KR102227539B1 - 천연발효 추출물 혼합 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 한국에서 자생하는 천연식물들을 열수추출한 열수 추출물을 농축과 증류수를 일정비율로 혼합한 혼합물을 다단 발효시킨 복합발효물을 숙성시킨 숙성물을 농축시켜 제조한 천연 발효 추출물 혼합 조성물 및 이를 화장품 원료, 건강기능식품 원료, 바이오 천연 약물 원료 등으로 적용할 수 있는 발명에 관한 것이다.

Description

천연발효 추출물 혼합 조성물{Composition of mixed natural fermented extracts}
본 발명은 천연식물 추출물의 발효물을 유효성분으로 하는 천연발효 추출물 혼합 조성물, 이의 제조방법 및 이를 이용한 화장품 원료, 건강기능식품 원료 및/또는 바이오 천연 약물 원료에 관한 것이다.
노화를 설명하는 많은 가설 중에 특히 하만(Harman)에 의해 제안된 자유라디칼 이론(free radical theory)은 많은 주목을 받고 있다. 이 가설에 의하면 자유라디칼에 의한 연속적인 유해반응의 결과로 노화 과정이 진행된다.
이 후ROS(reactive oxygenspecies)가 세포 구성 성분의 산화적 손상을 축적시키는 원인임이 밝혀지고, 이를 토대로 산화스트레스 가설(oxidative stress theory)이 제안되었다.
ROS와 RNS(reactive nitrogen species)는 감염이나 염증반응에서 이 물질을 제거하는데 중요한 역할을 하지만 과다 생성되어 축적되면 이들의 파괴적 성향으로 인해 염증과 활성산소 및 활성질소 생성이 지속적으로 증폭되고, 결국 세포의 항상성 상실을 가져와 노화 및 암, 심장혈관질환, 관절염, 퇴행성 신경질환 등의 노인성 질환을 초래하게 된다.
강력한 활성산소 및 질소종을 제거할 수 있는 항산화 방어체계가 노화 및 노화관련 질환의 예방에 중요한 역할을 할 것으로 여겨지고 있다. 각종 질병 및 노화 등에 활성산소 및 과산화물이 직접적인 원인으로 작용한다는 사실이 밝혀지면서 노화 억제 및 질병과 관련된 항산화제에 대한 연구가 활발해지고 있다.
더불어 사회적으로 최근 생활 수준의 향상과 현대 의학의 진보에 따른 인간의 평균수명이 증가하고 있으며, 이에 따라 건강에 대한 관심과 함께 젊음과 아름다움에 대한 욕구가 증가하고 있는 실정이다.
이와 같은 분위기는 미용 분야 외에 의학, 식생활 분야에서까지 이어져 다양한 미용기술, 의술, 식품들이 개발되고 있으며, 또한 관련 분야의 많은 연구가 진행되고 있다.
최근 젊음과 아름다움에 대한 욕구가 증가하는 사회적 분위기를 반영하여, 인공적인 소재가 가미되지 않은 천연, 유기농, 자연주의 소재의 화장품, 건강기능식품, 천연 약물 소재에 대한 지속적인 개발이 이루어지고 있으며, 이러한 천연 소재를 이용한 새로운 제품에 대한 요구가 증가하고 있다.
대한민국 공개특허 10-2012-0010687호(공개일:2012.02.06) 대한민국 등록특허 10-1403523호(등록일: 2014.05.28)
본 발명자들은 다양한 시도와 연구를 통해 독성이 없으면서 신체 및 피부의 염증 등을 개선 및 방지하며, 신체와 피부에 유익한 성분을 다량 포함하여 노화를 방지할 수 있는, 천연식물을 이용한 조성물을 개발하였다. 즉, 본 발명의 목적은 화장료, 건강기능식품 및/또는 바이오 천연 약물의 기능성 소재(또는 원료)로 활용할 수 있는 천연식물을 이용한 천연발효 추출물 혼합 조성물을 제공하는데 있다.
상술한 과제를 해결하기 위한 본 발명은 천연발효 추출물 혼합 조성물에 관한 것으로서, 천연식물 복합 열수 추출물을 다단 발효시킨 발효물의 숙성물을 농축시킨 농축물을 포함한다.
본 발명의 다른 목적은 상기 천연발효 추출물 혼합 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 천연발효 추출물 혼합 조성물을 포함하는 화장료에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 천연발효 추출물 혼합 조성물을 포함하는 건강기능식품에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 천연발효 추출물 혼합 조성물을 포함하는 바이오 천연 약물에 관한 것이다.
본 발명의 천연발효 추출물 혼합 조성물은 피부 세포 독성이 없을 뿐만 아니라, 티로시나아제 활성 저해능, 멜라닌 생성 저하능 및 세포 내 NO 생성 억제율이 우수하며, 이를 이용하여 제조한 화장품은 피부 자극 등의 피부 트러블이 거의 없는 바, 피부 미백 효과가 우수한 기능성 천연 화장료를 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 티백(tea bag), 건조분말, 액상 형태로 가공하여 건강기능식품 원료 및/또는 바이오 천연 약물 원료로 제공할 수도 있다.
이하, 본 발명을 천연발효 추출물 혼합 조성물을 제조하는 방법을 통해 본 발명을 자세하게 설명한다.
본 발명의 천연발효 추출물 혼합 조성물은 천연식물 혼합 건조물을 열수 추출하여 열수 추출물을 제조하는 1단계; 상기 천연식물 복합 열수 추출물 및 증류수를 혼합한 혼합액을 다단 발효를 수행하여 발효물을 수득하는 2단계; 상기 발효물을 숙성시켜서 숙성물을 수득하는 3단계; 및 상기 숙성물을 농축과 동시에 증류 공정을 통한 농축액 및/또는 증류 추출수를 제조하는 4단계;를 포함하는 공정을 수행하여 제조할 수 있다.
또한, 4단계의 농축액을 살균 처리하는 5단계;를 더 포함할 수도 있다.
1단계의 상기 천연식물 혼합 건조물은 여러 천연식물을 건조시킨 건조물을 혼합한 후, 분쇄하여 수득한 분말일 수 있다.
상기 천연식물은 어성초, 쇠뜨기, 쇠비름, 오배자, 붉나무, 비누나무, 함초, 백작약, 숙지황, 천문동, 오미자, 목단피, 황금, 행인, 백부근, 섬가시오가피, 황칠, 가시엉겅퀴, 인삼, 지부자, 사상자, 형개, 고삼, 대황, 자초, 가자, 천화분, 지모, 백두옹, 금화규, 구기자, 당귀, 꾸지뽕의 잎과 줄기, 황기, 감초, 십자화과 및 동충하초 중에서 선택된 3종 이상을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 이들 중 5종 이상을 포함할 수 있고, 더욱 바람직하게는 7종 이상을. 더 더욱 바람직하게는 9종 이상을 포함할 수 있다.
바람직한 일 구현예를 들면, 오배자 100 중량부에 대하여, 함초 10 ~ 30 중량부, 백작약 5 ~ 15 중량부, 천문동 20 ~ 30 중량부, 황금 5 ~ 20 중량부, 인삼 1 ~ 10 중량부 및 대황 30 ~ 50 중량부를 포함할 수 있다. 이때, 상기 천연식물들은 건조 중량을 기준으로 한다.
또 다른 바람직한 일구현예를 들면, 쇠뜨기 100 중량부에 대하여, 붉나무 1 ~ 10 중량부, 숙지황 20 ~ 30 중량부, 목단피 20 ~ 30 중량부, 백부근 30 ~ 50 중량부, 섬가시오가피 20 ~ 40 중량부, 황칠 1 ~ 10 중량부, 지부자 10 ~ 20 중량부 및 당귀 5 ~ 20 중량부를 포함할 수 있다. 이때, 상기 천연식물들은 건조 중량을 기준으로 한다.
또 다른 다른 바람직한 일구현예를 들면, 오배자 100 중량부에 대하여, 쇠비름 1 ~ 10 중량부, 숙지황 5 ~ 10 중량부 , 가시엉겅퀴 15 ~ 35 중량부, 당귀 5 ~ 15 중량부, 천화분 10 ~ 20 중량부, 황기 30 ~ 45 중량부, 십자화과 1 ~ 10 중량부 및 황기 5 ~ 10 중량부를 포함할 수 있다. 이때, 상기 천연식물들은 건조 중량을 기준으로 한다.
또 다른 바람직한 일구현예를 들면, 쇠뜨기 100 중량부에 대하여, 어성초 1 ~ 5 중량부, 쇠비름 5 ~ 10 중량부, 붉나무 1 ~ 10 중량부, 비누나무 1 ~ 5 중량부, 함초 5 ~ 10 중량부, 백작약 1 ~ 5 중량부, 숙지황 20 ~ 30 중량부, 목단피 20 ~ 30 중량부, 백부근 30 ~ 50 중량부, 섬가시오가피 20 ~ 40 중량부, 황칠 1 ~ 10 중량부, 사상자 1 ~ 10 중량부, 형개 1 ~ 10 중량부, 지부자 10 ~ 20 중량부, 백두옹 0.5 ~ 5 중량부, 금화규 1 ~ 5 중량부, 당귀 5 ~ 20 중량부 및 꾸지뽕의 잎과 줄기 20 ~ 30 중량부를 포함할 수 있다. 이때, 상기 천연식물들은 건조 중량을 기준으로 한다.
1단계의 열수 추출은 당업계에서 사용하는 일반적인 열수 추출 방법을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 정제수 100 중량부에 대하여, 상기 천연식물 혼합 건조물 10 ~ 30 중량부를, 바람직하게는 12 ~ 28 중량부를, 더욱 바람직하게는 15 ~ 25 중량부를 혼합하여 원료를 준비하는 1-1단계; 상기 원료를 110℃ 하에서, 4 ~ 6시간 동안 증류추출을 수행하여 추출하여 추출물을 얻는 1-2단계; 상기 추출물을 1차 필터링(filtering)하여 얻은 1차 여과액을 제조하는 1-3단계; 및 상기 1차 여과액에 가열 및 교반한 후, 2차 필터링하여 천연 식물 복합 열수 추출물을 제조하는 1-3단계;의 공정을 수행하여 제조할 수 있다.
상기 1-3단계의 1차 필터링은 평균기공 20㎛ ~ 30㎛ 필터막으로 필터링을 수행할 수 있고, 바람직하게는 평균기공 23㎛ ~ 27㎛ 인 필터막으로 필터링을 수행할 수 있다.
또한, 상기 1-4단계의 2차 필터링은 평균기공 8㎛ ~ 15㎛ 필터막으로, 바람직하게는 8㎛ ~ 12㎛ 필터막으로 필터링을 수행할 수 있다.
다음으로, 2단계의 다단 발효는 혐기성균을 이용한 1차 발효, 호기성균을 이용한 2차 발효 및 광합성 미생물과 토양 미생물을 이용한 3차 발효를 수행하는데, 좀 더 구체적으로는 1단계에서 제조한 상기 천연식물 복합 열수 추출물 및 증류수를 혼합한 혼합액에 혐기성균을 접종한 후, 1차 발효를 수행하여 1차 발효액을 수득하는 2-1 단계; 1차 발효액을 필터링한 후, 필터링된 1차 발효액에 호기성균을 접종한 후, 2차 발효를 수행하여 2차 발효액을 수득하는 2-2단계; 및 2차 발효액을 필터링한 후, 필터링된 2차 발효액에 광합성 미생물과 토양미생물을 접종한 후, 3차 발효를 수행하여 3차 발효액을 수득한 후, 필터링하여 다단 발효공정을 수행한 발효물을 제조하는 2-3단계;를 포함하는 공정을 수행하다.
2-1단계의 상기 혼합액은 천연식물 복합 열수 추출물 및 증류수를 1 : 1 ~ 3 부피비로, 바람직하게는 1 : 1.5 ~ 2.5 부피비로, 더욱 바람직하게는 천연식물 복합 열수 추출물 및 증류수를 1 : 1.8 ~ 2.3 부피비 정도로 혼합하여 혼합액을 제조한다. 증류수를 혼합하는 이유는 열수 추출물을 희석하여 농도 및 점성을 낮추기 위한 것으로서, 열수 추출물의 농도가 너무 높으면 1차 발효를 위한 혐기성균의 접종이 고르게 되지 않아서 1차 발효(혐기성 발효)가 잘 이루어지지 않을 수 있기 때문이며, 증류수 부피비가 1 부피비 미만이면 1차 발효가 고르게 진행되지 않을 수 있고, 3 부피비를 초과하면 열수 추출물의 농도가 오히려 너무 낮아서 1차 발효가 충분하게 진행되지 않을 수 있다.
2-1단계의 1차 발효는 혐기성 발효로서, 상기 혼합액에 혐기성균을 접종한 후, 발효조에 투입 및 교반한 다음, 발효조를 밀봉시킨 후, 35 ~ 50℃, 바람직하게는 40 ~ 50℃ 온도에서 15일 ~ 20일간, 바람직하게는 18일 ~ 20일간 혐기성 발효를 수행한다.
그리고, 상기 혐기성균은 바실러스 속균(고초균), 누룩균을1 : 0.1 ~ 0.2 비율(CFU 비율)로 혼합한 혐기성 혼합 균주를 사용하며, 혼합액에 대해 1×103 ~ 1×105 cell/mL 정도를 접종시킨다.
그리고, 상기 바실러스속균(고초균)은 자연계에 널리 통성 혐기성 간균으로서 탈질, 철 환원, 망간산화 등에 관여하는 균으로서, 바실러스 리체니포르미스(Bacilluslicheniformis) F1017, 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) F1232, 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) F1267, 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) F1268, 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) F1200, 바실러스 푸미루스(Bacillus pumilus) F1337, 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) F1005, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) F1236 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) F1279 등을 사용할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 누룩균은 라이조푸스(Rhyzopus), 우사미(Usami) 및 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) 또는 아스퍼질러스 소재(Aspergillus sojae)을 사용할 수 있다.
다음으로, 2-2단계는 1차 발효액을 원심 분리하여 필터링하여 침전물 및 혐기성균 등을 제거하여 수득한 1차 발효액에 호기성균을 접종한 후, 2차 발효를 수행하여 2차 발효액을 수득하는 공정이다.
2차 발효는 필터링한 1차 발효액에 호기성균을 접종한 후, 발효조에 투입 및 교반한 다음, pH 5.5 ~ 6.5 및 15℃~ 40℃, 바람직하게는 pH 6.0 ~ 6.5 및 25℃ ~ 32℃에서 3일 ~ 5일간, 바람직하게는 4일 ~ 5일간 호기성발효를 수행한다. 호기성 발효는 밀폐된 곳이 아닌 오염되지 않은 공기가 통기량 0.05 ~ 0.5 VVM 정도로 유입되는 발효조(반응조)에서 수행한다.
그리고, 상기 호기성균은 마리노박터균과 효모균을 1 : 1 ~ 2 비율(CFU 비율)로 혼합한 호기성 혼합 균주를 사용하며, 1차 발효액에 대해 1×105 ~ 1×107 cell/mL 정도를 접종시킨다.
상기 발효균주 중 마리노박터(Marinobacter)는 바람직하게는 마리노박터 센글리엔시스(Marinobactershengliensis)일 수 있다. 상기 마리노박터 센글리엔시스는 그램-음성균이며, 호염성, 호기성간균으로 단일의 극성 편모를 가진다.
그리고, 상기 효모균은 사카로 마이세스(Saccharomyces sp.), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces sp.), 토룰로프시스(Torulopsis sp.), 로도토룰라(Rhodotorula sp.), 칸디다(Candida sp.), 흑효모균(aureobasidium pullulans) 및 스트렙토 코커스써모필러스(Streptococcusthermophiles) 중에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
다음으로, 2-3 단계는 2차 발효액을 원심 분리로 필터링하여 침전물 및 호기성균 등을 제거하여 수득한 2차 발효액에 광합성미생물 및 토양 미생물 중에서 선택된 1종 이상을 접종한 후, 3차 발효를 수행하여 3차 발효액을 수득한 후, 침전물 및 토양미생물 등을 다시 필터링하여 최종 다단 발효시킨 발효물을 수득하는 공정이다.
3차 발효는 필터링한 2차 발효액에 토양미생물을 1×103 ~ 1×105 cell/mL 정도로 접종한 후, 발효조에 투입 및 교반한 후, pH 5.5 ~ 7.0, 습도 60 ~ 80% 및15℃~25℃, 바람직하게는 pH 5.7 ~ 6.5, 습도 65 ~ 75%, 18℃~25℃ 및 무압 조건에서5일 ~ 7일간, 바람직하게는 5일 ~ 6일간 3차 발효를 수행한다.
상기 토양미생물은 버섯균 및 유산균 중에서 선택된 1종 또는 2종을 사용할 수 있다. 상기 버섯균은 식용으로 가능한 버섯균이라면 어느 것이나 가능하나, 바람직하게는 차가버섯 균류(Inonnotus-obliquus), 동충하초 균류(Cordycepssinensis, Paecilomyces japonica), 송이버섯 균류(Tricholomamatsutake), 상황버섯 균류(Phellinus linteus) 또는 영지버섯 균류(Ganodermalucidum)을 사용할 수 있다.
또한, 상기 유산균은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 스트렙토코쿠스(Streptococcus sp.), 류코노스톡(Leuconostoc sp.) 또는 비피도박테리아(Bifidobacteria sp.)을 사용할 수 있다.
2-1 ~ 2-3 단계의 다단 발효 공정을 수행함으로써, 천연식물 복합 열수 추출물 내 독성을 완화 내지 제거하고, 피부 및/또는 인체에 유익한 성분을 생성 및 활성화시킬 수 있다.
다음으로, 3단계는 다단 발효 공정을 수행하여 수득한 발효물을 3 ~ 10℃ 하에서 24 ~ 48 시간 동안, 바람직하게는 5 ~ 10℃ 하에서 32 ~ 48 시간 숙성시켜서 발효로 인해 발생한 성분 등을 안정화시키는 공정이다.
다음으로, 3단계의 숙성물을 농축과 동시에 증류 공정을 통한 농축액 또는 증류 추출수를 제조하는 공정으로서, 숙성물을 가열 중탕시켜서 농축물을 및/또는 증류 추출수를 수득할 수 있다.
상기 숙성물로부터 상기 농축물을 감압 농축하여 수득하는 경우, 감압 농축의 일례를 들면, 물 또는 탄소수 1~4의 무수 또는 함수 저급 알코올(예를 들어, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올 등), 상기 저급 알코올과 물의 혼합용매, 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름, 1,3-부틸렌글리콜, 헥산 또는 디에틸에테르 중 1종 이상을 용매를 숙성물과 혼합한 후, 50 ~ 80℃ 하에서 1 ~ 5시간 동안 감압 농축하여 농축물을 수득할 수 있다.
그리고, 4단계에서 제조된 농축물은 당업계에서 사용하는 일반적인 방법으로 살균 처리를 더 수행할 수도 있다.
그리고, 4단계의 농축물 또는 5단계의 살균 처리된 농축물은 인체 및/또는 피부 독성이 없으면서 티로시나아제 활성 저해능 및 멜라닌 생성 저하능이 우수하다. 또한, 이를 이용하여 제조한 화장품은 피부 자극 등의 피부 트러블이 거의 없는 바, 피부 미백 효과가 우수한 기능성 천연 화장료를 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 티백(tea bag), 건조 분말, 액상 형태로 가공하여 건강기능식품으로 제공할 수도 있다.
앞서 설명한 본 발명의 천연발효 추출물 혼합 조성물을 화장료 조성물로 이용한 구체적인 예를 들면 다음과 같다.
천연발효 추출물 혼합 조성물을 화장료 조성물(또는 화장품)은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형으로 제조할 수 있다. 예컨대, 유연화장수 또는 영양 화장수 등의 화장수; 훼이셜 로션, 바디로션 등의 유액; 영양크림, 수분크림, 아이크림 등의 크림; 에센스; 화장연고; 스프레이; 젤; 팩; 선스크린; 메이크업 베이스; 액체 타입, 고체 타입 또는 스프레이 타입 등의 파운데이션; 파우더; 클렌징 크림, 클렌징 로션, 클렌징 오일 등의 메이크업 제거제; 또는 클렌징폼, 비누, 바디워시 등의 세정제로 제형화 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 화장료 조성물(또는 화장품)은 각각의 제형에 있어서 상기 필수성분 외에 제형의 종류 또는 사용 목적 등에 따라 본 발명에 따른 목적을 저해하지 않는 범위 내에서 다른 성분들이 적절히 배합될 수 있다.
상기 화장료 조성물(또는 화장품)은 통상적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있으며, 예컨대 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 허용 가능한 담체는 제형에 따라 달리할 수 있다. 예컨대, 연고, 페이스트, 크림 또는 젤로 제형화될 때 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있다
상기 화장료 조성물(또는 화장품)은 파우더 또는 스프레이로 제형화될 때, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄하이드록사이드, 칼슘실케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있고, 스프레이의 경우 클로로플루오로하이드로카본, 프로판, 부탄 또는 디메틸에테르와 같은 추진제를 더 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물(또는 화장품)은 용액 또는 유탁액으로 제형화될 때, 담체성분으로서 용매, 용해화제, 또는 유탁화제가 사용될 수 있고, 예컨대물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸카보네이트, 에틸아세테이트, 벤질벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-브틸글리콜 오일이 사용될 수 있고, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수배종 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 사용될 수 있다.
상기 화장료 조성물(또는 화장품)은 현탁액으로 제형화될 때, 담체성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴알코올, 폴리옥시에틸렌소르비톨에스테르 및 폴리옥시에틸렌소르비탄에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄메타하이드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 사용될 수 있다.
상기 화장료 조성물(또는 화장품)이 비누로 제형화될 때, 담체성분으로서 지방산의 알칼리금속염, 지방산 헤미에스테르염, 지방산 단백질 하이드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알코올, 식물성유, 글리세롤, 당 등이 사용될 수 있다.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기로 하지만, 하기 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니며, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로 해석되어야 할 것이다.
[실시예]
실시예 1 :천연발효 추출물 혼합 조성물의 제조
(1) 천연 식물 복합 열수 추출물의 제조
하기 표 1과 같은 조성을 가지는 천연식물 혼합 건조물을 혼합한 후, 분쇄하여 분말화된 천연식물 혼합 건조물을 준비하였다. 다음으로, 정제수 100 중량부에 대하여 천연식물 혼합 건조물 19.5 중량부를 혼합하여 원료를 준비하였다.
다음으로, 상기 원료를 100 ~ 110℃ 하에서, 약 4시간 동안 증류 추출을 수행하여 추출하여 추출물을 수득하였다.
다음으로, 상기 추출물을 평균기공 25㎛인 필터막으로 필터링하여 1차 여과액을 얻었다.
다음으로, 상기 여과액에 1,2-헥산디올 2 ml을 첨가한 다음 충분하게 교반한 후, 교반액을 평균기공 10㎛인 필터막으로 2차 필터링을 수행하여 천연 식물 복합 열수 추출물을 제조하였다. 수득한 천연 식물 복합 열수 추출물은 진한 갈색(brown) 액체였다.
구분 중량부 구분 중량부
쇠뜨기 100 섬가시오가피 28 ~ 29
어성초 2.5 ~ 2.8 황칠 3 ~ 4
쇠비름 6.3 ~ 6.5 사상자 4 ~ 5
붉나무 5.0 ~ 5.5 형개 2 ~ 3
비누나무 2.5 ~ 2.8 지부자 15 ~ 16
함초 7.5 ~ 8.0 백두옹 1 ~ 1.2
백작약 1.5 ~ 2.0 금화규 2.5 ~ 3
숙지황 25 ~ 26 당귀 8 ~ 9
목단피 22 ~ 23 꾸찌뽕의 잎과 줄기 22 ~ 23
백부근 41 ~ 42 - -
(2) 다단 발효 및 숙성을 통한 천연발효 추출물 혼합 조성물의 제조
천연 식물 복합 열수 추출물을 증류수와 1 : 2 부피비로 혼합하여 혼합액을 제조하였다.
다음으로, 상기 혼합액에 바실러스 속균(고초균) 및 누룩균을 1 : 0.15 비율(CFU 비율)로 혼합한 혐기성 혼합 균주 약 1×104 cell/mL 정도를 접종시킨 후, 발효조에 투입한 다음 서서히 교반시켜 주었다. 이때, 상기 바실러스 속균은 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) F1232를 사용하였으며, 누룩균은 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae)를 사용하였다.
그리고, 발효조를 밀봉시킨 후 45 ~ 48℃ 온도에서 20일간 혐기성 발효를 수행하였다.
다음으로, 혐기성 발효를 완료한 발효액을 원심 분리하여 침전물 및 혐기성균 등을 필터링하여 수득한 1차 발효액에 마리노박터균과 효모균을 1 : 1.4 비율(CFU 비율)로 혼합한 호기성 혼합 균주 약 1×106 cell/mL 정도를 접종시킨 후, 발효조에 투입 및 서서히 교반시켰다. 이때, 마리노박터균은 마리노박터 센글리엔시스(Marinobactershengliensis)를 사용하였으며, 효모균은 사카로 마이세스(Saccharomyces sp.)와 흑효모균(aureobasidium pullulans)을 사용하였다.
그리고, 발효조를 pH 6.0 ~ 6.5 및 27℃ ~ 30℃에서 5일간 호기성 발효를 수행한다. 이때, 호기성 발효는 밀폐된 곳이 아닌 오염되지 않은 공기가 통기량 0.15 ~ 0.20 VVM 정도로 유입되는 발효조(반응조)에서 수행하였다.
다음으로, 호기성 발효를 완료한 발효액을 원심 분리하여 침전물 및 호기성균 등을 필터링하여 수득한 2차 발효액에 유산균인 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)와 송이버섯 균류(Tricholomamatsutake)의 혼합 균주를 1×104 cell/mL 정도를 접종한 후, 발효조에 투입 및 서서히 교반시켰다.
그리고, pH 6.0 ~ 6.3, 습도 65 ~ 75%, 18 ~ 22℃ 및 무압 조건에서 6일간 3차 발효를 수행하였다.
다음으로 3차 발효된 발효물을 필터링하여 침전물을 제거한 후, 필터링한 발효물을 6 ~ 8℃ 하에서 42 시간 동안 숙성시켰다.
다음으로, 숙성물을 물과 혼합한 후, 60 ~ 65℃ 하에서 2시간 동안 감압 농축하여 농축물을 수득하였고, 상기 농축물을 저온 살균처리하여 최종 천연발효 추출물 혼합 조성물을 제조하였다.
비교예 1
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 천연발효 추출물 혼합 조성물을 제조하되, 다단 발효시 1차 발효(혐기성 발효)를 수행하지 않고, 동일한 조건, 시간 동안 2차(호기성 발효) 및 3차 발효를 수행하여 천연발효 추출물 혼합 조성물을 제조하였다.
비교예 2
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 천연발효 추출물 혼합 조성물을 제조하되, 다단 발효시 2차 발효(호기성 발효)를 수행하지 않고, 동일한 조건, 시간 동안 1차(혐기성 발효) 및 3차 발효를 수행하여 천연발효 추출물 혼합 조성물을 제조하였다.
비교예 3
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 천연발효 추출물 혼합 조성물을 제조하되, 다단 발효시 3차 발효를 수행하지 않고, 동일한 조건, 시간 동안 1차(혐기성 발효) 및 2차 발효(호기성 발효)만을 수행하여 천연발효 추출물 혼합 조성물을 제조하였다.
실험예 1 :천연발효 추출물 혼합 조성물의 티로시나아제저해 활성 측정
실시예 1에서 제조한 천연발효 추출물 혼합 조성물의 티로시나아제 저해 활성 확인하기 위한 실험을 수행하였고, 그 결과를 하기 표 3 ~ 표 4에 나타내었다. 측정값은 3회 측정한 평균값이다.
측정 방법 및 사용장비는 하기 표 2와 같으며, 티로시나아제 활성 저해율(%)은 하기 수학식 1에 의해 계산하였다.
측정 방법
1) 시료인 천연발효 추출물 혼합 조성물과 양성군(positive control)인 베타-알부틴(β-arbutin)을 농도 별로 희석하여 준비한다.2) 0.1M PBS(sodium phosphate buffer, pH 6.5) 110㎕에 시료 또는 베타-알부틴10 ㎕를 첨가한 다음 1500 U/mL 티로신 산화효소(Mushroom tyrosinase, T3824-50KU, SIGMA) 10 ㎕와 1.5mM L-티로신(L-Tyrosine, T3754, SIGMA) 20㎕를 첨가한다.
3) 37℃에서 10분간 반응시킨다.
4) 490nm에서 흡광도를 측정한다.
사용 장비
1) Multi-reader (synergy HTX, BioTek) 2) Ice maker (NC-313, NEOT)
3) Microbalance (ARG4202, OHAUS)
4) CO2 Incubator (Heracell 150i, Thermo)
[수학식 1]
티로시나아제 활성 저해율(Tyrosinase inhibition, %) = 100-(b-b'/a-a')×100(%)
수학식 1에서, a는 공시료액의 반응 후의 흡광도이고, b는 시료액의 반응 후의 흡광도이며, a' 및 b' 각각은 티로신 산화효소(Mushroom tyrosinase) 대신 완충액으로 대체하여 측정한 흡광도이다.
양성군(베타-알부틴)의 티로시나아제 활성 저해율(%) 통계분석
(p-value)
농도(㎍/㎖) 평균 표준편차
0 0.00 0.91 -
7.8125 3.22 0.41 0.0133
15.625 6.34 0.87 0.0011
31.25 8.56 1.13 <0.001
62.5 17.07 2.10 0.0036
125 47.12 1.57 <0.001
250 69.61 1.34 <0.001
500 82.59 0.52 <0.001
천연발효 추출물 혼합 조성물의 티로시나아제 활성 저해율(%)
농도(㎍/㎖) 실시예 1 비교예 1 비교예 2 비교예 3
0 0.00 0.00 0.00 0.00
0.0625 0.31 0.00 0.23 0.16
0.125 4.74 0.58 3.85 3.02
0.25 5.02 0.67 4.81 3.89
0.5 8.88 1.52 5.26 4.72
1 9.65 2.88 7.04 5.84
2 16.37 3.53 12.84 9.37
4 26.43 6.09 19.71 14.89
티로시나아제 저해 활성을 가지는 것으로 알려진 β-알부틴을 양성대조군으로 한 티로시나아제 저해 활성 확인 시험 결과인 표 2 를 살펴보면, 시험농도 범위에서 농도의존적인 티로시나아제(mushroom tyrosinase) 저해 활성을 나타내어(IC50 : 167.27 μg/mL), 본 시험 과정에 문제가 없음을 확인할 수 있었다.
그리고, 표 3을 살펴보면, 실시예 1의 천연발효 추출물 혼합 조성물은 0.125 ~ 4 ㎍/㎖ 농도 범위에서 농도의존적인 티로시나아제 저해 활성 효과를 보임을 확인할 수 있었다.
그리고, 1차 발효(혐기성 발효)를 수행하지 않은 비교예 1의 경우, 실시예 1 및 비교예 2 ~ 3과 비교할 때, 티로시나아제 활성 저해 효과가 매우 미비한 것을 확인할 수 있었다.
또한, 2차 발효(호기성 발효)를 수행하지 않은 비교예 2 및 3차 발효를 수행하지 않은 비교예 3의 경우, 농도의존적인 티로시나아제 저해 활성 효과를 보이나, 실시예 1과 비교할 때, 티로시나아제 활성 저해 효과가 상대적으로 떨어지는 결과를 보였다.
그리고, 상기 실시예 1 및 비교예 1 ~ 3의 티로시나아제 저해 활성 효과 측정 결과를 통해, 혐기성 발효(1차 발효) 및 토양미생물(3차 발효)에 의해 티로시나아제 활성 저해 성분이 다량 발생함을 확인할 수 있었다.
실험예 2 : 천연발효 추출물 혼합 조성물의 세포 독성 및 멜라닌 생성 저해 활성 측정
실시예 1 및 비교예 1 ~ 3에서 제조한 천연발효 추출물 혼합 조성물의 멜라닌 생성 저해 활성 확인 실험을 수행하였다.
(1) 세포 배양
B16-F10 멜로마(melanoma) 세포를 10% FBS(fetal bovine serum), 1% 페니실린/스트렙토마이신(Penicillin/Streptomycin)이 첨가된 DMEM 배지로 세포수가 5×105 cells/dish가 되도록 배양한다. 150mm 세포배양접시(cell culture dish)를 사용하여 37℃, 5% CO2 배양기(incubator)에서 배양한다. 컨플루언스(Confluence)에 도달한 세포는 트립신-EDTA(Trypsin-EDTA)를 사용하여 계대 배양하여 유지한다.
(2) 세포 생존율 실험(WST assay)
세포생존율은 물질이 가지는 독성을 체외 배양되는 세포의 생존율을 이용하여 확인하는 시험법으로서, 세포의 생존율 확인은 생존세포 내의 미토콘드리아 NADH 탈수효소 활성(mitochondrial NADH-dehydrogenase activity)에 의해 테트라졸리윰염(tetrazolium salt)의 4개의 질소로 이루어진 테트라졸모이티(tetrazole moiety)가 환원되어 유색의 포르마잔(formazan)으로 전환되는 원리를 이용하여 확인할 수 있다.
기질인 WST(Water Soluble Tetrazolium Salt)는 물에 잘 녹는 높은 WST로써 살아있는 세포의 탈수소효소(Dehydrogenase)와 반응하여 오렌지색의 수용성 포르마잔(formazan)을 생성한다.
WST와 반응하는 탈수소효소(Dehydrogenase)는 대사적으로 왕성한 활동을 하는 세포의 미토콘드리아 전자전달계에 존재하는 효소로써 살아있는 세포에만 유효하다.
따라서, 포르마잔(formazan)의 생성은 살아있는 세포수와 직선 상관관계를 가지며, 이는 흡광도(450 nm)를 측정함으로써 확인할 수 있다.
세포 생존율 실험(WST assay) 측정 방법은 하기 표 5에 나타내었으며, 세포 생존율(%)은 하기 수학식 1에 의거하여 계산하였다.
1) B16-F10 멜라노마(melanoma) 세포 를96 well cell culture plate에 5×103 cells/well 농도로 DMEM 배지(10% FBS, 1 % Penicillin/Streptomycin)를 이용해 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양한다.
2) 시료와 양성대조군 베타-알부틴(β-arbutin)를 DMEM 배지에 희석하여 농도별로 준비한다.
3) 24시간 배양한 세포의 배양액을 제거한 후 DPBS 100 ㎕로 세척한다.
4) 농도 별로 희석하여 준비한 시료를100 ㎕씩 처리한다.
5) 37℃, 5% CO2 배양기에서 48시간 배양한다.
6) 10% WST 시약을 제조한다.(Ez-cytox : DMEM= 1 : 9)
7) 48시간 배양한 세포의 배양액을 제거한 후DPBS 100 ㎕로 세포를 세척한다.
8) 10 % WST 시약을 각 well에 100㎕씩처리한다.
9) 37℃, 5% CO2 배양기에서 2시간 배양한 후450 nm에서 흡광도를 측정하여 세포생존율을 구한다.
10) 무처리군 대비 세포 생존율이 90% 이상인 경우 세포 독성이 없는 것으로 판단하며, 90% 미만인 경우는 세포 독성이 있는 것으로 판단한다.
[수학식 1]
세포 생존율(cell viability, %) = (시료 첨가군의 흡광도/무처리군 흡광도)×100(%)
그리고, 세포 생존율 측정 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
천연발효 추출물 혼합 조성물 농도(㎍/㎖) 천연발효 추출물 혼합 조성물에 대한 세포 생존율
(세포 독성)(%)
실시예 1 비교예 1 비교예 2 비교예 3
0 100 100 100 100
6.25 101.04 99.72 99.99 100.20
12.5 102.36 99.31 99.96 101.21
25 103.71 98.75 99.67 105.22
50 99.75 97.07 99.03 99.91
100 99.28 93.12 97.34 98.77
200 97.29 87.95 94.47 96.02
400 88.97 76.73 85.80 88.14
표 6의 세포 생존율 측정 결과를 살펴보면, 실시예 1의 천연발효 추출물 혼합 조성물 시료는 무처리군에 비교했을 때, 200 ㎍/mL 이하 농도 범위에서 B16-F10 멜로노마 세포가 90 % 이상, 바람직하게는 95% 이상 생존하는 것으로 확인되었다.
이에 반해, 1차 발효(혐기성 발효)를 수행하지 않은 비교예 1의 경우, 세포 독성이 있는 문제가 있었으며, 2차 발효(호기성 발효)를 수행하지 않은 비교예 2의 경우, 비교예 1 보다는 세포 생존율이 높으나, 실시예 1과 비교할 때는 다소 낮은 세포 생존율을 보여, 세포 독성이 다소 있는 결과를 보였다.
하지만, 3차 발효를 수행하지 않은 비교예 3의 경우, 실시예 1과 거의 유사 범위의 세포 생존율을 보였다.
이를 통해, 혐기성 및 호기성 발효에 의해 천연 발효 추출물 혼합 조성물 내 세포 독성 유발 물질 함량이 감소됨을 확인할 수 있었다.
(3) B16-F10 멜라노마 세포의 멜라닌 생성에 미치는 영향 측정
양성대조군인 β-알부틴과 실시예 1, 비교예 2 ~ 3의 천연발효 추출물 혼합 조성물 시료를 대상으로 B16-F10 멜라노마 세포의 내, 외부에 생성되는 멜라닌량에 미치는 영향을 확인 실험을 수행하였다.
천연발효 추출물 혼합 조성물 농도(㎍/㎖) B16-F10 멜라노마 세포 총 멜라닌 생성억제율(%)
β-알부틴 실시예1 비교예 2 비교예3
Control+α-MSH - 0 0 0
12.5㎍/㎖ - -0.75 -2.38 -0.12
25㎍/㎖ - 2.96 1.28 1.89
50㎍/㎖ - 4.21 3.07 3.91
100㎍/㎖ - 18.62 9.87 14.32
200㎍/㎖ 46.21 29.62 14.75 19.34
상기 표 7의 멜라닌 생성 억제율 측정 결과를 살펴보면, 양성대조군인 β-알부틴의 경우, α-MSH 처리를 통해 생성되는 세포내/외 총멜라닌 생성을 46.21% 저해하는 것으로 확인되었다.
그리고, 실시예 1의 천연발효 추출물 혼합 조성물 시료의 경우, 50 ~ 200 ㎍/mL 처리 농도 범위에서 농도 의존적으로 세포내/외 총멜라닌 생성을 저해하는 것으로 확인되었으며, 특히 200 ㎍/mL 처리 농도에서 세포 내/외 총멜라닌 생성을 29.62% 저해하는 것을 확인하였다.
이에 반해, 2차 발효(호기성 발효)를 수행하지 않은 비교예 2 및 3차 발효를 수행하지 않은 비교예 3의 경우 실시예 1에 비해 총멜라닌 생성을 저해 효과가 크게 떨어지는 결과를 보였으며, 호기성 발효를 수행하지 않은 비교예 2에 비해 비교예 3이 총멜라닌 생성 저해 효과가 상대적으로 우수한 결과를 보였은데, 이를 통해 호기성 발효에 의해 천연발효 추출물 혼합 조성물 내 미백 향상 성분이 다량 발생하는 것을 확인할 수 있었으며, 실시예 1과 비교예 3를 통해 3차 발효를 통해 미백 향상 성분 발생에 대한 시너지 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
실험예 3 : NO 생성 억제 측정
(1) 시험물질처리
RAW 264.7 세포를 2×106 cells/dish density로 60mm 플레이트(plate)에 분주하여 24시간 동안 플레이트에 부착시켰다. 염증반응을 유발하기 위해 1㎍/㎖ 농도의 LPS(lipopolysaccharide)와 시험 물질을 함유한 새로운 배지를 처리하여 24시간 배양하였다.
(2) 일산화질소(NO) 생성 억제 측정 실험
RAW 264.7 세포에서 생성되어 배양액에 존재하는 NO 수준을 그리스(Griess) 반응을 기본으로 하는 NO 디텍션키트(detection kit, intron사의21021)를 사용하여 측정하였다. NO가 존재한다고 추정되 는배양액을 96 웰-플레이트(well plate)에 100㎕씩 분주한 후, N1 버퍼(sulfanilamide) 50㎕를 넣어 10분간 실온에서 반응시킨다. 이어서, N2 버퍼(naphthylethylenediamine) 50㎕를 넣고 10분간 실온에서 반응시킨 후 540nm에서 흡광도 측정하였으며, 각 NO 생성량은 아질산염기준(nitrite standard)를 이용하여 얻은 표준검량곡선을 이용하여 산출하였다. 양성대조군(Positive control)은 L-NMMA 50μM(NG-Methyl-L-arginine acetate salt, 시그마사의 M7033)을 사용하였다.
그리고, NO 생성억제율은 하기 수학식 2에 의거하여 계산하였다.
[수학식 2]
NO 생성억제율(%) = (A-B)/A × 100%
수학식 2에서, A는 NO 활성억제제 내 추출물 농도가 0%일 때 RAW264.7 세포에서의 NO 생성량(100%)이고, B는 NO 활성억제제 내 추출물의 특정 농도에서의RAW264.7 세포에서의 NO 생성량(%) 측정값이다.
하기 표 7의 측정 결과는 3회 반복 실험한 평균값을 나타낸 것이며, 대조군(추출물 0 중량%)을 기준으로 상대적으로 측정한 수치이다.
NO(대조군기준%) / NO 생성억제율(%) 0
중량%		 0.125
중량%		 0.25
중량%		 0.5
중량%		 1
중량%		 2
중량%
대조군 100%
/0%		 - - - - -
양성대조군(L-NMMA 50μM) 39.2%
/60.8%		 - - - - -
실시예 1 - 72.8%/27.2% 69.7%/
30.3%		 67.5%/
32.5%		 65.5%/
34.5%		 68.1%/
31.9%
비교예 1 - 90.9%/
9.1%		 88.7%/
11.3%		 78.9%/
12.1%		 86.7%/
13.3%		 85.8%/
14.2%
비교예 2 - 84.3%/15.7% 79.1%/
20.9%		 77.9%/
22.1%		 76.8%/
23.2%		 76.1%/
23.9%
비교예 3 - 80.3%/19.7% 75.4%/
24.6%		 74.7%/
25.3%		 72.2%/
27.8%		 72.5%/
27.5%
상기 표 8의 측정 결과를 살펴보면, 양성대조군인 L-NMMA는 50 μM 농도 범위에서 RAW264.7 세포의 NO 생성을 약 60.8% 정도 저해시켰다.
실시예 1의 경우, 0.25 ~ 2 중량% 범위에서 30% 이상의 NO 생성억제율을 보였다. 다만, 2중량% 사용시, 1중량% 보다 NO 생성억제율이 감소하는 경향을 보였다.
하지만, 1차 발효(혐기성 발효)를 수행하지 않은 비교예 1의 경우, 실시예 1 및 비교예 2 ~ 3과 비교하여 NO 생성 억제 효과가 크게 떨어지는 문제가 있음을 확인할 수 있었다.
그리고, 비교예 1 ~ 비교예 3을 통하여, 혐기성, 호기성 및 토양미생물을 순차적으로 3차 발효시키는 것이 천연발효 추출물 혼합 조성물이 NO 생성억제 물질 함량 증대에 효과적임을 확인할 수 있었다.
그리고, 이 실험을 통하여, 본 발명의 천연발효 추출물 혼합 조성물 함염증 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
상기 실시예 및 실험예를 통하여, 본 발명의 천연발효 추출물 혼합 조성물은 피부 세포 독성이 거의 없으면서, 티로시나아제 활성 저해능, 멜라닌 생성 저하능 및 세포 내 NO 생성 억제율이 우수함을 확인할 수 있었으며며, 이러한 본 발명의 조성물을 기능성 천연 화장료, 건강기능식품 등의 다양한 기능성 제품으로 제공할 수 있다.

Claims (10)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 천연식물 복합 열수 추출물을 다단 발효시킨 발효물의 숙성물을 농축시킨 농축물을 포함하며,
    상기 천연식물 복합 열수 추출물은 천연식물 혼합 건조물을 열수 추출시켜서 수득한 열수 추출물이고,
    상기 천연식물 혼합 건조물은 쇠뜨기 100 중량부에 대하여, 어성초 1 ~ 5 중량부, 쇠비름 5 ~ 10 중량부, 붉나무 1 ~ 10 중량부, 비누나무 1 ~ 5 중량부, 함초 5 ~ 10 중량부, 백작약 1 ~ 5 중량부, 숙지황 20 ~ 30 중량부, 목단피 20 ~ 30 중량부, 백부근 30 ~ 50 중량부, 섬가시오가피 20 ~ 40 중량부, 황칠 1 ~ 10 중량부, 사상자 1 ~ 10 중량부, 형개 1 ~ 10 중량부, 지부자 10 ~ 20 중량부, 백두옹 0.5 ~ 5 중량부, 금화규 1 ~ 5 중량부, 당귀 5 ~ 20 중량부 및 꾸지뽕의 잎과 줄기 20 ~ 30 중량부를 포함하며,
    상기 발효물은 혐기성균을 이용한 1차 발효, 호기성균을 이용한 2차 발효 및 토양 미생물을 이용한 3차 발효를 포함하는 다단 발효 공정을 수행한 발효물을 포함하고,
    상기 혐기성균은 바실러스 속균 및 누룩균을 1 : 0.1 ~ 0.2 비율(CFU 비율)로 혼합한 혐기성 혼합 균주를 포함하며,
    상기 호기성균은 마리노박터균과 효모균을 1 : 1 ~ 2 비율(CFU 비율)로 혼합한 호기성 혼합 균주를 포함하고,
    상기 토양 미생물은 버섯균 및 유산균 중에서 선택된 1종 또는 2종을 포함하는 것을 특징으로 하는 천연발효 추출물 혼합 조성물.
  4. 제3항의 천연발효 추출물 혼합 조성물을 포함하는 화장료.
  5. 제3항의 천연발효 추출물 혼합 조성물을 포함하는 건강기능식품.
  6. 천연식물 혼합 건조물을 열수 추출하여 열수 추출물을 제조하는 1단계;
    상기 천연식물 복합 열수 추출물 및 증류수를 혼합한 혼합액을 다단 발효를 수행하여 발효물을 수득하는 2단계;
    상기 발효물을 3 ~ 10℃ 하에서 24 ~ 48 시간 동안 숙성시켜서 숙성물을 수득하는 3단계; 및
    상기 숙성물을 농축시켜서 농축액을 제조하는 4단계;를 포함하는 공정을 수행하며,
    상기 다단 발효는
    1단계에서 제조한 상기 천연식물 복합 열수 추출물 및 증류수를 1 : 1 ~ 3 부피비로 혼합한 혼합액에 혐기성균을 접종한 후, 40 ~ 50℃에서 15~20일간 1차 발효를 수행하여 1차 발효액을 수득하는 2-1 단계;
    1차 발효액을 필터링한 후, 필터링된 1차 발효액에 호기성균을 접종한 후, pH 5.5 ~ 6.5 및 15~40℃에서 3~5일간 2차 발효를 수행하여 2차 발효액을 수득하는 2-2단계; 및
    2차 발효액을 필터링한 후, 필터링된 2차 발효액에 광합성 미생물과 토양미생물을 접종한 후, 3차 발효를 수행하여 3차 발효액을 수득한 후, 필터링하여 다단 발효공정을 수행한 발효물을 제조하는 2-3단계;를 포함하는 공정을 수행하고,
    상기 천연식물 혼합 건조물은 쇠뜨기 100 중량부에 대하여, 어성초 1 ~ 5 중량부, 쇠비름 5 ~ 10 중량부, 붉나무 1 ~ 10 중량부, 비누나무 1 ~ 5 중량부, 함초 5 ~ 10 중량부, 백작약 1 ~ 5 중량부, 숙지황 20 ~ 30 중량부, 목단피 20 ~ 30 중량부, 백부근 30 ~ 50 중량부, 섬가시오가피 20 ~ 40 중량부, 황칠 1 ~ 10 중량부, 사상자 1 ~ 10 중량부, 형개 1 ~ 10 중량부, 지부자 10 ~ 20 중량부, 백두옹 0.5 ~ 5 중량부, 금화규 1 ~ 5 중량부, 당귀 5 ~ 20 중량부 및 꾸지뽕의 잎과 줄기 20 ~ 30 중량부를 포함하며,
    상기 발효물은 혐기성균을 이용한 1차 발효, 호기성균을 이용한 2차 발효 및 토양 미생물을 이용한 3차 발효를 포함하는 다단 발효 공정을 수행한 발효물을 포함하고,
    상기 혐기성균은 바실러스 속균 및 누룩균을 1 : 0.1 ~ 0.2 비율(CFU 비율)로 혼합한 혐기성 혼합 균주를 포함하며,
    상기 호기성균은 마리노박터균과 효모균을 1 : 1 ~ 2 비율(CFU 비율)로 혼합한 호기성 혼합 균주를 포함하고,
    상기 토양 미생물은 버섯균 및 유산균 중에서 선택된 1종 또는 2종을 포함하는 것을 특징으로 하는 천연발효 추출물 혼합 조성물의 제조방법.
  7. 제6항에 있어서, 1단계의 열수 추출은 정제수 100 중량부에 대하여 천연식물 혼합 건조물 20 ~ 40 중량부를 혼합하여 원료를 준비하는 1-1단계;
    상기 원료를 110℃ 하에서, 4 ~ 6시간 동안 증류 추출을 수행하여 추출하여 추출물을 얻는 1-2단계;
    상기 추출물을 1차 필터링(filtering)하여 얻은 1차 여과액을 제조하는 1-3단계; 및
    상기 1차 여과액에 가열 및 교반한 후, 2차 필터링하여 천연 식물 복합 열수 추출물을 제조하는 1-4단계;를 포함하는 공정을 수행하는 것을 특징으로 하는 천연발효 추출물 혼합 조성물의 제조방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제6항에 있어서, 4단계의 농축액을 살균 처리하는 5단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 하는 천연발효 추출물 혼합 조성물의 제조방법.

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