KR102111882B1 - 버섯 복합물을 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 버섯 복합물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 잎새버섯과 영지버섯을 버섯 균사체로 발효 추출하여 제조되는 버섯 복합물을 유효성분으로 함유하여 우수한 세라마이드 생합성 촉진, 피부 장벽강화, 피부 보습, 피부 주름개선 및 피부 재생 효과를 나타내는 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

버섯 복합물을 함유하는 화장료 조성물{Cosmetic composition containing mushroom complex}

본 발명은 버섯 복합물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 잎새버섯과 영지버섯을 버섯 균사체로 발효 추출하여 제조되는 버섯 복합물을 유효성분으로 함유하여 우수한 세라마이드 생합성 촉진, 피부 장벽강화, 피부 보습, 피부 주름개선 및 피부 재생 효과를 나타내는 화장료 조성물에 관한 것이다.

인체의 피부는 표피, 진피 및 피하지방으로 이루어진 몸의 외피로서, 다양한 환경적인 요인에 대해 신체를 보호하는 물리적 장벽의 기능, 촉각 및 온도 조절 등의 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 피부의 방어 시스템은 외부로부터 자극이 가해지면 1차로 피지막, 2차적으로 각질층, 그리고 심한 경우에는 진피의 콜라겐 섬유가 방어하는 방식으로 작용한다.

그러나 많은 스트레스, 환경오염 및 자외선 량의 증가로 인하여 인체 피부는 지속적인 변화를 겪게 되는데, 가장 대표적인 변화가 노화에 의한 피부 기능 저하 및 시각적 아름다움의 감소이다. 피부 노화에 의한 피부 외관의 변화로서 주름 발생, 피부 탄력 저하, 노인성 반점 형성 등을 예시할 수 있는 바, 이러한 피부 노화는 자연히 발생하는 내인성 노화, 그리고 외부 요인에 의하여 발생하는 외인성 노화로 구분된다. 다양한 요인으로 인한 피부 노화의 진행에 따라 피부 건조, 주름 생성, 색소 침착, 수분 부족 현상 등이 일어나는 바, 자외선, 스트레스, 질병 상태 등에 따른 활성산소종이 생체 내 항산화 방어막을 파괴하고, 세포 및 조직을 손상시켜 노화를 촉진하게 된다.

이러한 노화 현상을 지연하기 위해 다양한 기능을 나타내는 피부개선물질들이 개발되어지고 사용하고 있다. 최근에는 천연물질에 대한 관심이 증가하는 추세에 따라 보습력 및 노화 개선 기능, 우수한 피부 노화 개선 효과를 갖는 천연물을 이용하여 화장료 용도에 적용하고자 하는 연구가 이루어지고 있다.

버섯은 각종 영양원이 함유된 유기물에서 영양물질을 흡수하여 이용하기 때문에 버섯에 함유된 성분의 종류 역시 다양할 뿐만 아니라, 대부분이 다당체로 이루어져 있다. 이러한 다당체는 독성물질 그리고 중금속 등으로부터 보호막의 역할을 하며, 건조지역에서 수분을 유지시키는 역할을 한다. 특히, 버섯 내에 함유된 생리활성 성분은 피부 고유의 기능을 유지하고 피부세포를 활성화시켜 피부 노화를 억제할 뿐만 아니라, 보습, 멜라닌 생성 억제 및 자외선 차단에 의한 미백 효과가 우수한 것으로 알려져 있다.

이와 관련하여 대한민국 공개특허 제10-2018-0052151호에는 '꽃송이 버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 항노화 및 주름개선용 화장료 조성물'이 개시되어 있으며, 대한민국 공개특허 제10-2016-0114823호에는 '영지버섯 추출물을 함유하는 근적외선 차단용 화장료 조성물'이 개시되어 있다. 또한, 버섯 균사체는 자실체(버섯)에 영양분을 공급하며, 다량의 생리활성 성분을 함유하고 있어 잠재적인 피부 개선 효과를 갖고 있다. 이와 관련하여 대한민국 공개특허 제10-2011-0136558호에는 ', 동충하초 및 꽃송이버섯의 균사체를 배지에 접종하여 배양한 버섯 균사체 배양액을 함유하는 보습, 주름개선용 화장료 조성물'이 개시되어 있으며, 대한민국 공개특허 제10-2017-0126634호에는 '노루궁뎅이버섯 추출물 및 치마버섯 배양액을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 피부노화 억제용 화장료 조성물'이 개시되어 있다.

본 발명자들은 버섯에 함유되어 있는 피부개선활성 성분들에 주목하여 다양한 버섯들을 대상으로 하여 화장료로 개발하고자 하는 노력을 하였으며, 그 결과 잎새버섯과 영지버섯을 특정 버섯 균사체로 발효 추출하여 제조되는 버섯 복합물이 우수한 피부개선활성을 나타내는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 잎새버섯과 영지버섯을 버섯 균사체로 발효 추출하여 얻어지는 버섯 복합물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 세라마이드 생합성 촉진 및 피부 장벽 강화, 피부 보습, 피부 주름 개선 및 피부 재생 효과가 우수한 상기 버섯 복합물을 제조하는 방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면 잎새버섯과 영지버섯을 버섯 균사체로 발효 추출하여 제조되는 버섯 복합물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물이 제공된다.

상기 버섯 균사체는 상황버섯, 치마버섯, 느타리버섯, 표고버섯, 영지버섯, 잎새버섯 및 동충하초로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 버섯 균사체이며, 더욱 바람직하게는 표고버섯, 잎새버섯 또는 영지버섯의 균사체이며, 가장 바람직하게는 표고버섯 균사체이다.

상기 잎새버섯과 영지버섯은 각각 1~4:1~4의 중량비율로 혼합되어 사용된다.

상기 버섯 복합물은 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.01~15 중량% 함유된다.

상기 화장료 조성물은 피부장벽 강화용, 피부 보습용, 피부 주름개선용 또는 피부재생용임을 특징으로 한다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, (A) 버섯 균사체를 PDA(Potato Dextrose Agar) 평판 배지에 계대 배양하여 20~35℃의 온도에서 5~10일간 배양 후, 버섯 균사체를 접종용 칼로 절단하여 PDB (Potato Dextrose Broth) 액체 배지에 옮겨 20~35℃의 온도에서 5~15일간 진탕 배양하여 버섯 균사체 배양액을 제조하는 단계 ; (B) 상기 버섯 균사체 배양액을 잎새버섯과 영지버섯의 혼합물에 접종하여 25~30℃의 온도에서 3~7일간 배양하여 발효시키는 단계; 및 (C) 상기 발효물을 물, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 프로판올, 부틸렌글리콜, 글리세린, 클로로포름, 에틸아세테이트, 디클로로메탄, 헥산, 아세톤, 아세토나이트릴, 페트로레움에테르, 디에틸에테르 및 카프릴릭/카프릭트라이글리세라이드로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 용매로 추출하는 단계를 포함하는 버섯 복합물의 제조방법이 제공된다.

상기 버섯 균사체는 상황버섯, 치마버섯, 느타리버섯, 표고버섯, 영지버섯, 잎새버섯 및 동충하초로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 버섯 균사체이다.

바람직하게는 상기 (C) 단계에서의 추출은 상기 발효물에 3~7배 중량의 1,3-부틸렌글리콜과 정제수의 혼합 용매를 가하고 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 80~100℃로 8~10시간 끓여서 추출하는 것으로 이루어지는 것임을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 버섯 복합물은 세라마이드 생합성 촉진 및 피부 장벽 강화, 피부 보습, 피부 주름 개선 및 피부 재생 효과가 우수하여 피부 개선용 화장료로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 버섯 복합물의 세라마이드의 생합성에 관여하는 세린 팔미토일 전이효소의 발현 효과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 버섯 복합물의 세라마이드의 생합성에 관여하는 산성 스핑고마이엘리나제 효소의 발현 효과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 버섯 복합물의 피부 장벽 기능을 증대시키는 인간 유래 항균 펩타이드인 β-디펜신-2의 발현 효과를 나타내는 그래프이다.

이하 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.

버섯은 고등균류의 일종인 담자균류에 속하며 그 생물학적 위치는 곰팡이류에 속한다. 버섯은 포자가 발아하여 균사체(Mycelium)를 이루고 자실체(fruit body)로 성장하여 버섯의 모습을 갖추며, 자실체는 다시 포자를 형성하는 생장과정을 되풀이한다. 버섯의 씨는 포자 형태로 자실체의 갓 아래쪽 주름진 살 속에 들어있고 포자가 배지에서 발아를 시작하면 무수한 팡이실을 뽑아내면서 주위 배지의 영양소를 흡수하며 계속 증식하여 약 3~4개월 후 쯤 버섯이 돋아나게 된다. 균사체와 자실체는 기능이나, 구조 그리고 성분 등에서 현저한 차이점이 있다.

버섯균사체는 자실체(버섯)에 영양분을 공급하여 자실체를 성장시키는 에너지를 간직하고 있는 만큼 강한 활성성분을 갖고 있기 때문에 많은 유효성분을 함유하고 있고, 이로 인해 그 효과도 뛰어나다. 균사체에는 자실체보다 각종 영양소가 약 4배정도 더 함유되어 있고, 단백질, 아미노산, 비타민, 무기질, 효소 등 영양이 풍부하다. 균사체는 우수한 흡수력과 번식력을 갖고 있으며, 그로 인해 버섯 식용부분 보다 훨씬 많은 에너지를 보유하고 있다. 따라서 버섯의 에너지의 핵심은 균사체에 있다고 볼 수 있다.

표고버섯(Lentinus edodes)은 담자균류(擔子菌類, Basidiomycetes)의 주름버섯목(Agaricales) 느타리버섯과(Pleurotaceae) 잣버섯속(Lentinus)에 속하는 버섯으로서, 넓은잎나무, 구체적으로, 밤나무, 졸참나무 또는 상수리나무 등의 마른나무에 자생하는 버섯이며, 균저는 지름 10cm로 납작한 반구형이나 생장하면 점점 편평하게 펼쳐지고 표면은 흑갈색으로 불규칙하게 갈라진 금이 있고 뒷면에는 많은 주름이 있다. 콜레스테롤의 수치를 내리고, 혈압을 낮추는 작용을 나타내므로, 고혈압 및 동맥경화의 예방에 유효한 것으로 알려져 있다. 표고버섯의 향기 성분은 레티오닌의 분해에 의하여 나타난다.

영지버섯(Ganoderma lucidum)은 담자균류의 다공균과에 속하는 버섯의 일종으로 그 자실체는 동양에서 효능이 탁월함이 인정되어 널리 약재로 사용되어 왔다. 특히, 영지버섯의 추출물에 면역기능을 조절하고 항암 효과 및 임파구 생성 자극 효과가 있는 성분이 함유되어 있음이 보고된 바 있다. 영지버섯 성분 중 약리작용을 나타내는 중요한 성분들 및 면역기능에 유용한 생리활성을 갖는 물질로서 주로 트리터펜 계열과 다당체들이 이에 속하는 것으로 알려져 있다.

잎새버섯(Grifola frondosa)은 민주름목 구멍장이버섯과(Polyporaceae)에 속하는 버섯으로서 가을에 졸참나무, 물푸레나무의 뿌리 근처에 사물 기생하여 다발로 발생하는 백색 목재부후균이다. 잎새버섯은 식용이면서 약리작용이 뛰어난 기능성 버섯으로 인체의 면역력을 증가시키고, 종양 억제율이 우수하다고 알려져 있다. 잎새버섯은 또한 면역에 관여하는 자연살해세포(natural killer cell) 및 대식세포(macrophage)의 활성을 상승시켜 암을 저해하는데 효과가 있다고 보고되고 있다.

본 발명은 버섯 균사체를 사용하여 잎새버섯과 영지버섯을 발효시켜 추출함으로써 버섯 복합물을 제조하고, 이를 화장료로 이용하는 기술에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 잎새버섯과 영지버섯을 버섯 균사체로 발효 추출하여 제조되는 버섯 복합물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물이 제공된다.

상기 버섯 균사체로는 상황버섯, 치마버섯, 느타리버섯, 표고버섯, 영지버섯, 잎새버섯 및 동충하초로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 버섯 균사체가 사용되며, 더욱 바람직하게는 표고버섯, 잎새버섯 또는 영지버섯의 균사체가, 가장 바람직하게는 표고버섯 균사체가 사용된다.

본 발명에 따르면 상기 버섯 복합물은 다음과 같은 제조방법에 의하여 제조될 수 있다.

(A) 버섯 균사체를 PDA(Potato Dextrose Agar) 평판 배지에 계대 배양하여 20~35℃의 온도에서 5~10일간 배양 후, 버섯 균사체를 접종용 칼로 절단하여 PDB(Potato Dextrose Broth) 액체 배지에 옮겨 20~35℃, 더욱 바람직하게는 25~30℃의 온도에서 5~15일간 진탕 배양하여 버섯 균사체 배양액을 제조하는 단계 ; (B) 상기 버섯 균사체 배양액을 잎새버섯과 영지버섯의 혼합물에 접종하여 25~30℃의 온도에서 3~7일간 배양하여 발효시키는 단계; 및 (C) 상기 발효물을 물, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 프로판올, 부틸렌글리콜, 글리세린, 클로로포름, 에틸아세테이트, 디클로로메탄, 헥산, 아세톤, 아세토나이트릴, 페트로레움에테르, 디에틸에테르 및 카프릴릭/카프릭트라이글리세라이드로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 용매로 추출하는 단계를 포함한다.

먼저, 상기 버섯 균사체를 배양하기 위해 버섯 균사체를 PDA (Potato Dextrose Agar) 배지에서 20~35℃의 온도에서 5~10일간 배양 한 후, PDA 배지 위의 버섯 균사체를 접종용 칼로 절단하여 PDB (Potato Dextrose Broth) 액체 배지에 옮겨 20~35℃의 온도에서, 더욱 바람직하게는 25~30℃의 온도에서 5~15일간 진탕 배양하여 균사체 배양액을 제조한다. 이때 PDA 배지 위의 버섯 균사체는 1 x 1 cm 크기로 절단하여 액체 배양하는 것이 바람직하다.

상기 버섯 균사체로는 상황버섯, 치마버섯, 느타리버섯, 표고버섯, 영지버섯, 잎새버섯 및 동충하초로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 버섯 균사체를 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 표고버섯, 잎새버섯 또는 영지버섯의 균사체를 사용한다. 이 중에서도 표고버섯 균사체를 사용하는 경우에 피부개선활성이 가장 우수한 버섯 복합물을 얻을 수 있으므로 가장 바람직하다.

이어서, 상기 버섯 균사체 배양액을 잎새버섯과 영지버섯의 혼합물에 접종하여 25~30℃의 온도에서 3~7일간 배양하여 발효시킨다. 이때 상기 잎새버섯과 영지버섯의 혼합물은 잎새버섯과 영지버섯이 각각 1~4:1~4의 중량비율로 혼합되어 이루어지며, 상기 균사체 배양액은 잎새버섯과 영지버섯의 혼합물 중량의 1~3배를 사용할 수 있다.

상기 배양에 의하여 얻어진 발효물을 물, 탄소수 1~4의 저급 알코올, 에틸아세테이트, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 및 부틸렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 용매로 추출하여 본 발명의 버섯 복합물을 제조한다. 보다 바람직하게는 상기 발효물에 1,3-부틸렌글리콜과 정제수를 3:7(w/w)의 비율로 혼합한 용매를 3~7배 중량으로 가하고, 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 80~100℃로 8~10시간 끓여서 추출한다.

상기 제조방법에 의하여 제조된 본 발명의 버섯 복합물은 버섯 균사체에 의하여 가수분해된 다양한 피부개선활성성분들을 함유하므로, 우수한 세라마이드 생합성 촉진 및 피부 장벽 강화, 피부 보습, 피부 주름 개선 및 피부 재생 효과를 나타낸다.

상기 버섯 복합물은 활성성분으로서 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.01~15 중량% 함유된다.

본 발명의 화장료 조성물은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있다. 유화 제형의 화장품으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 가용화 제형의 화장품으로는 유연화장수가 있다. 또한, 화장품 이외에도 피부 과학적으로 허용 가능한 매질 및 기제를 함유함으로써 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소 적용 및 전신 적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 화장료 조성물의 제형은 제한되지는 않으나 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징 폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 및 아이섀도로 구성된 그룹에서 선택된 어느 하나의 제형으로 적용되어질 수 있다.

[실시예]

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 시험예에 의거하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것이 아니다.

제조예 1~3: 버섯 균사체 배양액 제조

표고버섯, 잎새버섯 및 영지버섯을 균주로 하여 PDA(Potato Dextrose agar) 평판 배지에 계대 배양하여 25℃의 온도에서 7일간 배양하여 사용하였다. 각각의 배양된 버섯 균사체를 접종용 칼로 절단(1 x 1cm)하여 PDB (Potato Dextrose Broth) 액체 배지에 옮겨 25℃의 온도에서 14일간 진탕 배양하여 버섯균사체 배양액을 준비하였다.

실시예 1~3: 버섯 복합물 제조

상기 제조예에서 제조된 각각의 버섯균사체 배양액 30g을 잎새버섯 10g과 영지버섯 20g으로 구성된 혼합물에 접종하여 25℃의 온도에서 5일간 배양하여 발효시킨다.

이후, 상기 발효물을 1,3-부틸렌글리콜 및 정제수가 3 : 7(w/w)로 혼합된 혼합 용매(3배 중량)로 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 90℃로 8시간 추출한 뒤 여과하여 버섯 복합물을 제조하였다.

비교예 1: 잎새버섯 추출물 제조

잎새버섯 60g을 1,3-부틸렌글리콜 및 정제수가 3 : 7(w/w)로 혼합된 혼합 용매(3배 중량)로 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 90℃로 8시간 추출한 뒤 여과하여 잎새버섯 추출물을 제조하였다.

비교예 2: 영지버섯 추출물 제조

영지버섯 60g을 1,3-부틸렌글리콜 및 정제수가 3 : 7(w/w)로 혼합된 혼합 용매(3배 중량)로 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 90℃로 8시간 추출한 뒤 여과하여 영지버섯 추출물을 제조하였다.

비교예 3: 버섯 혼합추출물 제조

상기 비교예 1의 잎새버섯 추출물 10g, 비교예 2의 영지버섯 추출물 20g, 상기 제조된 표고버섯 균사체 배양액 추출물 30g을 혼합하여 버섯 혼합추출물을 제조하였다.

시험예 1: 세린 팔미토일 전이효소 발현 증가 효과

상기 실시예 및 비교예에서 제조된 버섯 추출물이 세라마이드의 생합성에 관여하는 핵심효소인 세린 팔미토일 전이효소(SPT, Serine palmitoyltransferase)의 발현에 영향을 미치는 정도를 측정하였다. HaCaT 세포를 6 well plate에 1×10⁶cells/well의 농도로 분주하여 배양한 후, FBS가 첨가되지 않은 배지로 교체하여 18시간 starvation 시키고, 24시간 동안 배양하였다. HaCaT 세포에 각 시료 1.0%씩 처리하고, 24시간 배양 한 후 세포는 RT-PCR을 이용하여 Serine palmitoyltransferase(SPT) 발현량을 조사하였다. 그 결과는 도 1에 나타내었다.

도 1에서 확인되는 바와 같이, 동일 농도 처리시 버섯균사체로 가수분해시킨 실시예 1~3의 버섯 복합물은 비교예 1~3의 버섯 추출물 보다 우수한 세린 팔미토일 전이효소 발현 효과를 나타내었다.

그 중에서도 표고버섯 균사체로 발효시킨 실시예 1의 버섯 복합물은 가장 우수한 발현 증가 효과를 나타냄을 확인하였다.

시험예 2: 산성 스핑고마이엘리나제 효소 발현 증가 효과

상기 실시예 및 비교예에서 제조된 버섯 추출물이 세라마이드의 생합성에 관여하는 효소인 산성 스핑고마이엘리나제 효소(aSMase, Acidic sphingomyelinase)의 발현에 영향을 미치는 정도를 측정하였다. HaCaT 세포를 6 well plate에 1×10⁶cells/well의 농도로 분주하여 배양한 후, FBS가 첨가되지 않은 배지로 교체하여 18시간 starvation 시키고, 24시간 동안 배양하였다. HaCaT 세포에 각 시료 1.0%씩 처리하고, 24시간 배양 한 후 세포는 RT-PCR을 이용하여 acidic sphingomyelinase(aSMase) 발현량을 조사하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다.

도 2에서 확인되는 바와 같이, 동일 농도 처리시 실시예 1~3의 버섯 복합물은 비교예 1~3의 버섯 추출물 보다 우수한 산성 스핑고마이엘리나제 효소 발현 증가 효과를 나타내었다.

시험예 3: β-디펜신 분비 촉진 효과 시험

상기 실시예 및 비교예에서 제조된 버섯 추출물이 피부 면역 장벽 기능을 증대시키는 인간 유래 항균 펩타이드인 β-디펜신-2(hBD-2, Human -defensin-2)의 발현에 영향을 미치는 정도를 측정하였다.

HaCaT 세포를 6 well plate에 1×10⁶cells/well의 농도로 분주하여 배양한 후, FBS가 첨가되지 않은 배지로 교체하여 18시간 starvation 시키고, 24시간 동안 배양하였다. HaCaT 세포에 각 시료 1.0%씩 처리하고, 24시간 배양 한 후 세포는 RT-PCR을 이용하여 Human-defensin-2(hBD-2) mRNA 발현량을 조사하였다. 그 결과는 도 3에 나타내었다.

도 3에서 확인되는 바와 같이, 동일 농도 처리시 실시예 1~3의 버섯 균사체 발효 버섯 복합물은 비교예의 버섯 추출물 보다 우수한 β-디펜신-2 발현 증가 효과를 나타내었다.

그 중에서도 표고버섯 균사체를 사용하여 가수분해시켜 얻어진 실시예 1의 버섯 복합물은 보다 더 우수한 발현 증가 효과를 나타내었으며, 대조군인 피메클로리무스와 비교해도 비슷한 효과를 나타내어 피부장벽강화효과가 우수하다는 것을 확인할 수 있었다.

시험예 4: Hyaluronic acid 생성량 측정

상기 실시예 및 비교예에서 제조된 버섯 추출물 시료를 사용하여 Hyaluronic acid 생성량을 측정하였다. HaCaT 세포를 6 well plate에 1×10⁶cells/well의 농도로 분주하여 배양한 후, FBS가 첨가되지 않은 배지로 교체하여 18시간 starvation 시키고, 24시간 동안 배양하였다. HaCaT 세포에 각 시료 1.0%씩 처리하고, 24시간 배양 한 후 회수한 배양액은 ELISA kit를 이용하여 hyaluronic acid(HA)의 생성량을 측정하였으며, 그 결과를 표 1에 나타내었다.

시료명	처리 농도 (%)	HA 생성량(ug/ml)
실시예 1	1.0	62.1
실시예 2	1.0	49.7
실시예 3	1.0	56.1
비교예 1	1.0	41.4
비교예 2	1.0	44.6
비교예 3	1.0	50.3
히알루론산	1.0	57.8

상기 표 1에서 확인되는 바와 같이 동일 농도 처리시, 실시예 1~3의 버섯 복합물에서 우수한 Hyaluronic acid 생성량를 보였으며, 그 중에서도 표고버섯 균사체 발효 버섯 복합물인 실시예 1에서 가장 우수한 효과를 나타내었다.

시험예 5: 콜라겐 생합성 촉진 효과 시험

섬유아세포(CCD-986Sk)를 10% FBS가 첨가된 IMDM 배지를 이용하여 5×10⁵ cell/well로 조절한 후 12 well plate에 접종하고 18시간 동안 배양하였다. 배양한 뒤, 상기 실시예 및 비교예의 시료를 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포에서 RNA를 추출하여 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction)을 통해 콜라겐(collagen)의 발현 증가율을 확인하였다. 대조군으로는 아데노신(Adenosine)을 사용하였다.

콜라겐 발현율(%)=(시료 콜라겐발현량/대조군 콜라겐발현량)×100

시료명	처리 농도 (%)	콜라겐 발현증가율(%)
실시예 1	1.0	135.7
실시예 2	1.0	128.1
실시예 3	1.0	130.4
비교예 1	1.0	109.4
비교예 2	1.0	116.6
비교예 3	1.0	125.3
아데노신	0.5	132.7

상기 표 2에서 확인되는 바와 같이 동일 농도 처리시, 실시예 1~3의 버섯 복합물에서 우수한 콜라겐 합성효과를 보였으며, 그 중에서도 표고버섯 균사체를 사용한 실시예 1의 버섯 복합물에서 가장 우수한 효과를 나타내었다.

시험예 6: 피부 재생 효과

상기 실시예 및 비교예에서 제조된 버섯 추출물의 피부 재생 효과를 확인하기 위해 wound healing assay를 수행하였다. 각질형성세포(HaCaT)를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 1×10⁶ cell/well로 조절한 후, 6플레이트(well plate)에 접종하고 18시간 동안 배양하였다. 6 웰 플레이트(well plate)에 가득 자란 세포에 스크래치를 내어 세포의 일부분을 플레이트 바닥에서 떨어지게 한 다음, 실시예 및 비교예 각각의 시료를 1.0(w/v%)씩 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 세포가 재생된 정도를 확인하였고, 세포재생율을 하기 수학식에 의하여 산출하였다.

세포재생율(%) = (시료 세포 재생율/대조군 세포 재생율) × 100

산출된 세포재생율을 하기 표 3에 나타내었다. 대조군으로는 덱사메타손(Dexamethason)을 사용하였다.

구분	처리농도(w/v%)	세포재생율(%)
실시예 1	1.0	82.0
실시예 2	1.0	70.7
실시예 3	1.0	79.3
비교예 1	1.0	58.7
비교예 2	1.0	63.9
비교예 3	1.0	77.4
덱사메타손(Dexamethason)	1.0	82.2

상기 표 3에서 확인되는 바와 같이, 실시예 1~3의 버섯 복합물에서 우수한 세포 재생효과를 나타내었으며, 그 중에서도 표고버섯 균사체를 사용하여 얻어진 실시예 1의 버섯 복합물은 대조군인 덱사메타손과 비슷한 효과를 나타내어 가장 우수한 피부 재생효과를 나타내었다.

실시예 4: 버섯 복합물을 함유하는 크림 제조

상기 실시예 1의 버섯 복합물을 함유하는 크림을 하기 표 4의 조성 및 함량으로 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성 분	함량(중량%)
	대조예 1	실시예 4
버섯 복합물(실시예 1)	-	2.0
친유형 모노스테아린산글리세린	2.0	2.0
스테아릴알콜	2.2	2.2
스테아린산	1.5	1.5
밀납	1.0	1.0
폴리솔베이트 60	1.5	1.5
솔비탄스테아레이트	0.6	0.6
정화식물유	1.0	1.0
스쿠알란	3.0	3.0
광물유	5.0	5.0
트리옥타노인	5.0	5.0
디메치콘	1.0	1.0
소듐마그네슘실리케이트	0.1	0.1
글리세린	5.0	5.0
베타인	3.0	3.0
트리에탄올아민	1.0	1.0
소듐히아루로네이트	4.0	4.0
방부제, 향, 색소	미량	미량
정제수	잔량	잔량
합계	100	100

시험예 7: 피부 장벽기능 회복 효과

피부 장벽기능 회복 효과를 확인하기 위해, 사람의 상박에 테이핑 스트리핑 방법(Taping stripping Method)을 이용하여 피부의 장벽을 손상시킨 후, 상기 실시예 4 및 대조예 1에서 제조한 크림 각각을 5㎠ 면적에 도포한 후, 표피 수분 손실량(TEWL, transdermal water loss)을 2시간, 4시간, 6시간, 8시간 경과 후에 측정하여 감소하는 정도를 평가함으로써 장벽기능이 회복되는 정도를 평가하였다. 표피 수분 손실량(TEWL, transdermal water loss)은 Cortex Technology사(덴마크) DermaLab Combo로 측정하였다. 결과는 초기 손상된 장벽 상태에서의 표피 수분 손실량을 기준(100%)으로 하여 시간에 따른 변화를 비교한 후, 하기 표 5에 나타내었다.

시료	0시간	2시간	4시간	6시간	8시간
대조예 1	78	65	58	50	43
실시예 4	80	45	34	28	20

상기 표 5에서 확인되는 바와 같이, 피부 장벽기능 회복 시험 결과 본 발명의 표고버섯 균사체를 사용하여 얻어진 버섯 복합물을 함유한 실시예 4의 크림 조성물은 이를 함유하지 않은 대조예 1의 크림에 비해 우수한 피부 장벽기능 회복을 보였다.

시험예 8: 피부 주름개선 효과 확인

피부 주름 개선 효과를 확인하기 위해, 각 10명씩 나누어 상기 실시예 4와 대조예 1의 제형을 안면부에 하루 2회씩(아침 및 저녁) 4주간 도포하였다. 4주 후 주름의 개선 정도를 주름의 영상 분석을 통해 평가하였다.

주름의 영상분석에 의한 평가는 실험이 시작되기 전 눈 밑의 레플리카를 채취하고 실험이 종료된 직후의 레플리카를 눈 밑의 동일 부위에서 채취하여 영상분석을 통해 주름의 2차원적 분석으로 주름의 밀도를 측정하였다. 영상분석에 의한 주름 밀도의 측정 결과는 사용 전과 비교한 주름 밀도에 대한 감소율로 하기의 표 6에 나타내었다.

구분	주름 밀도 감소율 (%)
대조예 1	8
실시예 4	32

상기 표 6에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 표고버섯 균사체 발효 버섯 복합물을 함유한 실시예 4의 제형에서 높은 주름개선 효과를 나타내었다.

실시예 5: 유연 화장수

본 발명의 버섯 복합물(실시예 1)을 함유한 유연 화장수를 하기의 표 7의 조성 및 함량으로 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분(중량%)	실시예 5
버섯 복합물(실시예 1)	2.0
1,3-부틸렌 글리콜	5.2
올레일알코올	1.5
에탄올	3.2
폴리솔베이트 20	3.2
벤조페논-9	2.0
카르복실비닐폴리머	1.0
글리세린	3.5
향	미량
방부제	미량
정제수	잔량
계	100

실시예 6: 영양 화장수(밀크로션)

본 발명의 버섯 복합물(실시예 1)을 함유한 영양 화장수를 하기의 표 8의 조성 및 함량으로 통상의 방법에 따라 제조하였다

성분(중량%)	실시예 6
버섯 복합물(실시예 1)	2.0
글리세린	5.1
프로필렌글리콜	4.2
토코페릴아세테이트	3.0
유동파라핀	4.6
트리에탄올아민	1.0
스쿠알란	3.1
마카다미아너트오일	2.5
폴리솔베이트 20	1.6
솔비탄세스퀴롤레이트	1.6
프로필파라벤	0.6
카르복실비닐폴리머	1.5
향	미량
방부제	미량
정제수	잔량
계	100

Claims (7)

1. 잎새버섯과 영지버섯을 표고버섯 또는 영지버섯의 균사체로 발효 추출하여 제조되는 버섯 복합물을 유효성분으로 함유하는 피부장벽 강화용, 피부 보습용, 피부주름개선용 또는 피부재생용 화장료 조성물.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 잎새버섯과 영지버섯은 각각 1~4:1~4의 중량비율로 혼합되어 사용되는 것임을 특징으로 하는 피부장벽 강화용, 피부 보습용, 피부주름개선용 또는 피부재생용 화장료 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 버섯 복합물은 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.01~15 중량% 함유되는 것임을 특징으로 하는 피부장벽 강화용, 피부 보습용, 피부주름개선용 또는 피부재생용 화장료 조성물.
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제

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