는 표고버섯을 사용할 수 있다.

일반적으로, 버섯 균사체는 자실체(버섯)에 영양분을 공급하여 자실체를 성장시키는 에너지를 보유하고 있다. 또한, 강한 활성 성분을 함유하고 있기 때문에 다량의 유효 성분을 함유하고 있는데, 균사체에는 자실체보다 각종 영양소가 약 4배 정도 더 함유되어 있고, 단백질, 아미노산, 비타민, 무기질, 효소 등 영양이 풍부하고, 또한 균사체는 우수한 흡수력 및 번식력을 갖고 있는 바, 이로 인하여 버섯 식용부분 보다 훨씬 많은 에너지를 보유하고 있다. 따라서, 버섯의 에너지의 핵심은 균사체에 있다고 볼 수 있다.

본 발명에 따르면, PDA(Potato Dextrose Agar) 배지에서 계대 배양하면서 버섯의 균사체를 제조한다. PDA 배지는 전형적으로 감자추출물 4 g/ℓ, 덱스트로오스 20 g/ℓ, 아가 15 g/ℓ 및 증류수 961 ㎖로 이루어질 수 있다. 이때, 배양 조건은, 예를 들면 약 20 내지 35 ℃, 구체적으로 약 25 내지 32 ℃, 보다 구체적으로 약 27 내지 30 ℃의 온도로 설정할 수 있다. 또한, 배양 기간은, 예를 들면 약 5 내지 21일, 구체적으로 약 7 내지 18일, 보다 구체적으로 약 10 내지 15일 범위일 수 있다. 상술한 조건 하에서 배양된 버섯 균사체는, 후술하는 바와 같이 청호밀의 태좌 조직과 함께 혼합 배양 시 청호밀의 태좌 조직과의 상호 작용을 통하여 피부 노화를 억제하고 피부를 개선하는 효과를 제공하는 유효 성분의 함량을 극대화할 수 있다는 점에서 특히 유리하다.

예시적 구체예에 따르면, 상기와 같이 얻어진 상기 버섯 균사체를 후술하는 청호밀의 태좌 조직과의 혼합에 앞서, 접종용 칼로 절단하여 PDB(Potato Dextrose Broth) 배지에 접종하여 진탕 배양한다. 이와 관련하여, PDB 배지는 액체 배지로서, 이의 조성은 아가(Agar)를 함유하지 않은 것을 제외하고는 전술한 PDA 배지와 유사하다. 일 예로서, PDB 배지의 조성은, 예를 들면 글루코스 2%, 감자 20% 및 물 1L로 이루어질 수 있다. 상술한 바와 같이, 배양을 개시한 후, 약 3 내지 5일(구체적으로 약 4일 정도)이 경과하면, 블렌더(예를 들면 Waring blender)를 사용하여 균체를 약 0.5 내지 2초(구체적으로 1초) 단위로 약 3 내지 8회, 구체적으로 약 4 내지 6회(특히, 5회 정도) 처리하고, 이중 일부(예를 들면, 약 5 내지 20 mL, 구체적으로 약 7 내지 15 mL, 보다 구체적으로 약 9 내지 11 mL)를 다시 PDB(약 80 내지 150 mL, 구체적으로 약 90 내지 120 mL, 특히 구체적으로 약 100 mL 정도)에 접종할 수 있다.

청호밀 태좌 조직의 수득

본 발명에 따르면, 전술한 버섯 균사체를 제조하는 단계와 별도로 청호밀 씨방으로부터 분리된 태좌 조직을 수득하는 과정, 즉 청호밀로부터 태좌 조직을 분리하는 과정이 수행된다.

일반적으로 곡물은 성숙 시기에 따라 영양 성분의 유무 및 함량 면에서 변화하는 만큼, 청호밀의 태좌 조직의 활성성분의 함량 및 종류는 성숙한 호밀 및 성숙한 호밀을 발아시킨 발아 호밀의 태좌 조직과 구별될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명에서는 출수(出穗, heading) 후, 약 20 내지 35일, 보다 구체적으로 약 25 내지 30일이 경과한 청호밀의 씨방으로부터 분리된 태좌를 사용하는 것이 유리할 수 있다.

청호밀 태좌와 버섯 균사체의 혼합 배양

상기 분리된 청호밀의 태좌를 앞서 배양된 버섯 균사체와 혼합한다. 이때, 혼합 비는, 중량 기준으로, 예를 들면 약 3 내지 7 : 약 7 내지 3, 구체적으로 약 4 내지 6 : 약 6 내지 4, 보다 구체적으로 약 5 : 5일 수 있다. 만약, 청호밀 태좌와 버섯 균사체 중 어느 하나의 비율이 지나치게 낮거나 높은 경우에는 혼합 배양 시 상호 간에 미치는 유리한 영향이 감소되어 본 발명에서 의도하는 수준의 피부 노화 방지 효과 등을 달성하기 곤란할 수 있다. 따라서, 각각의 성분의 특성(예를 들면, 버섯 종류에 따른 활성 성분의 차이, 청호밀 수확 시기에 따른 활성 성분의 변화 등)을 고려하여 전술한 범위 내에서 적절히 조절할 수 있다.

상술한 바와 같이, 청호밀의 태좌 및 배양된 버섯 균사체를 혼합하여, 약 25 내지 30 ℃, 구체적으로 약 26 내지 27 ℃의 온도 조건에서, 약 5 내지 20일, 구체적으로 약 8 내지 15일 동안 배양한다. 본 발명이 특정 이론에 구속되는 것은 아니지만, 특히 버섯 균사체 및 청호밀 태좌가 혼합 배양될 경우, 이들 간의 상호 작용 또는 자극에 의하여 아미노산과 같은 유용 생리 활성 성분의 합성이 촉진되는 것으로 판단된다. 특히, 피부 개선 효과를 제공하는 콜라겐 발현 효과에 있어서, 보다 우수한 콜라겐 발현능을 나타낼 수 있고, 피부 탄력을 촉진하는 인자(예를 들면, tropoelastin)의 생성을 효과적으로 증진할 수 있는 반면, 주름 생성 인자, 구체적으로 MMPs(matrix metalloproteinase)의 발현은 억제할 수 있다. 이는 종래에 청호밀의 태좌 및 버섯 균사체 각각의 추출물을 단순 혼합할 경우와 대비할 때, 예상치 못한 개선 효과를 제공할 수 있다.

청호밀의 태좌 조직과 버섯 균사체의 혼합 배양물의 회수 및 추출

상술한 바와 같이, 청호밀의 태좌 조직과 버섯 균사체의 혼합물에 대한 배양이 완료되면, 이를 별도로 분리하여 회수한 다음, 회수된 혼합물에 대한 추출을 수행한다.

본 발명에 따르면, 추출 방식은 특별히 제한되지 않고 당업계에서 알려진 방식을 채택할 수 있는 바, 예를 들면 냉침 추출, 초음파 추출, 환류 추출, 열수 추출 등이 적용될 수 있다. 이와 달리, 추출 용매를 이용한 용매 추출을 적용할 수 있는 바, 구체적으로 물, 유기 용매, 또는 이의 혼합 용매를 사용하여 추출할 수 있다. 추출 용매에 따라 혼합 배양물 내 활성 성분에 대한 추출 및 손실에 있어서 상이할 수 있기 때문에 적합한 용매를 선정하는 것이 유리할 수 있다. 유기용매를 사용하여 추출하는 경우, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합용매를 사용할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 배양 후 얻어진 버섯 균사체 및 청호밀 태좌 혼합물을 회수하여, 중량 기준으로, 예를 들면 약 5 내지 10배, 구체적으로 약 6 내지 9 배, 보다 구체적으로 약 7 내지 8배의 용매로 추출할 수 있다. 예시적 구체예에 따르면, 추출 용매로서 1,3-부틸렌글리콜 및 물(정제수)의 혼합 용매를 사용할 수 있는 바, 이때 1,3-부틸렌글리콜 및 물의 혼합 비(w/w)는, 예를 들면 약 1 내지 5 : 9 내지 5, 구체적으로 약 2 내지 4 : 약 8 내지 6, 보다 구체적으로 약 3 내지 약 7의 범위일 수 있다 이와 같은 혼합 용매 조성은, 버섯 균사체 및 청호밀 태좌 혼합배양물 내에서 특히 증가된 피부 개선 성분을 최대한 추출하는 한편, 주름 생성 성분 등을 최소화하는데 특히 유용한 장점을 갖는다.

추출 단계에 있어서, 추출 온도는 당업자가 추출 방법에 적절한 다양한 온도 범위를 채택할 수 있으나, 천연물인 추출 대상에 함유된 유효 성분이 파괴되지 않거나 파괴를 최소화할 수 있는 조건 하에서 수행되는 것이 바람직하다. 예시적 구체예에 따르면, 추출 온도는, 예를 들면 약 15 내지 100 ℃, 구체적으로 약 20 내지 70 ℃, 보다 구체적으로는 25 내지 50 ℃ 범위일 수 있으나, 이는 예시적인 것으로 이해될 수 있다. 특정 구체예에서는 실온 조건 하에서 추출을 수행할 수 있다.

또한, 추출 시간은 추출 방식에 따라 상이할 수 있는 바, 예를 들면 약 1 시간 내지 수일의 범위에서 1회 또는 2회 이상 수행될 수 있다. 일 예로서, 혼합 배양물을 약 2 내지 5일 동안 별도의 가열 과정없이 침적시키고, 이후 약 4 내지 12 시간, 구체적으로 약 6 내지 10 시간, 보다 구체적으로 약 7 내지 8시간에 걸쳐 가열 또는 가열에 의한 비등 조건, 구체적으로 약 70 내지 100 ℃, 보다 구체적으로 약 80 내지 100 ℃의 온도 조건 하에서 추출할 수 있다. 이와 같이 추출 과정이 완료되면, 이를 여과하여 불순물을 제거한 액상 형태로 분리 및 수득하여 바로 사용하거나, 또는 농축 및/또는 건조하여 분말 형태로 수득할 수 있다.

특정 구체예에 따르면, 배양된 버섯 균사체와 청호밀 태좌의 혼합물에 추출 용매를 첨가하고, 약 2 내지 5일 동안 침적하면서 냉각 콘덴서가 구비된 추출기를 이용하여 약 80 내지 100 ℃에서 약 8 내지 10시간 동안 끓여서 추출한 다음, 이를 여과하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 1차 추출용매로 추출을 수행하여 얻어진 추출물은 통상의 방법에 따라 여과하여 불순물을 제거한 액상 형태로 얻거나, 얻어진 액상 형태의 추출물을 통상의 방법에 따라 감압농축하거나(즉, 추출물의 농축액 형태), 더 나아가 건조하여 분말 형태로 얻을 수 있다.

예시적으로, 여과 과정은 나일론 등의 필터를 이용하거나 냉동 여과법을 이용하여 수행될 수 있다. 또한, 다른 예시적 구체예에 따르면, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등과 같은 추가적인 정제 방법을 통해 얻어진 분획 형태로 수득할 수도 있다. 또한, 분말 형태로 건조시킬 경우, 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 건조 수단을 이용할 수도 있다. 이외에도, 이러한 추출물은 필요에 따라서는 후속적으로 희석 사용할 수도 있다

이와 같이, 상기 제조된 혼합 배양 추출물은 단순히 버섯 균사체 추출물 및 청호밀 태좌 추출물의 혼합물, 또는 호밀을 발아시킨 후 제조한 종래의 호밀 태좌 추출물에 비하여 현저히 우수한 항노화, 피부 보습, 피부 주름 및 탄력 개선 및 피부세포 재생활성을 나타낼 수 있다.

청호밀의 태좌 조직과 버섯 균사체의 혼합 배양물의 추출물을 이용한 화장료 조성물의 제조

본 발명의 다른 구체예에 따르면, 전술한 방법에 따라 제조된 버섯 균사체 및 청호밀 태좌의 혼합 배양 추출물을 이용하여 화장료 조성물을 제조할 수 있다. 이때, 화장료 조성물 내에서 추출물이 유효 성분으로 함유될 수 있는 바, 이는 피부 외용제 조성물로서 피부 장벽 강화 및 개선, 그리고 주름 발생 억제를 비롯하여 항노화에 따른 피부 개선 효과를 나타낼 수 있는 정도의 량으로 함유되는 것을 의미할 수 있다. 구체적으로, 피부 외용제로서 주름 발생 억제 효능과 관련된 콜라겐 합성, 엘라스틴 증가, 피부장벽 강화 효과, 피부 보습 효과 등을 발현할 수 있는 량을 함유할 수 있다.

이와 관련하여, 본 발명의 예시적 구체예에 따르면, 전술한 추출물은 유효 성분으로서 화장료 조성물의 전체 중량에 대하여 약 0.1 내지 10 중량%, 구체적으로 약 0.3 내지 5 중량%, 보다 구체적으로 약 0.5 내지 3 중량% 범위로 함유될 수 있다.

이러한 화장료 조성물은 당업계에 알려진 임의의 제형으로 제조될 수 있는 바, 예를 들면 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 또는 스프레이 형태의 제형일 수 있다. 구체적으로, 화장수, 크림, 에센스, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 바디 로션, 바디 오일, 바디 젤, 샴푸, 린스, 헤어 콘디셔너, 헤어 젤, 화운데이션, 립스틱, 마스카라, 팩마스크, 메이크업 베이스 등을 예시할 수 있다. 또한, 유효성분으로서 버섯 균사체 및 청호밀 태좌의 혼합 배양 추출물에 당업계에서 알려진 첨가 성분, 예를 들면 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 담체 등을 더 함유할 수 있다.

예를 들면, 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용될 수 있는 바, 구체적으로 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 및/또는 소르비탄의 지방산 에스테르를 사용할 수 있다.

또한, 전분, 트래거캔스 고무, 젤라틴, 당밀, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 에테르, 폴리비닐 피롤리돈, 히드록시프로필셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스 및 카르복시메틸셀룰로오스를 포함하는 바인더; 한천, 전분, 젤라틴 가루, 카르복시메틸 셀룰로오스나트륨, 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 결정 셀룰로오스, 탄산칼슘, 탄산수소나트륨 및 알긴산 나트륨을 포함하는 분쇄제; 스테아린산 마그네슘, 활석 및 수첨 식물유를 포함하는 윤활제; 및 착색제 등을 포함할 수 있다.

운반제로서 젖당, 글루코오스, 수크로오스, 만니톨, 감자녹말, 옥수수녹말, 탄산칼슘, 인산칼슘 및 셀룰로오스 등을 사용할 수 있다.

이외에도, 안정화제, 용해보조제, 경피흡수 촉진제 등의 보조제 방향제, 방부제 등의 첨가제를 더 함유할 수 있다.

예시적 구체예에 따르면, 전술한 첨가 성분은, 예를 들면 화장료 조성물을 기준으로, 예를 들면 약 20 중량%까지, 구체적으로 약 15 중량%까지 포함 가능하나, 이는 예시적인 의미로 이해될 수 있다. 예를 들면, 첨가 성분 중 담체로서 용매(구체적으로 물)를 사용하는 경우, 전체 화장료 조성물의 밸런스 성분을 형성할 수 있을 것이다.

본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 명확히 이해될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적에 불과하며 발명의 영역을 제한하고자 하는 것은 아니다.

제조예 1

청호밀 태좌조직 분리

출수 후 30일 경과한 청호밀의 씨방으로부터 태좌 조직을 나이프로 절단하고, 분리하였으며, 1㎝ × 1㎝ 크기로 준비하였다.

제조예 2 내지 4

버섯 균사체 제조

먼저, 표고버섯, 영지버섯 및 치마버섯을 균주로 하여 PDA(Potato Dextrose Agar; DIFCO사) 평판배지에 계대 배양하여 사용하였다. 표고버섯, 영지버섯 및 치마버섯 균사체를 PDA 배지에 약 25 ℃의 온도 조건 하에서 14일 동안 배양하였다. 배양된 버섯 균사체를 접종용 칼로 절단하고, PDB 배지(Potato Dextrose Broth; DIFCO사)에 접종하여 진탕 배양하였다.

배양 4일 후 Waring blender를 사용하여 각각의 균체를 1초씩 5회 처리하였고, 이중 10 mL를 다시 PDB 배지(100 mL)에 접종하여 버섯 균사체를 준비하였다.

실시예 1 내지 3

배양된 버섯 균사체 및 청호밀 태좌의 혼합 배양 및 이의 추출물 제조

상기 배양된 표고버섯, 영지버섯 및 치마버섯 균사체를 이용하여 청호밀 태좌 추출물을 제조하였다.

제조예 1에 따라 수득된 청호밀의 태좌 30 g을 각각의 버섯 균사체(30 g)와 혼합하였다. 그 다음, 상기 청호밀 태좌와 버섯 균사체의 혼합물을 약 27 ℃에서 14일 동안 배양하였다.

이후, 배향 혼합물을 1,3-부틸렌글리콜 및 정제수가 3 : 7(w/w)로 혼합된 혼합 용매 내에서 3일 동안 침적시켰고, 냉각 콘덴서가 구비된 추출기 내에서 100 ℃로 8시간 동안 끓여 추출하였다. 이후, 정성 여과지(Qualitative Filter Papers No. 2(포어 사이즈: 8 ㎛), Whatman)를 이용하여 여과한 후에 여액 상태로 수득하였다.

비교예 1 내지 4

버섯균사체 및 청호밀 태좌를 함께 배양하여 얻어진 혼합 배양물 대신, 하기 표 1과 같이 청호밀 태좌 및 버섯 균사체(표고버섯 균사체) 각각을 실시예 1과 동일한 방법으로 추출하여 추출물을 제조하였다(비교예 1 및 2). 또한, 상기 청호밀 태좌 추출물 및 버섯 균사체(표고버섯 균사체) 추출물의 혼합물을 제조하였다(비교예 3).

추출물	비교예 1	비교예 2	비교예 3
청호밀 태좌 추출물	60g	-	30g
표고버섯 균사체 추출물	-	60g	30g

이와 별도로, 시판 중인 발아 호밀 유래의 호밀 태좌 추출물(hydrolyzed rye placenta extract)를 구입하여 사용하였다(비교예 4).

시험예 1

유용성분(활성 성분)의 함량 평가

실시예 1에 따라 제조된 표고버섯 균사체 배양 청호밀 추출물, 비교예 1에 따른 청호밀 태좌 추출물, 비교예 2에 따른 표고버섯 균사체 추출물, 비교예 3에 다른 청호밀 태좌 추출물, 그리고 비교예 4에 따른 호밀 태좌 추출물 각각을 pH 2.2 희석 용액을 사용하여 총 20 ㎖로 정용하였다. 그 다음, 아미노산 분석기(Amino acid analyzer biochrom 30, Biochtom, UK)를 이용하여 각각에 대한 아미노산 성분 및 함량을 분석하였다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

유리 아미노산 성분 (㎍/g)	실시예 1	비교예 1	비교예 2	비교예 3	비교예 4
Aspㅉ	510.12	618.32	925.15	752.73	609.15
Gluㅂ	1305.26	1353.12	1103.45	1219.27	1295.10
세린(Serine)	484.34	320.79	402.41	382.15	307.26
글리신(Glycine)	1257.91	432.4	392.15	412.98	442.56
히스티딘(histidine)	187.42	152.14	241.25	205.36	162.48
아르기닌(Arginine)	405.58	145.28	512.54	351.26	139.89
트레오닌(Threonine)	419.62	310.48	510.25	409.50	329.41
알라닌(Alanine)	621.26	418.05	591.23	493.28	407.26
프롤린(Proline)	1262.46	957.64	445.15	691.06	972.34
발린(Valine)	342.33	429.11	751.29	592.19	462.81
메티오닌(Methionine)	54.10	50.12	92.45	90.83	56.48
이소루신(Isoleucine)	211.95	281.26	320.19	286.19	272.26
류신(Leusine)	392.67	459.45	424.12	468.75	468.15
페닐알라닌(Phenylalanine)	223.18	354.67	585.31	468.62	352.56
트립토판(Tryptophan)	194.64	241.08	-	216.84	256.08
리신(Lysine)	317.45	348.20	406.15	374.69	348.20
합계	8190.29	6821.99	7703.09	7415.7	6881.99
ㅉ아스파르트산과 아스파라긴 함량이 합산된 성분, ㅂ글루탐산과 글루타민 함량이 합산된 성분

상기 표에 따르면, 실시예 1에 따른 표고버섯 균사체 배양 청호밀 추출물은 비교예 1 내지 4(청호밀 태좌 추출물, 버섯균사체 추출물, 청호밀 태좌 추출물과 표고버섯 균사체 추출물의 혼합물, 및 발아 호밀 유래의 호밀 태좌 추출물)과 대비할 때, 총 아미노산 함량 면에서 월등히 높았다. 구체적으로, 실시예 1의 표고버섯 균사체 배양 청호밀 추출물은 비교예 4의 발아 호밀 유래의 호밀 태좌 추출물보다 프롤린(Proline), 글리신(Glycine), 세린(Serine), 아르기닌(Arginine), 트레오닌(Threonine), 및 알라닌(Alanine)의 함량 면에서, 특히 높음을 확인할 수 있다.

시험예 2

콜라겐 발현증가 평가

섬유아세포(Human Dermal fibroblasts adult)를 10% LSGS가 첨가된 Medium 106 배지를 이용하여 5×10⁵ cell/well로 조절한 후, 12 웰 플레이트(well plate)에 접종하여 18시간 동안 배양하였다.

배양 후, 실시예 1 및 비교예 1 내지 4 각각의 시료를 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포에서 RNA를 추출하여 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction)을 통하여 콜라겐(collagen)의 발현 증가율을 확인하였다. 콜라겐 발현율을 하기 수학식 1에 의하여 산출하였다.

[수학식 1]

콜라겐 발현율(%) = (시료의 콜라겐 발현량/양성 대조군 콜라겐 발현량) × 100

산출된 콜라겐의 발현율을 하기 표 3에 나타내었다. 대조군으로는 아데노신(Adenosine)을 사용하였다.

시료명	처리농도(w/v%)	콜라겐 발현율(%)
실시예 1	0.5	134.4
비교예 1	0.5	110.4
비교예 2	0.5	109.5
비교예 3	0.5	124.9
비교예 4	0.5	125.2
아데노신	0.05	130.5

상기 표에서 확인되는 바와 같이, 동일 농도 처리 시, 실시예 1에 따른 표고버섯균사체 배양 청호밀 추출물은 비교예 1 내지 4에 비하여 유의미한 수준으로 높은 콜라겐 발현효과를 나타내었다. 이는 아데노신과 대비하는 경우에도 명백히 개선된 정도에 해당하였다.

시험예 3

주름 생성 인자 발현 억제효과 평가

섬유아세포(Human Dermal fibroblasts adult)를 10% LSGS가 첨가된 Medium 106 배지를 이용하여 5×10⁵ cell/well로 조절한 후, 12 웰 플레이트(well plate)에 접종하고 18시간 동안 배양하였다.

배양 후, 실시예 1 및 비교예 1 내지 4 각각의 시료를 처리하고, 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포에서 RNA를 추출하여 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction)을 통해 MMP-1의 발현 억제율을 확인하였다. MMP-1 발현 억제율을 하기 수학식 2에 의하여 산출하였다.

[수학식 2]

MMP-1 발현 억제율(%)=100-[(시료 MMP-1 발현량/ 양성 대조군 MMP-1 발현량) × 100]

산출된 MMP-1 발현 억제율을 하기 표 4에 나타내었다. 대조군으로는 아데노신(Adenosine)을 사용하였다.

시료명	처리농도(w/v%)	MMP-1 발현 억제율(%)
실시예 1	0.5	75.1
비교예 1	0.5	73.8
비교예 2	0.5	75.6
비교예 3	0.5	65.8
비교예 4	0.5	72.5
아데노신	0.05	60.3

상기 표에 따르면, 동일 농도 처리 시, 실시예 1에 따른 표고버섯 균사체 배양 청호밀 태좌 추출물이 비교예 1 내지 4의 추출물과 비교하여 동등 이상의 MMP-1 발현 억제 효과를 나타내었다.

시험예 4

탄력 관련 인자 발현 증가 효과 평가

섬유아세포(Human Dermal fibroblasts adult)를 10% LSGS가 첨가된 Medium 106 배지를 이용하여 5×10⁵ cell/well로 조절한 후, 12 웰 플레이트(well plate)에 접종하고 18시간 동안 배양하였다.

배양 후, 실시예 1 및 비교예 1 내지 4 각각의 시료를 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포에서 RNA를 추출하여 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction)을 통해 tropoelastin의 발현 증가율을 확인하였다. 이때, tropoelastin 발현율을 하기 수학식 3에 의하여 산출하였다.

[수학식 3]

Tropoelastin 발현율(%)=(시료 tropoelastin 발현량/대조군 tropoelastin 발현량) × 100

산출된 tropoelastin 발현율을 하기 표 5에 나타내었다. 대조군으로는 아데노신(Adenosine)을 사용하였다.

시료명	처리농도(w/v%)	Tropoelastin 발현율(%)
실시예 1	0.5	142.2
비교예 1	0.5	125.4
비교예 2	0.5	130.1
비교예 3	0.5	134.9
비교예 4	0.5	140.8
아데노신	0.05	141.6

상기 표에서 확인되는 바와 같이, 동일 농도 처리 시, 실시예 1에 따른 버섯균사체 배양 청호밀 태좌 혼합추출물은 비교예 1 내지 4에 비하여 명백히 우수한 tropoelastin 발현 증가 효과를 나타내었으며, 대조군인 아데노신보다도 개선된 수준임을 알 수 있다.

시험예 5

보습 관련인자 발현증가 효과 평가

섬유아세포(Human Dermal fibroblasts adult)를 10% LSGS가 첨가된 Medium 106 배지를 이용하여 5×10⁵ cell/well로 조절한 후, 12 웰 플레이트(well plate)에 접종하고 18시간 동안 배양하였다.

배양 후, 시료를 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포에서 RNA를 추출하여 Reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)을 통하여 Hyaluronan Synthase-3 (HAS-3)의 발현 증가율을 확인하였다. HAS-3 발현 증가율을 하기 수학식 4에 의하여 산출하였다.

[수학식 4]

HAS-3 발현율(%)=(시료 HAS-3 발현량/대조군 HAS-3 발현량) × 100

산출된 HAS-3 발현 증가율을 하기 표 6에 나타내었다. 대조군으로는 히알루론산(Hyaluronic Acid)을 사용하였다.

시료명	처리농도(w/v%)	보습 효과(%)
실시예 1	0.1	162.9
비교예 1	0.1	144.5
비교예 2	0.1	139.2
비교예 3	0.1	155.8
비교예 4	0.1	151.2
Hyaluronic Acid(히아루론산)	0.05	164.2

상기 표에 따르면, 0.1%(wt/v) 농도에서 테스트된 시료 모두에서 보습 효과를 확인할 수 있었다. 특히, 실시예 1에서와 같이 버섯균사체 배양 청호밀 태좌 혼합추출물은 비교예 1 내지 4와 대비할 때, 가장 우수한 보습 효과를 나타냈을 뿐만 아니라, 히아루론산과 동등한 수준의 보습 효과를 나타냄을 알 수 있다.

시험예 6

피부세포 재생 효과 평가

버섯균사체 배양 청호밀 태좌 가수분해 추출물의 피부 재생 효과를 확인하기 위해 wound healing assay를 수행하였다. 각질형성세포(HACAT)를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 5ㅧ10⁵ cell/well로 조절한 후 6 웰 플레이트(well plate)에 접종하고 18시간 동안 배양하였다. 6 웰 플레이트(well plate)에 가득 자란 세포에 스크래치를 내어 세포의 일부분을 플레이트 바닥에서 떨어지게 한 다음, 실시예 1 및 비교예 1 내지 4 각각의 시료를 처리하여 18시간 동안 배양하였다. 세포가 재생된 정도를 확인하였고, 세포재생율을 하기 수학식 5에 의하여 산출하였다.

[수학식 5]

세포재생율(%) = (시료 세포 재생율/대조군 세포 재생율) × 100

산출된 세포재생율을 하기 표 7에 나타내었다. 대조군으로는 덱사메타손(Dexamethason)을 사용하였다.

시료명	처리농도(w/v%)	세포 재생율(%)
실시예 1	0.5	92.1
비교예 1	0.5	83.5
비교예 2	0.5	80.5
비교예 3	0.5	85.2
비교예 4	0.5	89.2
덱사메타손(Dexamethason)	0.5	81.0

상기 표에서 확인되는 바와 같이, 0.5%(wt/v) 농도에서 테스트된 실시예 1 및 비교예 1 내지 4 각각의 시료 모두에서 피부 세포 재생 효과를 확인할 수 있었다. 특히, 실시예 1에서 가장 우수한 피부 세포 재생 효과를 확인하였다.

실시예 4

버섯균사체 배양 청호밀 태좌 추출물을 함유하는 로션의 제조

실시예 1에서 제조된 버섯 균사체 배양 청호밀 태좌 추출물을 함유하는 로션을 하기 표 8에 따른 조성 및 함량으로 통상의 방법에 따라 제조하였다. 또한, 비교예에 따라 제조된 청호밀 태좌 추출물(비교예 1), 버섯균사체 추출물(비교예 2), 청호밀 태좌 추출물과 표고버섯 균사체 추출물의 혼합물(비교예 3), 및 발아 호밀 유래의 호밀 태좌 추출물(비교예 4) 각각을 이용하여 동일한 방법으로 하기 표 8에 나타낸 바와 같이 로션을 제조하였다.

(중량%)	대조예	비교예 5	비교예 6	비교예 7	비교예 8	실시예 4
비교예 1	-	0.5	-	-	-	-
비교예 2	-	-	0.5	-	-	-
비교예 3	-	-	-	0.5	-	-
비교예 4	-	-	-	-	0.5	-
실시예 1	-	-	-	-	-	0.5
밀납	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0
폴리솔베이트 60	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5
솔비탄 세스퀴올레이트	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
유동 파라핀	10.0	10.0	10.0	10.0	10.0	10.0
소르비탄 스테아레이트	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
친유형 모노스테아린산 글리세린	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
스테아린산	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5
글리세릴스테아레이트/ 피이지??400 스테아레이트	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0
프로필렌글리콜	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0
카르복시폴리머	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1
트리에탄올아민	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2
방부제	미량	미량	미량	미량	미량	미량
정제수	To 100	To 100	To 100	To 100	To 100	To 100

시험예 7

보습효과 평가

피부 보습에 대한 임상시험으로 피부 수분 측정기(Corneometer, Courage+Khazaka, GmbH, Germany)를 이용하여 피부전도도를 측정함으로써 피부 보습력을 평가하였다. 피부 수분 측정은 실내온도 20 내지 25 ℃, 상대습도 40 내지 55%로 유지시킨 항온항습 조건 하에서 피부수분 측정기를 이용하여 5명의 피검자에 대하여 팔 안쪽을 측정하였다. 보습력을 하기 수학식 6에 의하여 산출하였다.

[수학식 6]

보습력(%)=((시료 도포 후 측정값-시료 도포 전 측정값)/시료 도포 전 측정값) × 100

산출된 보습력을 하기 표 9에 나타내었다.

농도(%)	보습력(%)
	대조군	1.0%(wt/v)	2.0%(wt/v)	5.0%(wt/v)
실시예 4	100	125±1.2	141±1.5	157±2.5
비교예 5	100	104±1.0	109±1.4	121±2.1
비교예 6	100	112±1.5	120±1.1	125±1.6
비교예 7	100	115±1.1	119±1.8	127±2.1
비교예 8	100	119±2.1	135±1.1	137±0.9

상기 표에 나타낸 바와 같이, 동일 농도 처리 시 실시예 4에 따른 제형이 비교예 5 내지 8에 따른 제형과 대비할 때, 유의미한 수준으로 개선된 보습 효과를 나타냄을 확인할 수 있다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따라 제조된 버섯균사체와 청호밀 태좌의 혼합 배양 추출물은 배양 과정에서 상호 작용에 의하여 피부 개선을 위한 유용성분의 함량이 현저히 증가하였음을 확인하였다(시험예 1). 또한, 콜라겐 발현증가 효과(시험예 2), 주름 생성 인자 발현 억제 효과(시험예 3), 탄력 관련 인자 발현 증가 효과(시험예 4), 보습 관련인자 발현증가효과(시험예 5), 피부세포 재생 효과(시험예 6) 및 보습효과(시험예 7) 모두에 있어서 동등 이상의 효과를 나타냄을 확인하였다.

본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 모두 본 발명의 영역에 속하는 것으로, 본 발명의 구체적인 보호범위는 첨부된 특허청구범위에 의하여 명확해질 것이다.

Claims (4)

1. a) 상황버섯, 치마버섯, 느타리버섯, 표고버섯, 영지버섯 및 동충하초로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 버섯을 균주로 하여 PDA(Potato Dextrose Agar) 평판 배지에서 계대 배양하면서 20 내지 35℃의 온도에서 5 내지 21일 동안 배양함으로써 버섯 균사체를 제조하고, 상기 제조된 버섯 균사체를 PDB(Potato Dextrose Broth) 배지에 접종하여 진탕 배양하는 단계;
   b) 청호밀 씨방으로부터 분리된 태좌 조직을 상기 배양된 버섯 균사체와 4 : 6 내지 6 : 4의 중량비로 혼합하여 25 내지 30℃의 온도에서 5 내지 20일 동안 배양하는 단계;
   c) 상기 배양된 버섯 균사체 및 청호밀 태좌의 혼합물을 회수하는 단계; 및
   d) 회수된 혼합물을 추출하는 단계;
   를 포함하며,
   상기 단계 b)에서 태좌 조직은 출수 후 20 내지 35일이 경과한 청호밀의 씨방으로부터 분리된 태좌이고,
   상기 단계 d)는 상기 단계 c)에서 회수된 버섯 균사체 및 청호밀 태좌의 배양 혼합물에 중량 기준으로 5 내지 10배의 추출 용매를 첨가하고, 2 내지 5일 동안 가열 과정 없이 침적시킨 후, 4 내지 12 시간 동안 80 내지 100℃의 온도 조건 하에서 추출하는 방식으로 수행되며, 상기 추출 용매는 물, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜 및 프로필렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 버섯 균사체 및 청호밀 태좌의 혼합 배양 추출물을 제조하는 방법.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 단계 d)는 배양된 버섯 균사체와 청호밀 태좌의 혼합물에 추출 용매를 첨가하고, 2 내지 5일 동안 침적하면서 냉각 콘덴서가 구비된 추출기를 이용하여 80 내지 100℃에서 8 내지 10시간 동안 끓여서 추출한 다음, 이를 여과하는 단계를 포함하고,
   여기서, 상기 추출 용매로서 1,3-부틸렌글리콜 및 물의 혼합 용매를 사용하고, 이때 1,3-부틸렌글리콜 및 물의 혼합 비(w/w)는 1 내지 5 : 9 내지 5의 범위인 것을 특징으로 하는 버섯 균사체 및 청호밀 태좌의 혼합 배양 추출물을 제조하는 방법.
4. 제1항 또는 제3항에 따른 방법에 의하여 제조된 버섯균사체 및 청호밀 태좌의 혼합 배양 추출물을, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 또는 스프레이 형태의 화장료 조성물 내에 유효 성분으로 배합하는 단계를 포함하며,
   여기서, 상기 혼합 배양 추출물은 화장료 조성물의 전체 중량에 대하여 0.1 내지 10 중량%로 함유되는 화장료 조성물의 제조방법.