KR20030030488A

KR20030030488A - 잎새버섯 균사체의 추출물을 함유하는 피부 노화방지 효과및 미백효과를 갖는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20030030488A
Application number: KR1020010062648A
Authority: KR
Inventors: 이범천; 윤은정; 이동환; 배준태; 표형배
Original assignee: 한불화장품주식회사
Priority date: 2001-10-11
Filing date: 2001-10-11
Publication date: 2003-04-18
Also published as: KR100438009B1

Abstract

본 발명은 피부 노화방지 효과 및 미백효과를 갖는 화장료 조성물에 관한 것으로, 항산화 효과와 피부세포의 증식 및 콜라겐의 생성촉진 효과와 피부 멜라닌생성 억제 효과가 있는 잎새버섯(Grifola frondosa)의 균사체 또는 그의 배양액으로부터 얻은 추출물을 화장료 조성물 총량에 대하여 0.00001∼30중량%의 양으로 함유함을 특징으로 한다.

Description

잎새버섯 균사체의 추출물을 함유하는 피부 노화방지 효과 및 미백효과를 갖는 화장료 조성물{A cosmetic composition containing an extract of Grifola frondosa}

본 발명은 잎새버섯(Grifola frondosa)의 액체배양에 의해 얻은 균사체 추출물 또는 그의 배양액으로부터 제조된 세포외 고분자 물질의 다당체를 이용하여 피부 세포 증식 및 피부 기능 활성 촉진효과와 피부 멜라닌생성 억제 효과 및 항산화 효과가 탁월한 잎새버섯 추출물의 피부 노화방지 효과 및 미백효과를 갖는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

피부는 인체 중 가장 큰 조직이며 일차 방어막으로서 외부환경의 자극으로부터 보호해 주는 기능으로 생체성분의 손실을 방지하는 동시에 외부환경의 유해물질의 피부내 침입을 방지하는 것이다. 외부에 의해 화학적인 힘이 가해지면 1차로 피지막이 방어하고, 2차적으로 각질층이, 심한 경우에는 진피의 콜라겐섬유가 방어하는 시스템으로 되어 있다. 그러나 외부의 물리,화학적 자극 및 스트레스, 영양결핍 등이 심할 경우 피부의 정상기능을 저하시키고 피부의 노화현상을 촉진시켜며 피부를 손상시키게 된다. 기존의 동.식물과 미생물을 이용한 생리활성물질들을 화장품에 부가하여 피부기능을 유지하고 피부세포를 활성화시켜 피부노화를 효과적으로 억제하기 위한 노력이 계속되어 왔다.

이러한 연구의 일환으로, 고등균류인 버섯이 생산하는 다당류를 보습 및 피부개선을 위한 기능성 첨가물로서 산업적 응용이 이루어지고 있다(Critical Rev in Immun 19, 65-96). 버섯은 각종 영양원이 함유된 유기물에서 영양물질을 흡수, 이용하고 있기 때문에 버섯에 함유된 물질의 종류도 다양할 뿐만 아니라 대부분이 바이오폴리머와 같은 기능성 물질인 다당체로 구성되어 있다. 이러한 다당체는 독성물질 그리고 중금속 등으로부터 보호막의 역할을 하며, 건조지역에서 수분을 유지시키는 역할도 한다. 약용버섯으로서 그 기능이 알려진 동충하초, 영지버섯, 표고, 구름버섯, 상황버섯 등의 생리 활성물질들은 피부의 고유기능을 유지하고 피부세포를 활성화시켜 피부노화 억제뿐만 아니라 보습기능, 멜라닌 생성억제 및 자외선 차단 기능에 의한 미백 또는 항산화 기능이 우수한 것으로 알려져 있다.

지금까지 알려진 버섯의 추출물을 이용한 화장료 조성물로서는 눈꽃동충하초 (한국특허 제2000-0018909), 상황버섯, 치마버섯(한국특허 제2000-0055724, 제1999-0076537), 표고버섯 등이 있으며 이들 추출물의 피부 노화방지 효과에 관한 연구가 계속되어 왔다.

약용과 식용으로 사용되고 있는 버섯류들은 그 예와 종류가 무수히 많기는 하지만, 화장료 조성물로서 이용되고 연구되고 있는 버섯류들은 아직은 일부분으로 알려져 있다. 그러나, 지금껏 잎새버섯 추출물을 이용한 그 어떠한 물질이 화장료로서 피부 노화방지 효과 및 미백효과를 나타내는지는 아직 규명된 바가 없다.

이에, 본 발명자들은 피부에 자극이 적고 피부세포 활성과 콜라겐 합성 증식작용이 우수한 천연물질에 관해 연구하던 중 항암 및 항균작용이 우수한 잎새버섯(Grifola frondosa)의 균사체 추출물이 피부노화 방지에 탁월한 효과가 있음을 알고 본 발명을 완성하게 되었다.

또한, 본 발명자들은 잎새버섯의 균사체를 액체배양하여 얻은 다당체를 생산하는데 있어서, 단순 복합배지를 이용하는 경우 다당체를 생산할 수 있으며, 최적화된 합성배지를 이용할 경우 더욱더 높은 다당체를 생산할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 잎새버섯 균사체 추출물을 함유하는 피부 노화방지 효과가 있는 피부세포 활성화, 콜라겐 합성증식 및 멜라닌 생성을 억제하여 미백효과를 갖는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 이루기 위해서, 본 발명에 따른 피부 노화 방지 효과 및 미백효과를 갖는 화장료 조성물은 잎새버섯 균사체 또는 그의 배양액으로부터 얻은 추출물을 함유함을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 또다른 목적은 잎새버섯의 균사체를 액체배양하여 얻은 다당체로부터 화장료 조성물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명에서 잎새버섯 균사체 추출물 또는 균사체 배양액으로부터 얻은 추출물은 균사체에 증류수를 가하여 고온에서 열수추출한 열수추출물 또는 균사체를 제거한 배양액에 알코올을 가하여 침전시켜서 얻은 침전물을 원심분리하여 얻은 것을 고분자량의 초여과막으로 여과시켜 저분자 물질을 제거하여 얻은 것을 말한다.

이하, 본 발명의 구성을 좀더 상세하게 설명한다.

잎새버섯(그리폴라 프론도사Grifola frondosaFr)은 분류학적으로 민주름버섯목(Aphllophorales), 구멍장이과(Polyporaceae), 잎새버섯 속(Grifola)에 속한다. 잎새버섯의 균핵은 해열, 부종, 항종양 등의 약효가 있어 한약재로 사용되며, 식용버섯 중 잎새버섯은 당, 단백질, 지방산, 유기산, 아미노산, 핵산, 효소류 및 무기염류 등 생체의 생리조절에 필요한 성분뿐만 아니라, 향미 성분 등이 풍부하게 포함되어 있어 그 맛과 형태가 뛰어나 식품으로서 유용한 고급버섯의 하나로 취급되고 있다. 또한 잎새버섯의 주요 다당체인 베타 글루칸의 화학적 구조는 다른 약용 버섯에서 발견되는 베타 글루칸의 구조와는 달라 세포의 면역 반응을 자극시키는 가장 강력한 성분으로 보고되어 있다(Chem Pharm Bull, 34(4), 1709-1715, Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi, 41(10), 733-740). 또한 잎새버섯은 항암작용 뿐만 아니라 혈압강하, 당뇨병, 비만치료, 혈중 콜레스테롤 감소, 항균작용, 이뇨작용, 강장작용, 항빈혈작용, 폐결혈 치료 등의 효과가 있는 것으로 알려져 있다(Critical Review in Immunology, 19, 65-96).

본 발명에서 상기 약리적 효과를 갖는 잎새버섯 균사체는 잎새버섯의 자실체에서 얻은 포자를 발아시켜서 얻은 균사체를 고형배지 또는 액체배지에서 배양하여 얻을 수 있다. 그러나 고형배지에 의한 균사체 배양은 배양기간이 길고, 균사체 수율이 낮다. 또한, 고체배지를 이용하는 경우 균사체의 배양이 균일하게 이루어지지 않으며, 균사체 추출시 배지성분이 혼합될 우려가 있으므로, 액체배지에 의한 균사체 배양법을 택하는 것이 바람직하다.

본 발명의 잎새버섯 균사체의 액체배지 배양방법을 설명하면 다음과 같다.

즉, 포자를 멸균된 증류수로 수회 세척한 후, 효모-맥아즙 한천배지(효모엑기스 3 g, 맥아즙 3 g, 포도당 10 g, 펩톤 5 g, 한천 20 g, 증류수 1ℓ)에 도말하여 20∼30℃, 바람직하게는 25℃에서 5∼15일, 바람직하게는 7∼8일간 배양하여 균사체를 얻는다. 균사체는 효모-맥아즙 한천배지가 든 시험관에 사면배양하여 저온, 바람직하게는 4∼10℃에 보관하고 1개월마다 계대배양하여 사용한다.

사면배지에서 자란 균사체를 무균적으로 균질화하여 이를 액체배지에 접종한다. 바람직하게는 3∼10%(v/v) 농도로 접종한다.

사면배지에서 자란 균사체를 액체배지에 배양하는 1) 단계에서 단순 복합배지(PMP)의 액체배지로는 감자-포도당 배지(Potato dextrose broth) 1∼5%,바람직하게는 2.4%, 맥아즙(Malt extract) 0.5∼2%, 바람직하게는 1.0%, 펩톤(Peptone) 0.1∼0.5%, 바람직하게는 0.1%를 함유하는 영양배지가 균사체 성장 및 다당체 생산 측면에서 바람직하다.

잎새버섯 균사체의 액체 배양 2)단계에서 액체배지로는 포도당 3∼6%, 바람직하게는 5%, 효모 추출물 0.5∼1.0%, 바람직하게는 0.6%, 폴리펩톤 0.1∼0.5%, 바람직하게는 0.2%, 황산마그네슘(MgSO₄7H₂O) 0.01∼0.10%, 바람직하게는 0.05%, 일인산칼륨(KH₂PO₄) 0.01∼0.10%, 바람직하게는 0.05%, 이인산칼륨(K₂HPO₄) 0.01∼0.10%, 바람직하게는 0.05%, 황산망간(MgSO₄5H₂O) 0.01∼0.05%, 바람직하게는 0.02%를 함유한 최적화된 영양배지가 균사체 성장과 다당체 생산 측면에서 단순 복합배지 배양법을 실시하였을 때보다 더 바람직하다.

균사체의 액체배양은 최적영양배지 및 단순복합배지 두가지 배지에서 온도 20∼28℃, 바람직하게는 25℃, pH 2.0∼9.0, 바람직하게는 pH 5.5, 회전수 100∼ 300rpm, 바람직하게는 150rpm, 통기량 1.0∼3.0vvm, 바람직하게는 2.0vvm의 동일한 발효조 조건 하에서 7∼12일간 배양한다.

균사체를 제거한 배양액을 3∼7배량의 알코올, 바람직하게는 에틸알코올을 가하여 4℃에서 하룻밤 방치한다. 생성된 침전물은 7000∼20,000rpm에서 5∼60분간 원심분리하여 수거한다. 수거된 침전물을 증류수에 녹여 고분자량의 초여과막을 사용하여 여과시켜서 저분자 물질을 제거한 후, 건조, 바람직하게는 동결건조하여 시료 GPC-1과 GPS-1를 얻는다. 여기에서 GPC-1은 단순 복합배지를 이용한 잎새버섯 균사체 배양액을 에틸알코올 침전하여 얻은 시료를 칭하는 것이고, GPS-1은 최적화된 합성배지를 이용한 잎새버섯 균사체 배양액을 에틸알코올 침전하여 얻은 시료를 말하는 것이다.

배양액을 여과하여 얻은 균사체는 수세한 후, 1∼5배량의 증류수를 가하여 고온에서 수시간동안 열수추출한 후, 여과하는 과정을 수회 반복한다. 잔사를 제거한 여과액은 고분자량의 초여과막을 사용하여 여과시켜서 저분자 물질을 제거한 후, 3∼7배량의 알코올, 바람직하게는 에틸알코올을 가해 4℃에서 하룻밤 방치한다. 생성된 침전물은 7,000∼20,000rpm에서 5∼60분간 원심분리하여 수거하고, 건조, 바람직하게는 동결건조하여 시료 GPC-2와 GPS-2를 얻는다. 여기에서 GPC-2는 단순 복합배지를 이용한 잎새버섯을 배양하여 균사체를 추출하여 얻은 시료를, GPS-2는 최적화된 합성배지를 이용한 잎새버섯을 배양하여 균사체를 추출하여 얻은 시료를 말한다.

이와 같이 수득한 잎새버섯의 균사체 추출물인 GPC-1, GPS-1 및 또는 그의 배양액의 추출물인 GPC-2, GPS-2는 피부세포 증식 효과와 콜라겐 생성 효과 및 항산화 효과 그리고 멜라닌 생성억제 효과가 뛰어난 다당체를 다량 함유한다.

상기 방법으로 얻은 잎새버섯 균사체 또는 그의 배양액으로부터 얻은 추출물은 본 발명의 피부 노화방지 효과 및 미백효과를 갖는 화장료 조성물에 조성물 총 중량에 대하여 0.00001 ~ 30중량%의 양으로 함유될 수 있다. 총중량 대비 0.00001중량% 미만인 경우 노화방지 및 미백 등의 기능을 발휘할 수 없으며, 30중량%를 초과하는 경우에는 추출물의 양 증가에 대비한 기능의 개선 정도가 미미하다.

피부 노화방지 효과 및 미백효과를 갖는 화장료 조성물의 제형은 특별히 한정되지는 않으며, 유연화장수, 영양화장수, 마사지 크림, 영양크림과 같은 기초화장료 및 색조화장료 등으로 용이하게 제형화될 수 있다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 좀더 상세하게 설명한다. 그러나, 본 발명의범위가 이들 실시예의 기재로만 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

잎새버섯 균사체를 효모-맥아즙 한천배지(효모엑기스 3 g, 맥아즙 3 g, 포도당10 g, 펩톤 5 g, 한천 20 g, 증류수 1ℓ)가 든 시험관에 사면배양하여 4℃에 보관하고 1개월마다 계대배양하여 사용하였다.

상기 사면배지에서 자란 균사체를 무균적으로 균질화하여 이를 감자-포도당 배지(Potato dextrose broth) 2.4%, 맥아즙(Malt extract) 1.0%, 펩톤(Peptone) 0.1%를 함유한 단순 복합배지(PMP)로 하며 pH 5.5로 조정한 액체배지에 5%(v/v)되게 접종한 후, 발효조 내에서 온도 25℃, 회전수 150rmp, 통기량 2vvm의 조건으로 10일간 배양하였다.

배양완료 후, 균사체를 제거한 배양액을 4배량의 에틸알코올 가하여 4℃에서 하룻밤 방치하였고, 생성된 침전물은 12,000rmp에서 30분간 원심분리하여 수거하였다. 수거된 침전물을 증류수에 녹여 분자량 12,000의 초여과막을 사용하여 여과시켜서 분자량 12,000이하의 저분자 물질을 제거한 후, 동결건조하여 GPC-1을 얻었다 (GPC-1; 단순 복합배지를 이용한 잎새버섯 균사체 배양액을 에틸알코올 침전하여 얻은 시료).

[실시예 2]

사면배지에서 계대배양된 잎새버섯의 균사체를 무균적으로 균질화하여, 이를포도당 5%, 효모액기스 0.6%, 폴리펩톤 0.2%, 황산마그네슘(MgSO₄7H₂O) 0.05%, 일인산칼륨(KH₂PO₄) 0.05%, 이인산칼륨(K₂HPO₄) 0.05%, 황산망간(MgSO₄5H₂O) 0.02%를 함유한 최적화된 합성배지로 하며 pH 5.5로 조정한 액체배지에5%(v/v)되게 접종한 후, 발효조 내에서 온도 25℃, 회전수 150rpm, 통기량 2vvm의 조건으로 10일간 배양하였다.

배양완료 후, 균사체를 제거한 배양액을 실시예 1과 동일한 방법에 따라 GPS-1을 얻었다(GPS-1; 최적화된 합성배지를 이용한 잎새버섯 균사체 배양액을 에틸알코올 침전하여 얻은 시료).

[실시예 3]

실시예 1과 2에서 배양액을 여과한 후 남은 균사체를 수세하여 4배량의 증류수를 가하여 100℃에서 4시간동안 열수추출한 후, 여과하는 과정을 3회 반복하였다. 잔사를 제거한 여과액은 분자량 12,000의 초여과막을 사용하여 여과시켜서 저분자 물질을 제거한 후, 4배량의 에틸알코올을 가해 4℃에서 하룻밤 방치하였다. 생성된 침전물은 시료 GPC-2와 GPS-2를 얻었다(GPC-2; 단순 복합배지를 이용한 잎새버섯을 배양하여 균사체를 추출하여 얻은 시료, GPS-2; 최적화된 합성배지를 이용한 잎새버섯을 배양하여 균사체를 추출하여 얻은 시료).

[시험예 1] 잎새버섯 추출물의 항산화 효과 측정

본 시험예는 상기 실시예 1∼3에서 수득한 잎새버섯 균사체 추출물의 항산화 효과를 확인하기 위해 실험실 조건에서 NBT법을 이용하여 항산화 활성을 측정하였다.

항산화 효과를 측정하기 위해서 크산틴과 크산틴옥시다제에 의해 생성되는 활성산소를 NBT법에 의해 측정하고 피검물질이 활성산소를 제거하는 효과, 즉 활성산소 소거효과를 평가한다. 크산틴과 크산틴옥시다제에 의해 활성산소를 생성시킨다. 이 활성산소가 니트로블루테트라졸리움(Nitro Blue Tetrazolium;NBT)과 반응하여 이것에 의해 생성되는 청색을 파장 560nm에서 측정하는 것으로 활성산소 소거율을 측정한다.

사용한 시약으로서는

1) 0.05M(50mM) Na₂CO₃완충액(MW=105.99) : 탄산나트륨(화광순약) 5.25g(50mM)을 정제수에 용해한 용액과 50mM NaHCO₃(MW= 84.01)용액을 혼합하여 pH 10.2로 한다.

2) 3mM 크산틴 용액 : 크산틴(半井化學, MW=152.11)) 45.6mg을 물에 용해하여 10ml로 한다.

3) 3mM EDTA용액 : 에틸렌디아민4초산나트륨(同仁化學, MW=60.1)을 증류수에 용해하여 3mM로 한다.

4) 0.15% BSA용액 : BSA(Fraction V, powder,Sigma) 15mg을 증류수에 용해하여 10ml로 한다.

5) 0.75mM NBT용액 : 니트로블루 테트라졸리움(MW=817.65, 東京化學) 61.32mg을 증류수에 용해하여 100ml로 한다.

6) 크산틴 옥시다제(xanthine oxidase) 용액: 크산틴 옥시다제(Boehringer)를 증류수로 약 100배로 희석하고 측정조작에서 공시험의 흡광도가 0.2-0.23의 범위에 들도록 한다. 다시 말해 흡광도의 변화가 A₅₆₀=0.3/20분이 되게 정제수로 희석한다.

7) 6mM CuCl₂용액 : 염화동(CuCl₂-2H₂O, MW=134.45)를 102.29mg을 증류수에 용해하여 100ml로 한다.

측정방법으로서

1. 0.05M Na₂CO₃------------------------------------ 2.4ml

2. 3mM 크산틴 용액---------------------------------- 0.1ml

3. 3mM EDTA 용액------------------------------------ 0.1ml

4. BSA 용액----------------------------------------- 0.1ml

5. 0.72mM NBT 용액---------------------------------- 0.1ml

6. 크산틴 옥시다제 용액---------------------------- 0.1ml

7. 6mM CuCl₂용액------------------------------------ 0.1ml

① 바이엘병에 1,2,3,4,5를 가하고 여기에 시료용액 0.1ml을 첨가하고 25℃에서 10분간 방치한다.

② 6을 가하여 빨리 교반하고 25℃에서 20분간의 배양을 개시한다.

③ 그 후 7을 가하여 반응을 정지시키고 560nm에서의 흡광도 St를 측정한다.

④ 공시험은 시료용액 대신에 증류수를 사용한 것을 상기와 똑같이 조작해 흡광도 Bt를 측정한다.

⑤ 역시, 시료용액의 블랭크(Blank)는 6 대신에 증류수를 사용해 똑같이 조작하여 흡광도 Bo를 측정한다.

효과의 결과는 수학식 1에 의하여 산출하였으며, 결과는 표1과 같다.

억제율(%) = 〔1-(St-So)/(Bt-Bo)〕X 100

St : 시료용액의 효소 반응 후의 560nm에서의 흡광도

Bt : 공시험용액의 효소 반응 후의 560nm에서의 흡광도

So : 시료용액의 효소 무첨가시 반응전의 560nm에서의 흡광도

Bo : 공시험용액의 효소 무첨가시 반응전의 560nm에서의 흡광도

시험에 사용한 시료는 각 잎새버섯 추출물의 3% 수용액을 가지고 실험한 것의 결과값이다. 그 결과를 표 1에 나타내었다.

잎새버섯 추출물	항산화효과(%)
GPC-1	84
GPS-1	96
GPC-2	75
GPS-2	80

[시험예 2] 잎새버섯 추출물의 세포 활성 효과 측정 (MTT assay)

세포주는 마우스 유래 섬유아세포인 Hs-68 사용하였으며 12웰 플레이트에 웰 당 2 x 10⁵세포 수로 세포를 분주하고 24시간 배양한다. 각 원료를 세포독성을 일으키지 않는 농도로 처리하고 시료를 처리한 후 24사간이 지나면 배지를 제거하고 각 웰당 500ul 새 배지와 60ul MTT용액을 넣은 후 2시간 동안 37℃ CO₂배양기에서 배양한다. 세포를 용해시키고 각각을 100ul씩 96 웰 플레이트에 옮긴다.

ELISA 판독기 565nm에서 흡광도를 측정한다. 대조군은 실시예에서 제조한 GPC-1, GPS-1, GPC-2 및 GPS-2를 첨가하지 않는다는 것을 제외하고 상기에서와 동일한 방법으로 실시하여 흡광도를 측정한다. 잎새버섯 추출물을 함유한 실험군과 대조군의 흡광도를 비교하여, 비교%를 표 2에 나타내었다.

잎새버섯 추출물	세포증식율(%)
GPC-1	125
GPS-1	130
GPC-2	115
GPS-2	125
대조군	100

[시험예 3] 잎새버섯 추출물의 콜라겐 생성 촉진 효과 측정

실험에 사용한 세포주는 인간 섬유아세포(Human Dermal Fibroblast, HDF)를 사용하였으며, 시료를 첨가 후 세포외 매트릭스(extracellular matrix)의 주요성분인 콜라겐의 농도를 측정하기 위해서 ELISA를 실시하였다. 시료가 첨가된 배지(serum free)로 교환하고 12시간 배양한 다음 PBS-T(0.02% tween-20 in PBS)로HDF를 3회 세척한다. 3% 포름알데히드로 세포를 20분간 고정화 한 다음 5% 스킴밀크(skim milk)를 1시간 처리하여 블로킹한다. 1차항체(Primary antibody)인 단일클론 항-콜라겐 타입 IV(monoclonal anti-collagen type Ⅳ)를 37℃, 5% CO₂에서 40분간 반응시킨다. PBS-T로 3회 세척 후, 2차 항체(secondary antibody)인 항-마우스 IgG(anti-mouse IgG)를 PBS-T 에 1/1,000로 희석하여 다시 40분정도 반응시킨 후, PBS-T로 5회 세척하여 준다. 기질인 다이에탄올아민 완충액에 용해시킨 알칼린 포스파타아제 기질 용액(alkaline phosphatase substrate solution; 1mg/ml ρ-nitrophenyl phosphate in diethanolamine buffer)을 첨가하여 30분간 반응시킨 후 405nm에서 흡광도를 측정한다. 대조군은 실시예에서 제조한 GPC-1, GPS-1, GPC-2 및 GPS-2를 첨가하지 않는다는 것을 제외하고 상기에서와 동일한 방법으로 실시하여 흡광도를 측정한다. 잎새버섯 추출물을 함유한 실험군과 대조군의 흡광도를 비교하여, 비교%를 표 3에 나타내었다.

잎새버섯 추출물	콜라겐 합성율(%)
GPC-1	140
GPS-1	150
GPC-2	120
GPS-2	130
대조군	100

[시험예 4] 머쉬룸 티로시나제를 이용한 티로시나제 억제효과 측정 실험

본 시험예는 실시예 1~3에서 수득한 잎새버섯 추출물의 미백효과를 확인하기 위해 티로시나제(tyrosinase)라는 효소의 기능이 억제되는 정도를 보고 미백효과를판단한 것이다.

티로시나제는 생체 내에서 티로신(tyrosine)이라는 물질의 산화과정을 촉진하여 멜라닌이 생성되게 도와주는 효소이다. 본 시험예에서는 이 효소의 기능을 억제하여 티로신이 산화되어 멜라닌이라는 흑색의 고분자를 형성하는 것을 억제하는 정도를 측정하는 방법(Pomerantz S.H., J. Biochem., 24:161-168, 1966)을 응용해 미백 효과를 판정하였다.

상백피 추출물, 알부틴, 잎새버섯 추출물의 GPC-1, GPS-1과 GPC-2, GPS-2를 시료로 사용하여 티로시나제 활성 억제효과를 조사하였다.

각 시료들의 티로시나제에 대한 저해활성은 시료 15㎕를 96 웰 플레이트에 넣고, 50mM 인산완충액(pH6.5) 150㎕, 1.5mM L-티로신 용액 25㎕를 넣은 후, 머쉬룸 티로시나제(1,500units/㎖, Sigma社 ) 10㎕를 첨가하여 37℃에서 20분간 반응시킨 후 마이크로플레이트 판독기(microplate reader, ELx800, 미국)를 사용하여 490㎚에서 흡광도를 측정하여 티로시나제에 대한 저해율을 측정하였다. 티로시나제에 대한 저해율(%)은 다음 식에 따라 계산하였으며, IC₅₀값은 티로시나제 효소 활성을 50% 저해하는 물질의 농도이다.

저해율(%) = {[(D-C)-(B-A)]/(D-C)}×100

A : 시료를 넣은 웰의 반응전 흡광도

B : 시료를 넣은 웰의 반응후 흡광도

C : 시료를 넣지 않은 웰의 반응전 흡광도

D : 시료를 넣지 않은 웰의 반응후 흡광도

티로시나제 활성 억제 효과를 시험한 결과 잎새버섯 추출물의 GPS-1의 IC₅₀값은 0.12%로 나타나 티로시나제 저해효과가 뛰어나다고 알려진 기존의 미백제인 알부틴, 상백피 추출물 등에 비해 매우 우수한 효과를 나타내었다(표 4 참조).

시료	머쉬룸티로시나제 저해효과(IC₅₀)
알부틴	0.4%
상백피 추출물	1.0%
GPC-1	1.0%
GPS-1	0.12%
GPC-2	0.2%
GPS-2	0.15%

[시험예 5] B16F1 멜라노싸이트를 이용한 멜라닌 생성 억제효과 측정 실험

본 시험예는 실시예 1 ~ 3에서 수득한 잎새버섯 추출물의 효과를 확인하기 위해 B16F1 멜라노싸이트에 대한 멜라닌 생성 억제 정도를 보고 미백효과를 판단한 것이다.

본 시험예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 마우스에서 유래한 세포주이며 멜라닌이라는 흑색색소를 분비하는 세포이다. 이 세포의 인공배양중에 시료를 처리하여 멜라닌 흑색색소가 감소하는 정도를 비교 평가하였다. 본 시험예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 ATCC(American Type Culture Collection, 기탁번호 : 6323)로부터 분양받아 사용하였다.

B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생합성 억제효과 측정은 다음과 같이 행하였다. B16F1 멜라노싸이트를 6 웰 플레이트에 각 웰당 2×10⁶농도로 분주하고 세포를 부착시킨 후, 독성을 유발하지 않는 농도로 시료를 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 72시간 배양 후 세포를 트립신-EDTA로 떼어낸 후 세포수를 측정한 다음 윈심분리하여 세포를 회수하였다.

세포내 멜라닌 정량은 Lotan(Cancer Res., 40:3345-3350, 1980)의 방법을 약간 변형하여 실시하였다. 셀 펠릿을 PBS로 1회 세척한 후 균질한 완충액(50mM 소듐포스페이트, pH 6.8, 1% Triton X-100, 2mM PMSF) 1ml을 첨가하여 5분간 와류하여 세포를 파쇄하였다. 원심분리(3,000rpm, 10분)하여 얻은 세포 여액에 1N NaOH(10% DMSO)를 첨가하여 추출된 멜라닌을 용해한 후 마이크로 플레이트 판도기로 405nm에서 멜라닌의 흡광도를 측정한 다음 멜라닌을 정량하여 시료의 멜라닌 생성 저해율(%)을 측정하였다. B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생성 저해율(%)은 다음 수학식에 의하여 계산하였으며, IC₅₀값은 멜라닌 생성을 50% 저해하는 물질의 농도이다.

저해율(%) = [(A-B)/A] ×100

A : 시료를 첨가하지 않은 웰의 멜라닌 양

B : 시료를 첨가한 웰의 멜라닌 양

B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생성 억제 효과를 시험한 결과 잎새 버섯 추출물의 GPS-1의 IC₅₀값은 0.1%로 나타나 기존의 미백제인 알부틴, 상백피 추출물 등에 비해 우수한 효과를 표 5에 나타내었다.

시료	멜라닌 생성 억제효과(IC₅₀)
알부틴	0.45%
상백피 추출물	0.5%
GPC-1	0.5%
GPS-1	0.1%
GPC-2	0.2%
GPS-2	0.5%

[시험예 6] 인체 피부를 대상으로 한 미백효능 시험

실시예 1∼3에서 얻은 잎새버섯 추출물을 함유한 화장료를 제조하여 사람을 대상으로 피부 미백효과를 비교예 1과 비교실험을 행하여 평가하였다. 비교실험에 사용된 화장료는 크림형태이고, 그 조성은 표 6에 나타낸 바와 같다. 우선 표 6에 기록되어 있는 나)상을 가열하여 70℃에 보존한다. 이것에 가)상을 가하여 예비유화 후 호모믹서로 균일하게 유화하고 다음에 서서히 냉각하여 크림(제조예 1,비교예 1)을 제조한다. 실험자(20세-35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽부위에는 제조예 1에서 제조된 크림을 얼굴 왼쪽부위에는 비교예 1에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다. 실험완료 후 얼굴 좌우 양편의 도포 부위 피부를 화상분석기 및 색차계로 얼굴색을 비교하여 가장 어두운 색을 5, 중간색을 3, 가장 환한 색을 1로 정하고 그 중간정도를 어림잡아 평가하였다. 표 6은 제조예 1에서 제조된 크림을 사용한 실험자의 안면 피부색을 비교예 1로 만든 크림을 사용한 실험자의 안면 피부색과 비교한 것이다.

표 7에 나타난 바와 같이 잎새버섯 추출물을 함유한 크림을 도포한 실험자의 안면 피부에서 미백효과가 우수함을 알 수 있다.

원료명	제조예 1(%)	비교예 1
(가)	스테아릴알콜	8	8
	스테아린산	2	2
	스테아린산콜레스테롤	2	2
	스쿠알란	4	4
	2-옥틸도데실알콜	6	6
	폴리옥시에틸렌(25몰부가)-알콜에스테르	3	3
	글리세릴모노스테아린산에스테르	2	2
(나)	잎새버섯 추출물	0.1	-
(나)	프로필렌 글리콜	5	5
	정제수	적량	적량

사용제품	제조예 1	비교예 1
실험인원번호	오른쪽 피부색	왼쪽 피부색
1	2	3
2	2	3
3	2.5	3.5
4	3	3
5	1.5	2.5
6	2	3
7	2.5	3
8	3	4
9	3	3
10	2	3
11	3	3
12	1.5	3
13	2	3.5
14	1.5	2.5
15	2.5	3.5
16	2	3
17	2.5	3
18	4	4
19	2.5	3
20	2.5	3

이상의 시험예에서 보는 바와 같이, 본 발명의 화장료 조성물에 함유되는 잎새버섯 균사체의 추출물은 피부세포 증식, 항산화 효과 및 콜라겐 생성 촉진, 피부노화 방지 및 미백효과를 갖는 물질임을 알 수 있다.

[시험예 7] 피검자 대상 피부주름 개선효과 비교

35∼45세의 안면주름이 있는 시험대상자 30명에 대하여, 하기 영양크림에 대하여 피부주름 개선효과를 비교평가하였다(잎새버섯 균사체 배양물은 실시예 1∼3에서 얻은 GPC-1과 GPS-1 또는 GPC-2와 GPS-2를 말한다.).

원료명	제조예 2	비교예 2
잎새버섯 균사체 배양물	2.0	-
밀납	10.0	10.0
폴리솔베이트 60	1.5	1.5
피오이 60 경화피마자유	2.0	2.0
솔비탄 세스퀸 올레이트	0.5	0.5
유동파라핀	10.0	10.0
스쿠알렌	5.0	5.0
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	5.0	5.0
글리세린	3.0	3.0
부틸렌글리콜	3.0	3.0
트리에탄올아민	0.2	0.2
방부제, 색소, 향료	적량	적량
정제수	잔량	잔량

[실험예]

피검자의 안면 좌부에는 제조예 2의 크림을, 우부에는 비교예 2의 크림을 3개월간 시용하도록 하였다. 크림 사용 이전의 안면 양쪽부의 피부상태를 측정해 놓은 후 크림 사용 3개월 후 동일부위를 재측정하여 피부주름의 변화를 측정하였다.피부측정은 24℃, 상대습도 40%의 항온항습실에서 수행하였으며, 눈꼬리 부위의 주름을 레플리카(replica)로 떠서 비지오미터 시스템(Visiometer system; C+K사)으로 피부 주름을 측정하였다. 피부 주름의 변화량을 다음 식에 따라 계산하였다.

변화량(Δ%)=(Tdi-Tdo)/Tdo ×100

Tdo; Do에서의 측정부위의 값

Tdi; D₉₀에서의 측정부위의 값

상기 식에 따라 계산한 결과, 잎새버섯 균사체 배양물을 포함하지 않은 비교예 2 크림의 경우 피부주름이 4.5±5.0%(평균±표준편차)의 감소치를 나타낸 반면, 잎새버섯 균사체 배양물을 포함한 제조예 2의 크림은 22±10%의 우수한 감소 효과를 나타내었다. 따라서, 본 발명의 잎새버섯 균사체 배양물을 함유하는 화장료 조성물은 피부 노화방지에 효과가 있음을 알 수 있다.

본 발명의 잎새버섯 균사체 배양액을 함유하는 피부 화장료 조성물의 구체적인 제형 예를 들면 다음과 같다. 한편, 여기서 잎새버섯 균사체 배양액은 실시예 1∼3에서 얻은 GPC-1과 GPS-1 또는 GPC-2와 GPS-2를 말하는 것이다.

제형예 1: 유연화장수(스킨로션)

원료명	중량%
잎새버섯 균사체 배양물	2.0
글리세린	3.0
부틸렌글리콜	2.0
프로필렌 글리콜	2.0
카르복시비닐폴리머	0.1
노닐페닐에테르	0.2
폴리솔베이트 80	0.4
에탄올	10.0
트리에탄올아민	0.1
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	잔량

제형예 2: 영양화장수(밀크로션)

원료명	중량%
잎새버섯 균사체 배양물	2.0
스쿠알렌	5.0
밀납	4.0
폴리솔베이트 60	1.5
솔비탄 세스퀴올레이트	1.5
유동파라핀	0.5
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	5.0
글리세린	3.0
부틸렌글리콜	3.0
프로필렌글리콜	3.0
카르복시비닐폴리머	0.1
트리에탄올아민	0.2
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	잔량

제형예 3: 마사지 크림

원료명	중량%
잎새버섯 균사체 배양물	2.0
밀납	10.0
폴리솔베이트 60	1.5
피오이 60 경화피마자유	2.0
솔비탄세스퀴올레이트	0.8
유동파라핀	40.0
스쿠알렌	5.0
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	4.0
글리세린	5.0
부틸렌글리콜	3.0
프로필렌글리콜	3.0
트리에탄올아민	0.2
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	잔량

이상에서 설명한 바와 같이, 피부 세포의 증식, 항산화효과 및 콜라겐의 생성효과와 멜라닌 생성억제 효과가 있는 잎새버섯 균사체 또는 그의 배양액으로부터 얻은 추출물을 화장료 조성물에 함유시킴으로써, 피부노화방지 및 미백에 효과적인 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

Claims

잎새버섯(Grifola frondosaFr) 균사체 추출물 또는 잎새버섯 균사체의 배양액으로부터 얻은 추출물을 함유하는, 피부 노화방지 효과 및 미백효과를 갖는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 잎새버섯 균사체 추출물 또는 잎새버섯 균사체의 배양액으로부터 얻은 추출물은 조성물 총중량에 대하여 0.00001∼30중량%의 양으로 함유함을 특징으로 하는 잎새버섯 균사체 추출물을 함유하는 화장료 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 균사체 또는 그의 배양액으로부터 얻은 추출물은 균사체에 증류수를 가하여 고온에서 수시간 동안 열수추출한 열수추출물 또는 균사체를 제거한 배양액에 알코올을 가하여 침전시켜서 얻은 침전물을 원심분리하여 얻은 것을 증류수에 녹여 고분자량 초여과막으로 여과시켜 저분자 물질을 제거한 것임을 특징으로 하는 잎새버섯 균사체 추출물을 함유하는 화장료 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 화장료 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 영양크림 또는 마사지크림의 제형을 가짐을 특징으로 하는 잎새버섯 균사체 추출물을 함유하는 화장료 조성물.