KR101810141B1 - 락토바실러스 플란타룸 hk 균주 및 이를 이용하여 제조된 와라타 발효 추출물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 락토바실러스 플란타룸 HK 균주 및 이를 이용한 와라타 발효 추출물에 관한 것이다.
본 발명으로부터 제공되는 신규한 락토바실러스 플란타룸 HK(Lactobacillus plantarum HK) 균주(기탁번호:KCCM12135P)를 이용하여 와라타(Telopea speciosissima) 추출물에 접종하고, 배양하는 단계를 통해 와라타 발효 추출물을 제조할 경우, 항산화, 미백, 주름 개선 및 피부장벽 개선능이 우수하기 때문에, 이를 유효 성분으로 화장료 베이스에 적용하였을 때 화장료 조성물로서의 효과가 우수하다.

Description

락토바실러스 플란타룸 HK 균주 및 이를 이용하여 제조된 와라타 발효 추출물{Lactobacillus plantarum HK and Telopea speciosissima Fermented extract Manufactured Using Thereof}

본 발명은 락토바실러스 플란타룸 HK(Lactobacillus plantarum HK) 균주 및 이를 이용하여 제조된 와라타 발효 추출물에 관한 것이다.

와라타(Waratha) 꽃나무는 호주의 뉴 사우스 웨일즈 지역이 원산지인 전통 토착식물이다. 상록관목으로 프로테아과(proteaceae) 텔로페아속(Telopea)으로 분류되며, 텔로페아(Telopea speciosissima)라는 학명의 꽃식물 종이다. 일반적으로 와라타 외에도 "New South Wales Waratah(뉴 사우스 웨일즈 와라타)" 라고도 부른다. 와라타는 호주 국가를 상징하는 꽃이기도 하다. 그리스어의 "멀리서도 보이는"이라는 뜻의 "Telopos"와 아름다운이라는 뜻의 라틴어 "Speciosus"에서 파생된 말로 의미는 "멀리서도 보이는 아름다운 꽃"이라는 뜻이며, 현재 쓰이는 "와라타" 라는 이름은 호주 원주민들이 부르는 이름으로, 빨간 꽃을 피우는 나무라는 의미를 가진다. 와라타 꽃나무는 높이 3~4m, 수간 폭 2m 로 성장하는 관목으로 짙은 녹색의 잎이 나며, 봄에 크고 붉은 색의 꽃송이가 가장 유명하다. 와라타는 원주민의 민간요법으로 많이 사용해온 꽃으로 일반 꽃보다 약 10배나 많은 꽃 수술로 다양한 활성성분과 천연 보습인자가 들어있어 오랜 시간 유익하게 사용해 온 식물이다.

한편, 당류를 발효하여 에너지를 획득하고 다량의 락트산을 생성하는 세균을 총칭하여 유산균(Lactic acid bacteria)이라고 한다. 유산균은 장내에 서식하면서 인체의 소화계와 공생을 하며 섬유질 및 복합 단백질을 분해하여 중요한 영양성분으로 만드는 역할을 담당한다. 또한, 장내 환경을 산성으로 유지시킴으로 유해세균의 성장을 억제하고 설사 및 변비 개선, 비타민 합성, 혈중 콜레스테롤 저해 등의 역할을 한다. 유산균은 장의 점막과 상피세포에 강하게 결합할 수 있는 특성이 있어 정장작용에 많은 도움을 주며, 대식세포 및 비장의 활성을 증진하여 면역반응에 관여하는 물질을 분비 및 촉진하는 효과를 나타낸다. 또한, 면역 조절 기능도 가지고 있어 아토피 및 알러지 관련 질환에 효과가 있다.

화장품 분야에서는 유산균 배양액이 1955년 상품화된 이후 현재까지 사용되고 있는데 주로 스트랩토코커스(Streptococcus) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 락토코커스(Lactococcus) 속, 류코노스톡(Leuconostoc) 속, 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속 등을 이용하여 직접 배양액에 발효하여 여과하거나 추출하는 등의 원료 형태 및 활성 소재에 접종하여 발효한 후 여과하거나 추출하는 등의 연구가 활발하게 이루어지고 있다. 특히, 유용성과 안전성을 모두 갖춘 유익균으로 알려진 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)은 락토바실러스 속 유산균으로 사람의 장내에 상재하며, 항균·항산화·콜레스테롤 저하 효과를 가지며, 항염 작용, 면역 증강 작용에도 관여하는 매우 유용한 균주로서 유제품이나 건강기능식품, 화장품 등 다방면의 산업에서 유익하게 활용되고 있다.

락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)을 이용하여 다양한 용도에 적용되고 있는 기술로는, 대한민국 등록특허공보 제10-1776511호「락토바실러스 플란타룸으로 발효시킨 향나무 열매 배양액의 리스테리아 항균조성물」, 대한민국 등록특허공보 제10-1757623호「락토바실러스 플란타룸 KCC-10 및 이를 포함하는 조성물」, 대한민국 등록특허공보 제10-1750468호「락토바실러스 퍼멘툼 MG901 또는 락토바실러스 플란타룸 MG989를 포함하는 조성물」등이 개시되어 있다.

이에, 본 발명자들은 락토바실러스 플란타룸 HK(Lactobacillus plantarum HK) 균주(기탁번호:KCCM12135P)를 분리 동정하였고, 이를 이용하여 와라타(Telopea speciosissima) 추출물에 접종하고, 배양하는 단계를 통해 와라타 발효 추출물을 제조할 경우, 항산화, 미백, 주름 개선 및 피부장벽 개선 효과를 부여할 수 있다는 사실을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

대한민국 등록특허공보 제10-1776511호 대한민국 등록특허공보 제10-1757623호 대한민국 등록특허공보 제10-1750468호

본 발명의 목적은 DPPH 자유라디칼 소거능, 멜라닌(Melanin) 생성 저해능, 엘라스타아제(Elastase) 저해 활성 및 필라그린(Filaggrin) 생성 증대능을 갖는 신규한 균주를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 신규한 균주를 와라타(Telopea speciosissima) 추출물에 접종하고, 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 와라타 발효 추출물의 제조방법 및 이로부터 제조된 와라타 발효 추출물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 와라타 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 DPPH 자유라디칼 소거능, 멜라닌(Melanin) 생성 저해능, 엘라스타아제(Elastase) 저해 활성 및 필라그린(Filaggrin) 생성 증대능을 갖는 락토바실러스 플란타룸 HK(Lactobacillus plantarum HK) 균주(기탁번호:KCCM12135P)를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 균주는 건포도 유래인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸 HK(Lactobacillus plantarum HK) 균주(기탁번호:KCCM12135P)를 와라타(Telopea speciosissima) 추출물에 접종하고, 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 와라타 발효 추출물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 배양은 30 ~ 37 ℃에서 3 ~ 7일 동안 수행되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸 HK(Lactobacillus plantarum HK) 균주(기탁번호:KCCM12135P)로 발효된 와라타 발효 추출물을 제공한다.

또한, 본 발명은 와라타 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은 항산화, 미백, 주름 개선 및 피부장벽 개선용으로 구성된 군으로부터 선택되는 용도인 것을 특징으로 한다.

본 발명으로부터 제공되는 신규한 락토바실러스 플란타룸 HK(Lactobacillus plantarum HK) 균주(기탁번호:KCCM12135P)를 이용하여 와라타(Telopea speciosissima) 추출물에 접종하고, 배양하는 단계를 통해 와라타 발효 추출물을 제조할 경우, 항산화, 미백, 주름 개선 및 피부장벽 개선 효과가 우수하기 때문에, 이를 유효 성분으로 화장료 베이스에 적용하였을 때 화장료 조성물로서의 효과가 우수하다.

도 1는 락토바실러스 플란타룸 HK(Lactobacillus plantarum HK) 균주(기탁번호:KCCM12135P)의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 2은 와라타 추출물(발효 전) 및 와라타 발효 추출물(발효 후)의 B16-F10 멜라노마 세포에 대한 세포독성 평가를 나타낸 그래프이다.
도 3은 와라타 추출물(발효 전) 및 와라타 발효 추출물(발효 후)의 HaCat 각질세포에 대한 세포독성 평가를 나타낸 그래프이다.
도 4는 와라타 추출물(발효 전) 및 와라타 발효 추출물(발효 후)의 DPPH 자유라디칼 소거 활성을 나타낸 그래프이다.
도 5는 와라타 추출물(발효 전) 및 와라타 발효 추출물(발효 후)의 세포외 멜라닌 생성 저해 활성을 나타낸 그래프이다.
도 6은 와라타 추출물(발효 전) 및 와라타 발효 추출물(발효 후)의 엘라스타제(Elastase) 저해 활성을 나타낸 그래프이다.
도 7은 와라타 추출물(발효 전) 및 와라타 발효 추출물(발효 후)의 필라그린(Filaggrin) 생성능을 나타낸 그래프이다.

이에, 본 발명에서는 건포도로부터 분리된 미생물로부터 DPPH 자유라디칼 소거능, 멜라닌(Melanin) 생성 저해능, 엘라스타아제(Elastase) 저해 활성 및 필라그린(Filaggrin) 생성 증대능을 갖는 균주를 스크리닝하여 우수한 균주를 선발하고, 16s rRNA 염기서열 분석을 실시한 결과, 락토바실러스(Lactobacillus) 속(genus)에 속하는 신규 미생물임을 확인하였다. 이에, 락토바실러스 플란타룸 HK(Lactobacillus plantarum HK) 균주로 명명하고 2017년 10월 20일자로 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 기탁하였다.

따라서, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸 HK(Lactobacillus plantarum HK) 균주(기탁번호:KCCM12135P)(이하 'HK'로 약칭함)에 관한 것이다.

이때, 상기 HK 균주는 건포도 유래인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 HK 균주를 와라타(Telopea speciosissima) 추출물에 접종하고, 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 와라타 발효 추출물의 제조방법에 관한 것이다.

상기 와라타 추출물은 와라타 열수 추출물, 와라타 유기용매 추출물 또는 유기용매 추출물의 분획물인 것을 특징으로 한다. 즉, 와라타를 80 ~ 100 ℃에서 6 ~ 48 시간 동안 열수 추출하거나, 25 ~ 80 ℃에서 1 ~ 7 일 동안 유기용매에 침지하여 추출하는 방법 또는 유기용매 추출물을 분획하는 방법 중에서 선택된 적어도 하나의 추출 방법을 사용하여 추출된 것이 추출물의 수율을 가장 효과적으로 향상시킬 수 있는 측면에서 바람직하다.

상기 HK 균주를 와라타 추출물에 1.0~10⁷ CFU 로 접종하고, 배양하는 단계는 30 ~ 37 ℃에서 3 ~ 7일 동안 수행되는 것을 특징으로 한다. 만일, 배양 온도 및 시간이 상기 범위를 벗어날 경우에는 발효균주의 배양조건이 맞지 않아 충분한 항산화, 미백, 주름 개선 및 피부장벽 개선 효과를 나타낼 수 없을 뿐만 아니라, 균주 증식이 되지 않기 때문에 바람직하지 않다.

또한, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸 HK(Lactobacillus plantarum HK) 균주(기탁번호:KCCM12135P)로 발효된 와라타 발효 추출물에 관한 것이다.

상기 와라타 발효 추출물은 항산화, 미백, 주름 개선 및 피부장벽 개선 효과가 있어 화장료 조성물로서의 효과가 매우 우수하다.

따라서, 본 발명은 와라타 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

상기 화장료 조성물은 항산화, 미백, 주름 개선 및 피부장벽 개선용으로 구성된 군으로부터 선택되는 용도인 것일 수 있다.

본 발명의 항산화, 미백, 주름 개선 및 피부장벽 개선용 화장료 조성물은 피부외용연고, 크림, 유연화장수, 영양화장수, 팩, 에센스, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 트리트먼트, 젤, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지 크림, 영양크림, 아이크림, 모이스처 크림, 핸드 크림, 파운데이션, 영양에센스, 선스크린, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디 로션 및 바디 클렌저로 이루어지는 군으로부터 선택된 제형을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들 각 제형의 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 항산화, 미백, 주름 개선 및 피부장벽 개선용 화장료 조성물에서, 상기 와라타 발효 추출물은 상기 조성물의 총 중량을 기준으로 0.01 내지 90 중량% 함유되어 있을 수 있고, 바람직하게는 3 내지 15 중량% 함유되어 있을 수 있으나, 바람직한 항산화, 미백, 주름 개선 및 피부장벽 개선 효과를 제공할 수 있는 유효량을 포함한다면 이에 제한되지 않는다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1> 유산균주의 분리 및 선발

먼저, 건포도 시료로부터 유용한 기능을 갖는 유산균을 분리하기 위해, 건포도를 MRS 배지에 정치배양한 시료를 10진 희석법으로 10^-2, 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6으로 희석한 후 Bromopurple blue 0.002%를 첨가한 MRS 배지(프로티오스 펩톤(Proteose peptone) No. 3. 10g, 쇠고기 추출물(Beef extract) 10g, 효모 추출물(Yeast extract) 5.0g, 덱스트로오스(Dextrose) 20g, 폴리소르베이트 80(Polysorbate 80) 1.0g, 시트르산암모늄(Ammonium citrate) 2.0g, 아세트산나트륨(Sodium acetate) 5.0g, 황산마그네슘(Magnesium sulfate) 0.1g, 황산망간(Manganese sulfate) 0.05g, 디포타슘포스페이트(Dipotassium phosphate) 2.0g, 한천(agar) 15.0g / 1L, Difco, USA)에 도말하여, 주변에 노란색 환을 형성하는 콜로니(Colony)를 유산균 속 후보군을 분리하였다. 분리된 균주들 중 DPPH 자유라디칼 소거능, 멜라닌(Melanin) 생성 저해능, 엘라스타아제(Elastase) 저해 활성 및 필라그린(Filaggrin) 생성 증대능 실험을 통해 가장 효능이 우수한 HK 균주를 선발하였다.

<실시예 2> 선발균주 16s rRNA 염기서열 분석

최종 선발된 HK 균주의 gDNA와 Universal primer인 서열번호 1: 27F(5' AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG 3')와 서열번호 2: 1492R(5' TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACTT 3')을 이용하여 PCR을 수행한 다음, 16S rDNA sequence 분석을 수행하여 염기서열(서열번호 3)을 확인하였다.(도 1) 16s rDNA sequencing 결과를 바탕으로 NCBI에서 제공하는 BLAST search를 통하여 상동성 분석을 수행하였다. 상동성 분석 결과 분리 균주는 락토바실러스(Lactobacillus) 속(genus)에 속하는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)와 98.99%의 유사성을 갖는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 락토바실러스 플란타룸 HK(Lactobacillus plantarum HK)으로 명명하였고, 국제미생물특허 기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 2017년 10월 20일자로 기탁하고, 기탁번호 KCCM12135P를 부여받았다.

<실시예 3> 와라타 발효 추출물 제조

와라타는 서호주 지역과 태즈매니아 섬 지역의 생화 공급사로부터 구입하여 준비하였다. 정제수와 글리세린을 1:1 비율로 와라타 중량 대비 4배 침지시킨 후, 실온에서 7일 동안 추출하였다. 추출물은 여과지 (PEARL FILTRATION GNY4-50 50 Micron bag, food grade)로 여과하여 제조하였다.

다음으로, MRS 액체 배지에 상기 와라타 추출물(1중량%, 5중량%)을 첨가한 다음, 121℃에서 15분 동안 멸균시킨 후 활성화된 HK를 1.0 X 10⁷CFU로 접종하여 발효 최적조건하에 37℃에서 5일 동안 정치배양하여 최종 와라타 추출물이 1% 함유된 발효 추출물('HF1%'로 약칭함) 및 와라타 추출물이 5% 함유된 발효 추출물('HF5%'로 약칭함)을 제조하였다.

<실시예 4> 세포독성 시험 : WST assay

실시예 3으로부터 제조된 와라타 추출물 및 와라타 발효 추출물의 세포에 대한 자극성을 확인하기 위해 B16-F10 멜라노마 세포와 각질세포(HaCat)를 대상으로 세포독성 실험을 진행하였다.

B16-F10 멜라노마 세포(ATCC^ⓡ CRL 6475™)와 각질세포(HaCat)는 96 well plate(Corning 3590)에 5X10^{^3}/well로 배양하였다. 와라타 추출물 및 와라타 발효 추출물을 농도별로 처리하고 48시간 이후에 DMEM media에 10% EZ-Cytox(대일, 99-EZ3000)을 혼합하여 시료 처리한 Media를 Suction한 후 1well당 100ul씩 분주하였다. 2시간 배양 후 마이크로플레이트 리더기(Microplate reader; Biotek, Synergy HT)로 450nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

세포 생존율은 시료를 처리하지 않은 처리군(무처리군)과 비교하여 아래의 수학식 1을 이용하여 계산하였다.

[수학식 1]

세포 생존율(%) = (시료 처리군의 흡광도 / 무처리군의 흡광도) X 100

그 결과, 도 2~3에 나타난 바와 같이 와라타 추출물과 와라타 발효 추출물(HF5% 및 HF1%)은 모두 B16-F10 멜라노마 세포와 각질세포(HaCat)에서 세포 독성이 나타나지 않아 발효 후에도 화장품에 안전한 소재로 사용이 가능함을 확인하였다.

<실시예 5> 항산화 효능 시험 : 자유라디컬 생성 저해 활성

실시예 3으로부터 제조된 와라타 추출물 및 와라타 발효 추출물의 항산화 효과를 평가하기 위해 DPPH의 자유라디칼 소거능 실험을 진행하였다.

1mM DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl, Sigma D9132-1G, USA)는 에탄올 내에서 프리라디칼을 생성한다. 에탄올 0.20㎕과 100μM DPPH 200㎕에 와라타 추출물 및 와라타 발효 추출물을 농도별로 첨가하였다. 10초간 강하게 교반하고, 약 5℃에서 30분 동안 보관한 다음, 520nm에서 흡광도를 측정하였다. 비타민 C인 Ascorbic Acid를 양성 대조군으로 사용하여 흡광도를 측정하고, 자유 라디칼 소거능을 아래의 수학식 2를 이용하여 계산하였다.

[수학식 2]

자유 라디칼 소거능(%) = (100-(시료 처리군의 흡광도/시료 무처리군의 흡광도)) X 100

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 와라타 추출물은 자유라디칼 소거 활성이 전혀 없음을 확인하였다. 반면, HF5%는 4% 적용 시 57.44%의 자유라디칼 소거능을 나타내었고, IC₅₀ 값이 3.28%인 것으로 확인 되었으며, HF1%는 4% 적용 시 60.88%의 자유라디칼 소거능을 나타내었고, IC₅₀ 값이 3.06%인 것으로 확인되었다. 따라서, 와라타 추출물 대비 와라타 발효 추출물이 HK 균주에 의한 발효과정을 거쳐 항산화 효과가 증진된 것을 확인하였다.

<실시예 6> 미백 효능 시험 : 세포외 멜라닌 분석

실시예 3으로부터 제조된 와라타 추출물 및 와라타 발효 추출물의 미백 효능을 확인하기 위해 세포외 멜라닌 생성 저해 효능을 확인하였다. B16-F10 멜라노마 세포는 6well에 1.2X10^{^5}/well로 배양하였다. 24시간 동안 배양한 이후, 멜라닌 분비를 유도하기 위해 α-MSH(Sigma M4135)를 50nM로 처리하였고 동시에 와라타 추출물 및 와라타 발효 추출물을 농도별로 각각 세포에 처리하였다. 이때, 멜라닌 분석을 위해 페놀이 없는 DMEM media(10% FBS, 페니실린(100 unit/ml), 스트렙토마이신(100 ug/ml))를 사용하였다. 시료 처리 48~60시간 후 세포와 배양액을 15ml Conical tube에 옮긴 후 상온에서 3,000RPM에서 10분간 원심분리를 진행하였다. 세포 외 멜라닌 분석을 위해 세포의 배양액을 96 well plate(Corning 3595)에 1well 당 100ul씩 농도별로 총 4well을 분주한 후 마이크로 플레이트 리더기로 450nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 시료를 넣지 않은 경우를 대조군으로 하여 아래의 수학식 3을 이용하여 계산하였다.

[수학식 3]

세포 외 멜라닌 함량(%)= (시료를 처리군의 흡광도 / control군의 흡광도) X 100

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 와라타 추출물은 4% 처리 시 멜라닌 함량이 74.12% 이상으로 멜라닌 생성 저해능이 약 25.88%를 나타내었다. 반면, HF5%는 4% 처리 시 멜라닌 함량이 35.75% 이상으로 멜라닌 생성 저해능이 약 64.26%을 나타내었으며, IC₅₀ 값이 3.49%인 것으로 확인되었다. 또한, HF1%는 멜라닌 함량이 26.79% 이상으로 멜라닌 생성 저해능이 약 73.21%을 나타내었으며, IC₅₀ 값이 2.75%인 것으로 확인되었다. 따라서, 와라타 추출물 대비 와라타 발효 추출물이 HK 균주에 의한 발효과정을 거쳐 미백 효과가 증진된 것을 확인하였다.

<실시예 7> 항주름 효능 시험 : 엘라스타아제(Elastase) 저해 활성

실시예 3으로부터 제조된 와라타 추출물 및 와라타 발효 추출물을 다양한 농도로 희석한 시료를 10mM Tris-HCl buffer(pH8.0)에 녹인 1.6 mM N-석시닐-알라닌-알라닌-알라닌-p-니트로아닐라이드(N-succinyl-(Ala) 3-p-nitroanilide)(S4760, Sigma) 200㎕를 첨가한 후, 10mM Tris-HCl buffer(pH 8.0)에 녹인 효소 0.4U/mL의 Elastase from porcine pancreas Type Ⅳ(E0258, Sigma)를 40㎕ 첨가하여 25℃에서 5분 동안 반응시킨 후 분광분석기 410nm에서 흡광도를 측정하였다. 엘라스타아제 저해활성은 시료를 넣지 않은 경우를 대조군으로 하여 아래의 수학식 4를 이용하여 계산하였다.

[수학식 4]

엘라스타제 저해활성(%) = 100-(시료 처리군의 흡광도/시료 무처리군의 흡광도 X 100)

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이 와라타 추출물은 엘라스타제 저해 활성이 전혀 없음을 확인하였다. 반면, HF5%는 4% 처리 시 엘라스타제 저해 활성이 약 87.36%을 나타내었으며, IC₅₀값이 1.96%인 것으로 확인되었다. 또한, HF1%는 4% 처리 시 엘라스타제 저해 활성이 약 86.70%을 나타내었으며, IC₅₀값이 2.08%인 것으로 확인되었다. 따라서, 와라타 추출물 대비 와라타 발효 추출물이 HK 균주에 의한 발효과정을 거쳐 주름 개선 효과가 증진된 것을 확인하였다.

<실시예 8> 피부장벽 개선 시험 : 필라그린(Filaggrin) 생성 증대 효과

실시예 3으로부터 제조된 와라타 추출물 및 와라타 발효 추출물의 피부장벽 기능 개선효과를 측정하기 위해서 표피의 각질층 분화와 자연보습인자 형성에 중요한 역할을 하는 물질인 필라그린(Filaggrin)의 생성 증대능을 RT-PCR로 확인하였다. 인간 표피 각질형성세포(Human epidermal keratinocyte)를 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), 10% Fetal bovine serum(FBS), 1% Penisilin-Streptomycin와 함께 24well에 2x10⁵/well로 37℃, 5% CO₂의 조건에서 24시간 배양하였다. 인간 표피 각질형성세포가 80% 이상 Confluence될 때 Serum-free medium을 바꿔 배양한 뒤, 와라타 추출물 및 와라타 발효 추출물을 농도별로 각각 세포에 처리하였다. 그 후 24시간 추가 배양하여 필라그린(Filaggrin) 유전자 발현을 Real-time PCR법으로 확인하였다. RNA isolation과 cDNA 합성은 Nucleospin RNA(Cat.no MN740955-50)을 사용하였다. 배지를 제거한 세포를 DBPS(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline)으로 세척하고, Nucleospin RNA 매뉴얼에 따라 RNA Isolation 하였다. 분리된 RNA를 cDNA Synthesis kit(Gendepot)을 사용하여 합성한 뒤, 필라그린(Filaggrin) 유전자 발현을 분석하기 위하여 합성된 cDNA를 Template로 하여 2X IQ Sybr Green SuperMIX(Bio-Rad)를 사용하여 진행하였다. 발현율은 Housekeeping genes(beta-actin)으로 Normalization하였다. qRT-PCR 조건은 Polymerase activation과 DNA denaturation은 95℃에서 3분 동안 수행하고, Amplication은 94℃에서 15초 동안 수행하고, Denaturation, Annealingdms은 62℃에서 30초 동안 수행하고, Extension은 72℃에서 30초의 조건에서 30 cycle 수행하였다. 필라그린(Filaggrin)의 RT-PCR에 사용한 프라이머는 서열번호 4: For(5'- GCTGAAGGAACTTCTGGAAAAG-3')와 서열번호 5: Revers(5'- GCCAACTTGAATACCATCAGAAG-3')이고, 베타-액틴의 qRT-PCR에 사용한 프라이머는 서열번호 6: For(5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3')와 서열번호 7: Revers(5'-CTCCTTAATGTCACGCACGATTC-3')와 같다.

그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이 와라타 추출물은 필라그린(Filaggrin)생성 증대능이 확인되지 않았다. 반면, HF5%는 4% 처리 시 필라그린(Filaggrin) 생성 증대능이 202%를 나타내었고, HF1%는 4% 처리 시 필라그린(Filaggrin) 생성 증대능이 261%를 나타내었다. 따라서, 와라타 추출물 대비 와라타 발효 추출물이 HK 균주에 의한 발효과정을 거쳐 피부장벽의 기능이 상승된 것을 확인하였다.

<제조예 1> 와라타 발효 추출물을 함유하는 화장료 제조

(1) 화장수 제조

하기 표 1에 기재된 조성으로부터 통상의 방법에 의하여 화장수를 제조하였다.

성분	함량(중량%)
실시예 3 (와라타 발효 추출물)	3.00
히드록시에틸렌셀룰로오스(2% 수용액)	12.00
잔탄검(2% 수용액)	2.00
1,3-부틸렌글라이콜	6.00
글리세린	4.00
히알루론산나트륨(1% 수용액)	5.00
정제수	68.00
합계	100.00

(2) 로션 제조

하기 표 2에 기재된 조성으로부터 통상의 방법에 의하여 로션을 제조하였다.

성분	함량(중량%)
실시예 3 (와라타 발효 추출물)	3.00
아스코르빈산-2-인산마그네슘염	1.00
수용성 콜라겐 (1% 수용액)	1.00
시트르산나트륨	0.01
시트르산	0.05
1,3-부틸렌글리콜	3.00
정제수	91.94
합계	100.0

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

한국미생물보존센터(KCCM) KCCM12135P 20171020

<110> GFC Co., Ltd HANKOOK COSMETICS MANUFACTURING CO.,LTD C&I RESEARCH LAB. <120> Lactobacillus plantarum HK and Telopea speciosissima Fermented extract Manufactured Using Thereof <130> P17189 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal primer 27F <400> 1 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal primer 1492R <400> 2 tacggytacc ttgttacgac tt 22 <210> 3 <211> 1486 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus plantarum HK <400> 3 ggccactggc ggcgtgccta tacatgtcag tcgaacgaac tctggtattg attggtgctt 60 gcatcatgat ttacatttga gtgagtggcg aactggtgag taacacgtgg gaaacctgcc 120 cagaagcggg ggataacacc tggaaacaga tgctaatacc gcataacaac ttggaccgca 180 tggtccgagc ttgaaagatg gcttcggcta tcacttttgg atggtcccgc ggcgtattag 240 ctagatggtg gggtaacggc tcaccatggc aatgatacgt agccgacctg agagggtaat 300 cggccacatt gggactgaga cacggcccaa actcctacgg gaggcagcag tagggaatct 360 tccacaatgg acgaaagtct gatggagcaa cgccgcgtga gtgaagaagg gtttcggctc 420 gtaaaactct gttgttaaag aagaacatat ctgagagtaa ctgttcaggt attgacggta 480 tttaaccaga aagccacggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa 540 gcgttgtccg gatttattgg gcgtaaagcg agcgcaggcg gttttttaag tctgatgtga 600 aagccttcgg ctcaaccgaa gaagtgcatc ggaaactggg aaacttgagt gcagaagagg 660 acagtggaac tccatgtgta gcggtgaaat gcgtagatat atggaagaac accagtggcg 720 aaggcggctg tctggtctgt aactgacgct gaggctcgaa agtatgggta gcaaacagga 780 ttagataccc tggtagtcca taccgtaaac gatgaatgct aagtgttgga gggtttccgc 840 ccttcagtgc tgcagctaac gcattaagca ttccgcctgg gggagtacgg ccgcaaggct 900 gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa 960 gctacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac atactatgca aatctaagaa gattagacgt 1020 tcccttcggg gacatggata caggtggggg catgggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaaa 1080 tggtggggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttattat cagttgccag cattaagttg 1140 ggcactctgg tgagactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat 1200 catgcccctt atgacctggg ctacacacgt gctacaatgg atggtacaac gagttgcgaa 1260 ctcgcgagag taagctaatc tcttaaagcc attctcagtt cggattgtag gctgcaactc 1320 gcctacatga agtcggaatc gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc 1380 ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc attagagttt gtaacaccca aagtcggtgg 1440 ggtaaccttt taggaaccag ccgccctaat ggggacagat gtgggg 1486 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Filaggrin primer For <400> 4 gctgaaggaa cttctggaaa ag 22 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Filaggrin primer Revers <400> 5 gccaacttga ataccatcag aag 23 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta actin primer For <400> 6 gtggggcgcc ccaggcacca 20 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta actin primer Revers <400> 7 ctccttaatg tcacgcacga ttc 23

Claims (7)

1. DPPH 자유라디칼 소거능, 멜라닌(Melanin) 생성 저해능, 엘라스타아제(Elastase) 저해 활성 및 필라그린(Filaggrin) 생성 증대능을 갖는 락토바실러스 플란타룸 HK(Lactobacillus plantarum HK) 균주(기탁번호:KCCM12135P).
   
2. 제1항에 있어서, 상기 균주는 건포도 유래인 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타룸 HK(Lactobacillus plantarum HK) 균주(기탁번호:KCCM12135P).
   
3. 락토바실러스 플란타룸 HK(Lactobacillus plantarum HK) 균주(기탁번호:KCCM12135P)를 와라타(Telopea speciosissima) 추출물에 접종하고, 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 와라타 발효 추출물의 제조방법.
   
4. 제3항에 있어서, 상기 배양은 30 ~ 37 ℃에서 3 ~ 7 일 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 와라타 발효 추출물의 제조방법.
   
5. 락토바실러스 플란타룸 HK(Lactobacillus plantarum HK) 균주(기탁번호:KCCM12135P)로 발효된 와라타 발효 추출물.
   
6. 제5항의 와라타 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
7. 제6항의 상기 화장료 조성물은 항산화, 미백, 주름 개선 및 피부장벽 개선용으로 구성된 군으로부터 선택되는 용도인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.

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