KR101757623B1 - 락토바실러스 플란타룸 kcc-10 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신규한 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주 KCC-10 (KACC91785P) 및 이를 이용한 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 상기 락토바실러스 플란타룸 KCC-10 (KACC91785P) 의 항균 활성을 이용하여 다양한 항균용 조성물을 제공하며, 특히 총체보리 사일리지 제조용 미생물 첨가제를 제공한다. 본 발명의 균주를 이용하여 제조된 식물체 사일리지는 가축의 소화율을 개선할 수 있고, 항균 효과가 우수하며, 풍미 개선으로 기호성을 향상시킬 수 있어 가축의 품질을 높일 수 있다.
Description
본 발명은 신규한 락토바실러스 플란타룸 균주 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 항곰팡이 활성이 우수한 신규한 락토바실러스 플란타룸 균주 및 이를 이용한 품질이 개선된 사일리지에 관한 것이다.
조사료는 일시에 다량 생산되므로 연중 안정적인 급여를 위해서는 저장을 해야 하는데, 수분을 제거한 저장이 건초인 반면 수분이 있는 상태에서 저장을 하는 것이 사일리지(silage)이다.
최근 들어 사일리지의 품질 향상을 위한 첨가제의 필요성에 대한 인식이 확산되면서 국내산 사일리지용 첨가제를 개발하기 위한 연구가 이루어지고 있다.
그러나, 사일리지는 가열공정을 거치지 않기 때문에 곰팡이 등과 같은 미생물들은 적당한 환경(온도, 영양 및 pH 조건)이 구비되면 번식이 용이하여 사일리지의 보관에 어려움을 겪고 있다.
또한, 사일리지 제조기술 부족과 유통, 보관 시 부주의로 곰팡이 등이 발생하면서 가축의 기호성이 감소되고 섭취량이 줄어드는 문제가 발생한다. 또한, 호기조건에 있는 사일리지는 영양적으로도 커다란 손실을 유발한다.
따라서, 사일리지에 발생하는 곰팡이를 억제함으로써 발효 효율 및 사료 저장성을 증진시킬 뿐만 아니라 사료의 영양성, 기호성 및 소화율도 향상시킬 수 있는 첨가제의 개발이 필요하다.
(특허문헌 1) KR10-2011-0125108 A
본 발명은 상기와 같은 기술적 과제를 해결하기 위하여, 신규 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-10 (KACC91785P) 균주를 제공한다.
본 발명은 상기 균주를 포함하는 항균제 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 신규 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-10 (KACC91785P) 균주를 포함하는 식물체 사일리지 제조를 위한 미생물 첨가제를 제공한다.
뿐만 아니라 본 발명은 신규 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-10 (KACC91785P) 균주를 포함하는 식물체 사일리지 제조방법을 제공한다.
본 발명의 신규 균주는 항균용 조성물로 제조될 수 있으며, 상기 항균용 조성물은 식품, 화장품, 의약품, 건강식품, 음료 등의 다양한 형태로 이용될 수 있다.
뿐만 아니라 본 발명은 신규 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-10 (KACC91785P) 균주를 포함하는 사료 첨가제를 제공한다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 신규 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-10 (KACC91785P) 균주를 제공한다.
상기 락토바실러스 플란타룸 KCC-10 균주는 2013년 2월 20일자로 국립농업과학원 농업유전자자원센터에 기탁하였으며, 수탁번호 KACC91785P를 부여받았다.
곰팡이 등은 발효가 불량한 사일리지에서 다량 발견되고 발효가 양호하게 된 사일리지에서는 육안으로 판별하기 어려울 정도이기 때문에 사일리지 곰팡이 억제기능이 우수한 젖산균을 선발 및 분리하여 사일리지 보존성을 높이고자 하였다.
본 발명의 발명자들은 락토바실러스 플란타룸 균주를 이탈리안 라이 그라스(Italian rye grass)로부터 분리하는 단계; 상기 분리한 락토바실러스 플란타룸 균주의 효소 활성능을 검정하는 단계; 상기 분리한 신규 미생물인 락토바실러스 플란타룸 균주의 동정 단계; 및 상기 분리된 락토바실러스 플란타룸 균주를 이용하여 프로바이오틱 특성을 검정하는 단계를 거쳐, 항균 활성이 우수한 신규 미생물인 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) KCC-10 (KACC91785P) 균주를 얻었다.
본 발명의 실시예들에 따르면, 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) KCC-10 (KACC91785P) 균주는 부패 미생물의 활성을 저하시키고 생육을 억제시켜 항균 활성을 나타낼 수 있다.
상기와 같은 우수한 항균 효과로 인해 상기 균주는 항균용 조성물 제조에 이용할 수 있으며, 특히, 우수한 프로바이오틱 효과로 인해서 다양한 항균용 조성물을 포함하는 식품, 의약품, 화장품, 건강식품 등의 제조에 이용될 수 있다.
본 발명의 항균용 조성물이 포함되는 식품, 의약품, 화장품, 건강식품 등의 제조는 업계에서 일반적으로 실시하는 방법을 통하여 제조될 수 있다.
본 발명의 발명자들은 본 발명의 신규 균주가 독성이 없으면서, 항균 활성이 뛰어나, 우수한 프로바이오틱 제제로 이용될 수 있다는 것을 실험을 통해서 밝혀내었다.
본 발명의 균주는 바람직하게는 상기 우수한 항균 활성으로 인해 사일리지 제조시 저장성을 증진시킬 수 있고, 영양성분의 파괴를 예방할 수 있다.
또한, 부패 미생물등과 같은 원하지 않는 미생물에 의한 사일리지 풍미 감소 등을 예방하여, 가축의 기호성을 증진시킬 수 있는 추가 효과까지 얻을 수 있다.
본 발명은 상기 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) KCC-10 (KACC91785P) 균주를 포함하는 식물체 사일리지 발효용 미생물 첨가제를 또한 제공한다.
상기 식물체 사일리지 발효용 미생물 첨가제를 첨가하는 대상이 되는 식물체는, 예를 들어 볏짚, 라이그라스(ryegrass), 총체보리, 총체벼, 호밀 또는 옥수수일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 가축의 사료로 이용될 수 있는 식물체라면 모두 이용될 수 있으나, 바람직하게는 총체보리에 이용하는 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 발명자들은 상기 균주가 보리 사일리지 추출물을 첨가한 배지에서 호기, 미호기 및 혐기성 조건 모두에서 우수한 성장 속도를 나타냄을 확인하였다(도 8 내지 10 참조).
상기 식물체 사일리지 발효용 미생물 첨가제는 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) KCC-10 (KACC91785P) 균주를 포함하는 배양원액, 또는 상기 배양원액의 희석액의 형태로 첨가할 수 있다.
또한 본 발명은 식물체에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-10 (KACC91785P) 균주를 첨가하는 것을 특징으로 하는 식물체 사일리지 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 식물체 사일리지 제조방법은 당업계에서 사용되는 일반적인 방법으로서, 예를 들어 식물체의 발효를 위한 복수의 발효 단계들을 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 복수의 발효 단계들은, 예를 들어 혐기성균인 초산균의 발효 단계 및 이후 젖산균의 발효 단계 등을 포함할 수 있으며, 당업자에 의해 적절한 조건으로 수행될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-10 (KACC91785P) 균주를 포함하는 사료 첨가제를 제공한다.
본 발명의 사료 첨가제는 업계에서 일반적으로 이용되는 방법으로 제조될 수 있다.
본 발명의 상기 신규 균주가 독성이 없으면서, 항균 활성이 뛰어나, 우수한 프로바이오틱 제제로 이용될 수 있고, 이러한 신규 균주는 우수한 항균 활성으로 인해 사료 첨가제 제조시 저장성을 증진시킬 수 있고, 영양성분의 파괴를 예방할 수 있다.
본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 KCC-10은 우수한 항균 활성을 가진다.
본 발명에 따른 상기 균주를 이용하여 다양한 항균용 조성물을 제조할 수 있다.
본 발명의 균주를 이용하여 제조된 식물체 사일리지는 가축의 소화율을 개선할 수 있고, 항균 효과가 우수하며, 풍미 개선으로 기호성을 향상시킬 수 있어 가축의 품질과 생산성을 높일 수 있다.
또한 상기 사일리지는 저장성이 향상되어 농가 소득 증대에 크게 기여할 수 있다.
본 발명의 항균용 조성물은 독성이 없어 우수한 프로바이오틱 효과를 가지므로, 식품, 의약품, 화장품, 건강식품 등 다양한 형태로 활용될 수 있다.
도 1은 락토바실러스 균주들의 미생물에 대한 항곰팡이 활성을 보여준다.
도 2는 락토바실러스 플란타룸 KCC-10 (KACC91785P) 균주의 항곰팡이 활성 및 미세구조를 보여준다. a는 곰팡이 병원균에 대한 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-10의 항곰팡이 활성을 보여준다. b는 KCC-10(KACC91785P) 균주의 SEM 이미지를 보여준다.
도 3은 Lactobacillus 균주들과 Lactobacillus속에 속하는 종들의 관계를 보여주는 16S rDNA 유전자 서열에 기초한 계통도이다. neighbor-joining method를 이용하여 완성하였다.
도 4는 호기, 미호기 및 혐기성 조건에서 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-10의 성장 및 대사산물 프로파일을 나타낸다. 검은 삼각형: 성장, 검은 사각형: 글루코스, 흰색 사각형: 젖산, 흰색 원: 아세트산, 검은 원: 숙신산
도 5는 Lactobacillus plantarum KCC-10로부터 분리된 대사산물의 분광학적 프로파일을 나타낸다. a:푸리에 변환 적외선, b: 액체 크로마토그래피/질량 분석기; 13C 핵자기공명 (NMR) 및 1H NMR.
도 6은 Lactobacillus plantarum KCC-10으로부터 분리된 3-페닐락트산의 구조를 나타낸다.
도 7은 EZ-Cytox kit에 의한 3T3-L1 세포주에서 Lactobacillus plantarum KCC-10로부터 분리한 화합물의 세포독성 효과를 나타낸다. 다른 농도의 화합물을 처리하였다(0.20100 ml-1).
도 8은 보리 추출물을 포함하는 배지에서 호기성 조건일 때 KCC-10 균주의 흡광도를 나타낸 그래프이다.
도 9는 보리 추출물을 포함하는 배지에서 혐기성 조건일 때 KCC-10 균주의 흡광도를 나타낸 그래프이다.
도 10은 보리 추출물을 포함하는 배지에서 미호기성 조건일 때 KCC-10 균주의 흡광도를 나타낸 그래프이다.
도 2는 락토바실러스 플란타룸 KCC-10 (KACC91785P) 균주의 항곰팡이 활성 및 미세구조를 보여준다. a는 곰팡이 병원균에 대한 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-10의 항곰팡이 활성을 보여준다. b는 KCC-10(KACC91785P) 균주의 SEM 이미지를 보여준다.
도 3은 Lactobacillus 균주들과 Lactobacillus속에 속하는 종들의 관계를 보여주는 16S rDNA 유전자 서열에 기초한 계통도이다. neighbor-joining method를 이용하여 완성하였다.
도 4는 호기, 미호기 및 혐기성 조건에서 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-10의 성장 및 대사산물 프로파일을 나타낸다. 검은 삼각형: 성장, 검은 사각형: 글루코스, 흰색 사각형: 젖산, 흰색 원: 아세트산, 검은 원: 숙신산
도 5는 Lactobacillus plantarum KCC-10로부터 분리된 대사산물의 분광학적 프로파일을 나타낸다. a:푸리에 변환 적외선, b: 액체 크로마토그래피/질량 분석기; 13C 핵자기공명 (NMR) 및 1H NMR.
도 6은 Lactobacillus plantarum KCC-10으로부터 분리된 3-페닐락트산의 구조를 나타낸다.
도 7은 EZ-Cytox kit에 의한 3T3-L1 세포주에서 Lactobacillus plantarum KCC-10로부터 분리한 화합물의 세포독성 효과를 나타낸다. 다른 농도의 화합물을 처리하였다(0.20100 ml-1).
도 8은 보리 추출물을 포함하는 배지에서 호기성 조건일 때 KCC-10 균주의 흡광도를 나타낸 그래프이다.
도 9는 보리 추출물을 포함하는 배지에서 혐기성 조건일 때 KCC-10 균주의 흡광도를 나타낸 그래프이다.
도 10은 보리 추출물을 포함하는 배지에서 미호기성 조건일 때 KCC-10 균주의 흡광도를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
샘플 수집
이탈리안 라이 그라스(Italian rye grass) 사료 사일리지는 대한민국 천안의 각기 다른 곳에서 살균된 폴리프로필렌 백에 수집하였다. 상기 샘플은 항곰팡이 활성을 갖는 고밀도 LAB 균주의 분리를 위하여 실험실로 가지고 왔다. 샘플 수집 지역 및 샘플의 특성을 기록하였다.
Lactobacillus
균주의 분리
락트산 생성 미생물을 분리하기 위하여, 샘플(10 g, wet weight)을 50 ml 살균수와 혼합하고, 30분간 vortexing하여 균질화하였으며 큰 입자상 물질을 제거하기 위하여 20분간 10,000 rpm으로 원심분리하였다. 연속해서 희석된 샘플은 Man Rogosa and Sharpe agar medium (MRSA)위에 도말(spreading)하였다. 상기 플레이트는 30oC로 72시간 배양하였고, 박테리아 성장을 관찰하였으며 그 다음 MRSA에 정제하였다. 의심되는 LAB 콜로니들은 선택하고 Bromo cresol purple agar (BCP) 배지에 도말했다. BCP는 광학현미경으로 관찰한 형태적 특성에 근거해 확인할 수 있는 LAB 균주를 동정하기 위해서 선택배지로 이용된다. 선택된 새로운 균주는 Lactobacillus sp. (KCC-1KCC-155)로 번호를 부여하였다. 상기 균주들은 저장 온도 4oC에서 1개월 동안 MRS agar 배지에서 보관하였다. 아니면 상기 균주들은 20% 글리세롤에서 재-부유하고 -80oC에서 보관한다.
항균 활성을 위한 Lactobacillus 균주들의 일차 스크리닝
Lactobacillus 균주들의 항균 활성은 Smania etal.,1999의 agar diffusion method 를 이용하여 측정하였다. Petri dish는 살균한 MRS 배지 25 ml와 준비하였고, LAB 균주들은 플레이트에 도말하고 30oC에서 72 h 동안 배양하였다. 그 다음, 108CFU/ml를 포함하는 곰팡이 부유액 50 을 감자 한천 배지와 골고루 혼합하고 LAB 균주들을 MRS agar 배지의 표면에 덮어씌웠다. 상기 플레이트는 호기성 조건에서 30oC에서 72 h 동안 배양하였고, 선명한 억제 존이 기록되었다. 실험은 3배수 실시하였고, 우수한 antagonistic 활성을 가지는 Lactobacillus sp. KCC-10 균주들을 선별하였다.
Lactobacillus
sp
. KCC-10의 동정
생화학적 테스트
동정 실험용 접종물을 준비하기 위하여, glycerol stock vial은 50 ml MRS 배지를 포함하는 250 ml flask를 접종하는데 사용하였다. 활성 배양은 30oC 24h동안 키웠다. Lactobacillus sp. KCC-10는 실험 전에 두 배로 증식시켰다. 생화학적 및 생리학적 특성은 일반적인 방법으로 분석하였다(Shen etal.,1999). API50CHB 테스트 키트는 표현형 결정을 위하여 사용하였다. API 테스트 스트립은 설명서에 따라 준비하고 30oC에서 48시간 배양한 후에 기록하였다.
Scanning electron microscopy (
SEM
)
Lactobacillus sp. KCC-10는 호기성 조건하에서 MRS 배지에서 기하급수적으로 자랐고, 10분간 8000 rpm으로 원심분리하였으며 펠렛은 0.1 M phosphate buffer saline (PBS), pH 7.2로 두 번 세척하였다. 그 다음, 세포들은 글루타르알데히드(2.5%) 및 PBS (0.1 M)을 포함하는 일차 고착액으로 재부유하였다. 고정된 세포들은 PBS를 이용하여 세척하였다. 다음으로, 세포들은 4산화 오스뮴(osmium tetroxide) (1.0%) 및 PBS (0.1 M)를 이용하여 고정하였다. 첫 번째 및 두 번째 고정 과정은 4°C에서 2시간 동안 수행되었다. 점차 증가하는 에탄올(50, 60, 70, 80, 90, 및 95%)로 탈수한 후에, 고정된 세포들은 hexamethyldisilizane로 두번 건조시켰다. 마지막으로, 탈수된 세포들은 250 sec 동안 25 mA에서 금으로 코팅된 sputtering하고, 12 kV에서 SEM으로 관찰하였다(JSM-6460 LV; JEOL, Tokyo, Japan).
항생제 감수성 및 the
Lactobacillus
sp
. KCC-10 저항성 패턴 결정
항생제 감수성 및 Lactobacillus sp. KCC-10의 저항성은 Bauer etal.(1996)의 disc diffusion method로 측정하였다. Lactobacillus sp. KCC-10은 배양은 30oC에서 24 h동안 MRS 배지에 준비하였다. Petri dishes는 25 ml의 살균 MRS 배지로 준비하였다. Lactobacillus sp. KCC-10는 단단해진 배지의 표면에 도말하고 10분간 건조하였다. 다른 농도의 Antibiotic discs들을 배지 표면에 위치시키고 항생물질이 확산되도록 실온에 30분간 두었다. 플레이트는 30oC에서 48 h동안 배양하였다. 억제 구역은 밀리미터로 기록하였고 실험은 3배수 실시하였다.
Lactobacillus sp . KCC-10 16SrDNA 유전자의 중합효소 연쇄 반응( PCR ) 증폭 및 시퀀싱
16S ribosomal DNA 유전자 시퀀싱은 Sol-Gent Co. (대한민국, 서울)에서 실시하였다. 간단히 말해, Lactobacillus sp. KCC-10 게놈 DNA를 분리하였고, PCR 반응은 27 forward primer (5' AGA GTT TGA TCG TGG CTC AG 3') 및 1492 reverse primer (3' GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 5')를 이용하여 Taq DNA 중합효소로 수행하였다. thermal cycling조건은 다음과 같다: 타겟 DNA의 95oC에서 10 min 변성 다음에 30 회 증폭, 95oC에서 2 min간 변성, 58oC에서 1 min간 프라이머 어닐링(annealing), 및 72oC에서 2 min간 프라이머 신장. 마지막 사이클에서, 반응 혼합물은 72oC에서 10분간 유지하고, 4oC로 냉각하였다. 증폭된 DNA는 agarose gel(1%(w/v) in TAE buffer 1x, 0.1ethidium bromide solution)에서 25분간 100V 및 400mA로 확인하였다. 상기 DNA 농도는 분광 광도계로 측정하였다. 상기 증폭된 PCR 산물은 QIAquickPCR Purification kit (Qiagen Ltd., Crawley, UK)로 정제하였다. 상기 PCR 산물은 설명서에 따라 pGEM-T 클로닝 벡터에 연결하였다(Promega, Madison, WI, USA). 플라스미드는 Escherichia coli DH5α 형질전환 세포내로 형질전환하였고 재조합 형질전환체는 blue/white colony screening으로 선별하였다. 각각의 흰색 콜로니는 앰피실린을 포함하는 25 ml LB 배지내 rotary shaker에서 밤새 37oC에서 키웠다. 플라스미드 제조 후, 삽입된 DNA의 존재를 확인하기 위하여 M13-F 및 M13-R 프라이머를 이용하여 각각의 샘플의 2 (50 중에서)를 PCR (Bio-Rad I cycler; Hercules, CA, USA)로 증폭하였다.
16S
rDNA
유전자 서열 분석
얻어진 서열은 NCBI database에서 BLAST search를 수행하였다(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). evolutionary history는 Neighbor-Joining method를 이용하여 추측하였다. evolutionary 분석은 MEGA5로 하였다. (Tamura etal.,2011).
Lactobacillus
sp
. KCC-10의
프로바이오틱
특성
낮은
pH에 대한 내성
낮은 pH에 대한 내성은 plate count method를 이용하여 측정하였다. 간단히 말해, 활성 Lactobacillussp. KCC-10는 MRS 배양액에서 키우고 pH 2.5로 염산(1.0 N)을 이용해 조절한 신선한 10 mL의 MRS 배양액에 접종되었으며(1%), 30°C로 3시간 배양하였다. 샘플에서 MRS agar plates에 적절히 희석액을 플레이팅하여 초기 박테리아 수 및 0 와 3 h 에 남아있는 세포 수를 각각 측정하였다. 상기 플레이트는 30°C 로 48 h 동안 배양하였고 자란 콜로니 수를 세었다. 실험은 3배수 실시하였다.
담즙 내성
두 개의 다른 담즙 염이 존재할 때 Lactobacillus sp. KCC-10이 자라나는 능력을 약간의 변형을 가한 Vinderola 및 Reinheimer (2003) 방법에 따라 연구하였다. MRS-thiobroth (0.2% 소듐 티오글리콜레이트가 공급된 MRS) 및 0.3% (w/v) Oxgall이 공급된 MRS-thiobroth를 준비하고 Lactobacillus sp. KCC-10 1% 부유액을 접종하였다. Oxgall이 없는 샘플은 대조군으로 이용하였다. 30°C에서 24시간 배양한 후에, 박테리아의 농도는 적절한 희석액으로 플레이팅한 MRS agar에서 생균수로 체크하였다. 실험은 3배수 실시하였다.
생체
아민
생산
생체 아민의 생산은 Bover-Cid and Holzapfel (1999)에 기술된 방법으로 측정하였다. 간단히 말해, 리신, 티로신, 오르니틴 및 히스티딘을 각각 1.0% 첨가한 MRS agar 배지에 준비된 Lactobacillus sp. KCC-10 cells 600 nm (OD600)에서 0.5 광학 농도로 접종하였다. 박테리아 성장을 향상시키기 위하여 Tween 80 (0.1%)을 배지에 포함시켰다. 브로모크레솔 퍼플 (0.006%)을 pH indicator로 사용하였다. 선명한 보라색 halo의 형성은 아미노산 탈카르복실화효소가 존재함을 나타내는 positive 반응으로 생각된다. 아미노산을 공급하지 않은 배지는 음성 대조군으로 사용하였고 실험은 3배수 실시하였다.
효소 활성
효소 활성은 사용 설명에 따라 키트 방법을 이용하여 분석하였다(BioMerieux). 0.5 OD600으로 준비한 세포들은 10분간 8000 rpm으로 원심분리하였고, 펠렛은 스크리닝을 위하여 살균된 증류수내에 부유시켰다. 각 LAB 균주의 효소 활성은 30°C에서 4 h 배양한 후 각각의 well로 활성화된 세포 부유물 50 μL 을 옮겨서 측정하였다. 배양후 ZYMA 및 ZYM-B 시약 20 μL는 각각의 well로 추가하였고, 효소 활성을 측정하기 위하여 5분간 30°C에서 배양하였다.
Lactobacillus
sp
. KCC-10 성장 특성 및
대사산물
프로파일
Lactobacillus sp. KCC-10 및 표준 ATCC 균주들은 orbital incubator shaker에서 30°C로, 50 mL MRS 배양액을 포함하는 250 mL 삼각 플라스크에서 키웠다. 배양 플라스크는 동일한 배양 조건으로 MRS 배지에서 키운 준비된 세포 0.1 OD600접종하였다. 상기 플라스크는 산소투과 솜마개를 끼우고 호기성 조건으로 200 rpm에서 배양하였고, 플라스크는 산소투과 솜마개를 끼우고 미-호기성(micro-aerobic) 조건에서 50 rpm으로 배양하였다. 살린(saline) 병은 산소 불투과 고무 마개를 끼우고 알루미늄캡으로 밀봉하고 혐기성 조건에서 200 rpm으로 배양하였다. 24시간 배양한 후, 샘플은 제거하고 세포 농도(OD600)및 대사산물(아세트산, 락트산 및 숙신산)을 분석하였다.
Lactobacillus
sp
. KCC-10의 곰팡이
바이오매스
(Fungal
biomass
) 억제 효과
곰팡이 바이오매스 억제는 100 ml MRS broth를 포함하는 250 ml 삼각 플라스크 각각에 중간-지수기(mid-log phase) Lactobacillus sp. KCC-10를 접종함으로써 시험하였고 orbital incubator shaker에서 30oC로 48 h동안 이들을 배양하였다. 무세포 상청액들을 12,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 수집하였다. 40 ml PD 배양액 Aliquots (10 ml)는 50 ml 플라스크에 두고 각각의 테스트 균을 세 번 접종하였다. 곰팡이 균주들은 30oC로 5일간 배양하였다. 발효 배양액이 없는 플라스크를 양성 대조군으로 하였다. 모든 곰팡이 균주들의 성장율은 곰팡이의 억제가 성장 배지의 영양 고갈 또는 산(acid) 생산 때문에 간단하지 않다는 것을 확실히 하기 위하여, 100 mM 아세트산, 락트산 및 숙신산을 포함하는 PD 배양액에서 각각 체크를 하였다. 배양후, 곰팡이의 성장은 Whatman #1 필터 페이터에서 공기로 건조시킨 세포들을 거둬들여 측정하였다. 평균 곰팡이 바이오매스는 각각의 테스트 곰팡이들로 산출하였고 양성 대조군들의 곰팡이 바이오매스와 비교하였다.
항곰팡이
대사산물의
추출
Lactobacillus sp. KCC-10는 2% glucose가 함유된 3.0 L MRS 배양액을 포함하는 살균된 5 리터 Erlenmeyer에서 30oC로 3일간 배양하였다. OD600값0.5의 준비된 세포들을 스타터 배양으로 사용하였다. 발효 사이클의 마지막에, 항곰팡이 대사산물을 포함하는 발효 배지를 12,000 rpm으로 30 min 동안 원심분리하여 분류하였다. 상청액을 에틸아세테이트로 추출하였다(3 × 300 ml). 용매상은 항곰팡이 바이오매스 미정제 추출을 위해 35oC 진공상태로 농축하였다. 상기 에틸 아세테이트 추출물은 헥산/에틸 아세테이트 혼합 용매로 정제하였다.
화합물의 동정 및 특성
순수 화합물로 1H 핵 자기 공명(NMR) (300 MHz)에 의한 분광분석을 하였다. 13CNMR스펙트럼은 AL-300 JEOL instrument (75.45 MHz)로 측정하였으며 전기분무 이온화 질량 분광으로 기록하였다. 적외선 스펙트럼은 또한 KBr 펠렛 방법을 이용하여 기록하였다.
화합물의
항곰팡이
활성 및 최소 저지 농도(
MIC
)
항곰팡이 활성 및 MIC 테스트는 표준 참고 방법 (NCCLS, 1999)에 따라 수행하였다. 미정제 추출물 및 순수 화합물은 2% dimethyl sulfoxide (DMSO)와 물과 함께 용해하였다. 초기 테스트 농도는 단계적으로 두 배씩 희석하였다. 각각의 well은 104spore/mL농도의 곰팡이를 포함하는 5 의 부유물로 접종하였다. 다음 항균제 케토코나졸을 양성 대조군으로 사용하였다. 플레이트는 30oC에서 24, 48, 또는 72 h 동안 배양하였고, 피부사상균주들은 7일 이상 배양하였다. MIC는 시험 배양의 가시적인 성장을 저지하는 추출물의 최하 농도로 결정하였다. 항균 활성을 확인하기 위하여 실험은 3회 반복하였다.
세포독성 분석
adipocytes (3T3-L1, mouse adipocytes)에 화합물의 세포독성 효과는 EZ-Cytox cell viability assay kit (ITS BIO, Co., Ltd., Seoul, South Korea)를 사용하여 조사하였다. 본 어세이는, 미토콘드리아 호흡 사슬내에 존재하고 오로지 살아 있는 세포에서만 활성을 갖는 succinate-tetrazolium reductase system에 의하여, 테트라졸륨 염에서 수용성 포르마잔으로 절단되는 것에 근거한다. 그러므로, 포르마잔 염료의 양은 살아있는 세포의 수와 직접적으로 비례한다. 간단히 말해, 100 세포 현탁액은 96-well 플레이트에 분주하고(1 × 105cells/well),플레이트는 37oC에서 24시간 동안 배양하였다. 그 다음, 다양한 농도의 화합물 10 을 플레이트 내 배양 배지에 추가하였다. 48시간 배양후, 키트 용액의 10 을 플레이트의 각 well에 추가하고 배양기에서 4시간 배양하였다. OD 는 multi-well plate reader (Bio Rad)로 각각의 well을 580 nm에서 측정하였다. 상기 테스트는 세번 수행하였다. 오로지 배양 배지만을 포함하는 well을 대조군으로 삼았다. 그래프는 화합물의 농도에 따른 흡광도로 나타났다.
미생물
Aspergillus clavatus (KACC 40071), A.fumigates(KACC40080), A. niger (KACC 40280), A. oryzae(KACC44823), A. pullulans(KACC41291), B. cinerea(KACC40573), B. elliptica(KACC43461), C. albicans(KACC30003), C.acuminatus(KACC49383), C. lunata(KACC40392), E. floccosum(KACC44918), F.culmorum(KACC42099), F. oxysporum(KACC40051), F. solani(KACC40384), G.moniliformis(KACC44022), H. grisea (KACC 40860), P. chrysogenum(KACC40399), P.roqueforti(KACC41354), S. lignicola(KACC41228), S. vaccinii(KACC43121), S.brevicaulis(KACC40273), S. fusca(KACC41367), T. mentagrophytes(KACC45479), 및 T. roseum (KACC 40956) 을 사용하였다. 모든 균주들은 농촌진흥청 미생물 자원센터로부터 분양받았다.
결과
Lactobacillus
항곰팡이
활성을 위한 분리 및 스크리닝
대한민국 천안의 농촌진흥청으로부터 얻은 10개의 사료 사일리지 샘플에서 항곰팡이성 Lactobacillus를 분리하였다. 전체 155개의 Lactobacillus 균주들 전체를 MRS agar 배지 및 BCP 배지에서 키우기 위해 각각 생존능력에 따라 분리 및 정제하였다. 모든 155개 균주들을 다양한 곰팡이(진균류(filamentous fungi) 및 피부사상균(dermatophytes))에 대한 항균 활성을 위해 스크리닝하였다. 모든 Lactobacillus 균주들은 일차스크린에서 진균류 및 피부사상균 모두에 대해 활성을 보였다. 진균류 G. moniliformis 및 P. roqueforti 에 대해 우수한 항균 활성을 보였다(도 1 참조). Lactobacillus 균주의 대략 50%(n = 75)는 하나 또는 그 이상의 곰팡이에 대해 활성을 나타났으며, 이는 Lactobacillus 균주는 광범위한 항곰팡이성 대사산물을 생산할 수 있는 잠재적인 후보가 될 것을 의미한다.
Lactobacillus 균주는 P. chrysogenum (87%) 다음으로 P. roqueforti (84%)에 대해 가장 큰 항균 활성을 보였으며 Lactobacillus sp. KCC-10는 모든 테스트 곰팡이에 대해서 우수한 활성을 보였다(도 2a 참조). 이 균주는 16s rDNA 유전자 증폭 및 시퀀싱뿐만 아니라 생화학적 및 생리학적 특성에 의해 확인하였다. 상기 균주는 스케일을 늘려서 배양하였고 신규 항곰팡이성 대사산물을 추출하였다.
Lactobacillus
균주의 생화학적 및 생리학적 특성
Lactobacillus sp. KCC-10의 배양 특성은 MRS and BCP agar medium에서 24시간 및 48시간 배양한 후에 관찰하였다. 상기 박테리아들은 크림색이며 표면은 밝은 노란색 빛을 띄었다. 그람-양성, 호기성 또는 미호기성, 막대형(0.60.9 넓이 및 2.13.5 길이)의 박테리아이며 SEM 결과는 도 2b에 나타냈다. 상기 SEM 사진으로는 박테리아는 세포 표면에 포자를 포함하고 있지 않았으며, 모든 균주들은 운동성이 있었다. 이들의 형태 및 운동성의 미세 구조 형태학적 특성은 모든 균주들이 Lactobacillus 속에 포함된다는 것을 의미한다.
상기 LAB 균주들은 API 50E micro test를 이용하여 생화학적으로 확인하였다(하기 표 1 참조).
+: Positive (>90%).
: Negative (>90%).
상기 표 1은 Lactobacillus sp. KCC-10의 생리학적 및 생화학적 특성을 나타낸 표이다.
상기 표 1에 나타난 바와 같이, 테스트결과 LAB 균주들은 중온성이었으며 시트레이트를 감소시킬 수 있거나 황화수소를 생산할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 상기 KCC-10 균주는 아라비노스, 갈락토스, 글루코스 및 만니톨을 발효시켰으나 글리세롤, 에리스리톨, 자일로스, 만노스, 소르보스, 락토스, 멜리비오스, 라피노스, 글리코겐, 푸코스, 아라비톨 또는 포타슘 글루코네이트 2-케토글루코네이트를 발효시키지 않았다. 상기 Lactobacillus sp. KCC-10의 탄소원 이용 패턴은 넓었다. 생화학적 연구를 통해 Lactobacillus 속에 속한다는 것을 밝혔다.
항생제 감수성
Lactobacillus sp. KCC-10의 항생제 감수성 패턴 분석은 EFSA가 선정한 주요 항생제(2008)를 포함해 40개의 항미생물 제제를 대상으로 실시하였다. 모든 항생제들은 유사한 감수성 패턴을 나타냈다(하기 표 2 참조 ).
상기 표 2는 다양한 항생제에 대한 Lactobacillus sp. KCC-10의 상대적인 민감도 패턴을 나타낸 표이다.
상기 표 2의 결과에 따르면, 억제대(inhibiton zone)의 측정은 균주들을 MRS agar medium (MRSA)에서 48시간 동안 30oC로 배양한 후에 측정하였다.
Lactobacillus sp. KCC-10는 대부분의 테스트 항생제들에 민감성을 나타냈고, 박테리아에서 단백질 또는 세포벽 생합성을 방해하는, aminoglycosides, carboxypenicillins, β-lactamase inhibitors, fluroquinolones, cephalosporins, cephamycin antibiotics, glycopeptide antibiotics, polymixins, polyketides, sulfonamides, lincosamide antibiotics, macrolide antibiotics, 및 nitrofuran antibiotics과 같은 다양한 항생제 그룹들에 대해 높은 민감도를 보여주었다. streptomycin 및 sulfafurazole과 같은 Aminoglycoside and sulfonamide 항생제들에는 상대적으로 적은 활성을 보였다.
16S
rDNA
비교 분석
Lactobacillus sp. KCC-10의 16S rDNA 유전자는 완전히 서열을 분석하였고 상동성도 분석하였다. NCBI BLAST search program은 서열 데이터가 Lactobacillus plantarum(SCP53)와 bits score와 E 값이 각각 2671 및 0으로, 높은 동일성(100%)을 보였다 (도 3 참조). Evolutionary 거리는 Maximum Composite Likelihood method를 사용하여 컴퓨터로 측정하였고 사이트당 염기 치환의 수에 근거하여 나타내었다.
핵산 서열 및 배양 accession numbers
L. plantaram KCC-10의 16S rDNA 서열은 accession number KC422325으로 NCBI 핵산 서열 데이터베이스에 맡겨졌다. L. plantaram KCC-10 순수 배양은 국립농업과학원 농업유전자자원센터에 기탁하였으며, 수탁번호 KACC91785P를 받았다.
성장 특성 및
대사산물
생산 프로파일
호기성 조건에서 성장
균주들을 MRS medium에서 배양하였으며, 상대적으로 성장이 더딘 다른 표준 LAB 균주들과의 성장을 비교해, 호기성 미-호기성 및 혐기성 조건하에서 우수한 성장을 보였다(도 4 참조). 배양 12시간 후에 KCC-10 및 KACC 91016 균주들은 각각 2.84 및 2.63의 OD600값을 기록하였다. KCC-10 및 KACC 91016의 μmax 값은 각각 0.375 및 0.269/h을 얻었다. 산화적 대사는 필수적인 세포 성장 성분의 합성에 중요한 역할을 하므로, 산화경로의 활성화 때문에 KCC-10의 성장율이 더 좋을 것으로 생각되었다. 이러한 결과는 24시간 배양후에, 발효된 배양액의 pH 가 4.0으로 떨어지는 것으로부터 알 수 있었다. 이것은 분명히, LAB 균주들은 유기산을 분비할 수 있다는 것을 나타낸다. KCC-10은 호기성 조건에서 24시간 배양후, 가장 많은 젖산을 생산하였다. 이들은 많은 양의 젖산 및 아세트산을 생산하였다.
미-호기성 조건하에서 성장
세 균주들에서 얻은 최대 OD600및 μmax 값을 비교하였다. 젖산 생산은 KACC 91016에서 보다 KCC-10에서 더 빨랐다. 15시간 후 최종 젖산 농도는 KACC 91016 배양에서보다 KCC-10 배양에서 조금 더 높았다.
호기성 조건에서 성장
KCC-10 균주는 KACC 91016와 비교할 때 호기성 조건에서 더 잘 자란다는 것이 분명하였다. 소비당 대부분은 KCC-10 균주에 의한, 경로젖산 및 아세트산 생산을 이끌 수 있는, 산화경로와 관련되어 있다. 이것은 아마도 혐기성 조건에서 만들어지는 매우 많은 양의 환원적 등가물이 존재하기 때문일 것으로 생각된다. 만들어진 젖산의 양은 야생형 균주와 비교할 때 KCC-10에서 더 많았다.
Lactobacillus
sp
. KCC-10의 곰팡이
바이오매스
저지 효과
5일간 배양한 후, 곰팡이 바이오매스의 건조 중량 측정에 의할 때 MRS 대조군 및 유기산을 포함한 MRS 배지와 비교하면, KCC-10은 현저하게 곰팡이 성장을 억제하였다(표 3 참조).
상기 표 3은 락토바실러스속 KCC-10의 항곰팡이 바이오매스 억제 효과를 나타낸 표이다.
KCC-10의 항곰팡성 성장 억제 활성은 B. elliptica (79.58%), 다음으로 A. fumigates (67.3%)에 대해 가장 크게 나타났다. 테스트 곰팡이는 아세트산, 락트산 및 숙신산과 같은 유기산 혼합물에 의해 저지되지 않았다. 이는 Lactobacillus 무세포 배양에서 보여지듯이 곰팡이의 억제는 다른 억제 화합물이 존재하기 때문인 것으로 추측되었다.
항곰팡이성
대사산물의
정제 및 분광학적 분석
순수 화합물을 얻기 위하여, 미정제 상태의 에틸 아세테이트 추출물을 헥산 및 클로로포름으로 재-추출하고 5개의 주요 fraction을 모으기 위해서 Sephadex LH-20 컬럼을 이용하였다. 다섯 개의 주요 fraction의 농축물은 물과 DMSO (9:1 비율)에 용해되었고 항곰팡이 활성을 시험하였다. 이들 중에서 fraction 3이 우수한 항곰팡이 활성을 보였다. fraction 1 및 2는 적절한 활성을 보였으나, 다른 것은 테스트 곰팡이에 대해 어떠한 활성도 보이지 않았다. Fraction 5는 세미 분취용(semi-preparative) 고성능 액체 크로마토 그래피(HPLC)를 이용하여 더 정제하였다. HPLC 정제는 3.80 분에 용출된 순수 화합물을 분리하는데 이용하였다 (순도, 96.78%). 상기 화합물의 UV λmax는 221 및 258 nm였다. 정제된 fraction의 IR 스펙트럼은 3451.52 및 1716.66 cm-1에서 강력한 흡수대를 나타냈으며, 이들은 각각 알코올 및 산 그룹을, 그리고 이중 결합을 각각 나타낸다. 이러한 결과는 방향성기 및 수산기와 같은 작용기가 뻗은 산성 대사산물 페닐 락트산에 대응하였다(도 5 참조). 상기 1H NMR (300 MHz) 스펙트럼은 0.26, 2.08, 2.1, 4.98, 7.2, 및 8.25에서 신호를 나타냈고 이들은 메틸렌 그룹에 대응한다. 13C NMR스펙트럼은 177.0 175.0, 139.0, 128, 125, 72.0, 65.0, 40.0, 및 20.0에서 신호를 보였다. δ C 177 및 175.0에서 시그날은 카르보닐 그룹이 존재함을 나타낸다. MASS 스펙트럼은 165.1에서 주요 단편화를 보였다. 상기 스펙트럼 데이터는 화합물의 구조를 그리는데 도움이 되었고 화합물의 이름이 3-페닐 락트산임을 알 수 있었다. 상기 화합물의 분자식은 C9H10O3이었으며(도 6 참조), 새로운 물질이었다.
항곰팡이
활성
미정제된 추출물 및 분리된 화합물의 항곰팡이성 프로파일은 표 4에 나타냈다.
S (ketoconazole), 곰팡이 대조군
참조; EA, 에틸아세테이트 추출물; C, 화합물.
상기 표 4는 Lactobacillus plantarum KCC-10로부터 획득한 미정제된 추출물 및 화합물의 항곰팡이성 활성을 나타낸 표이다.
Lactobacillus sp. KCC-10에서 얻은 순수 화합물은 A. clavatus 및 S. vaccinii (MIC: 2.5 mg ml-1), A. fumigates 및 S. fusca (MIC: 5.0 mg ml-1), F. oxysporum (MIC: 7.5 mg ml-1), 및 B. cinerea 그리고 T. roseum (MIC: 10.0 mg ml-1)에 대해 확실한 항곰팡이 활성이 있음을 알 수 있었다. Lactobacillus sp. KCC-10의 에틸 아세테이트 추출물은 곰팡이 병원균에 대해 상대적으로 더 높은 MIC값을 나타냈다. 항곰팡이 활성은 25.0100 ml-1의 MIC 값을 갖는 표준 항곰팡이 제제 클루코나졸과 비교하였다.
세포독성
정상 3T3-L1 세포주에 농도별로 화합물의 세포독성 효과를, 96-well 플레이트에 EZ-Cytox kit를 이용하여 측정하였다. 화합물의 농도별로 (10100 ) 농도 의존적 및 시간 의존적 억제가 나타났다(도 7 참조). 이러한 결과는 상기 화합물이 adipocyte 세포에 독성이 없음을 의미하였다.
Lactobacillus
sp
. KCC-10의
프로바이오틱
특성
낮은 pH 내성 단계는 pH 2.5에서 KCC-10를 배양하여 측정하였고 상기 균주는 산성 조건에서 영향을 받지 않았다(하기 표 5 참조).
상기 표 5의 값은 표준편차를 가지고 3배수 실시하여 나타냈음;
(+) positive 활성; (-) negative 활성을 나타내었다.
상기 결과는 모든 균주들이 Oxgall에 높은 감수성이 있음을 나타냈으며 소듐 타우로콜레이트 존재하에서는 더디게 성장함을 보여주었다. 탈카복실화효소 활성에 대한 양성 결과는 티로신에 대해서는 관찰되었으며, 오르니틴 및 히스티딘에 대해서는 탈카복실화효소 활성이 음성으로 나타났다. 효소 활성은 다른 프로파일을 보여주는 kit method를 이용하여 측정하였다(하기 표 6 참조).
상기 표 6은 Lactobacillus plantarum KCC-10의 세포밖 효소 활성을 나타낸 표이다.
상기 표 6에 나타난 바에 따르면, L. plantarum KCC-10의 효소 활성은 API ZYM kit method를 이용하여 분석하였으며 30°C에서 4시간 배양하는 동안 가수분해된 물질의 대략적인 nmole수를 측정하였다. 효소 활성이 없는 L. plantarum KCC-10은 0*으로 나타냈고; 효소 활성은 가수분해된 물질의 5, 10, 20, 및 30 nmoles로 나타내었다.
KCC-10는 루신 아릴아미데이트(leucine arylamidase) 및 β-글루코시데이즈(β-glucosidase)의 수준을 약하게 조절하는 것으로 보였으나, 알칼리성 인산가수분해 효소(alkaline phosphatase), α-푸코시데이트(α-fucosidase) 또는 α-만노시데이즈(α-mannosidase) 활성에는 양성 반응을 보이지는 않았다. β-글루쿠로니데이즈(β-glucuronidase)의 평균 활성(가수분해된 물질 10 nmol)은 경계의(marginal) β-글루코시데이즈 활성 (가수분해된 물질 10 nmol)으로 감지하였다.
Claims (11)
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- 가축에 제공하는 사일리지 사료용 조성물로,
상기 조성물은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-10 (KACC91785P) 균주를 포함하며,
상기 조성물은
프로바이오틱 활성; 및
아스퍼질러스 클라바투스(Aspergillus clavatus), 아스퍼질러스 푸미게이트(Aspergillus fumigates), 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 오리자(Aspergillus oryzae), 아스퍼질러스 플루란스(Aspergillus pullulans), 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea), 보트리티스 엘립티카(Botrytis elliptica), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 루나타(Candida lunata), 에피더모파이톤 플로코섬(Epidermophyton floccosum), 푸사리움 컬모룸(Fusariu culmorum), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), 푸사리움 솔라니(Fusarium solani), 지베렐라 모닐리포르미스(Gibberella moniliformis), 페니실리움 크리소게눔(Penicillium chrysogenum), 페니실륨 로케포티(Penicillium roquefortii), 스코풀라리오시스 리그니콜라(Scopulariopsis lignicola), 스코풀라 리오시스 백시니(Scopulariopsis vaccinii), 스코풀라리오시스 브레비카우리스(Scopulariopsis brevicaulis), 스코풀라리오시스 푸스카 (Scopulariopsis fusca), 트리코파이톤 멘타그로파이트(Trichophyton mentagrophytes), 또는 테르모미크로비움 로세움(Thermomicrobium roseum)에 대해 항곰팡이 활성을 갖는 것을 특징으로 하는,
가축에 제공하는 사일리지 사료용 조성물. - 삭제
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Priority Applications (1)
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