KR101655774B1

KR101655774B1 - 락토바실러스 플란타룸 kcc-19 및 이를 포함하는 조성물

Info

Publication number: KR101655774B1
Application number: KR1020160019932A
Authority: KR
Inventors: 최기춘; 임영철; 최기준; 박형수; 정민웅
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2016-02-19
Filing date: 2016-02-19
Publication date: 2016-09-09
Also published as: KR20160026948A

Abstract

본 발명은 신규한 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-19 (KACC91816P) 균주 및 이를 이용한 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 상기 락토바실러스 플란타룸 KCC-19의 항균 활성을 이용하여 다양한 항균용 조성물을 제공하며, 특히 사일리지 제조용 미생물 첨가제를 제공한다. 본 발명의 균주를 이용하여 제조된 식물체 사일리지는 가축의 소화율을 개선할 수 있고, 항균 효과가 우수하며, 풍미 개선으로 기호성을 향상시킬 수 있어 가축의 품질을 높일 수 있다.

Description

락토바실러스 플란타룸 KCC-19 및 이를 포함하는 조성물{Lactobacillus plantarum KCC-19 and composition comprising the same}

본 발명은 신규한 락토바실러스 플란타룸 균주 및 이를 이용한 사일리지 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 항곰팡이 활성이 우수한 신규한 락토바실러스 플란타룸 균주 및 이를 이용한 품질이 개선된 사일리지를 제조하는 방법에 관한 것이다.

조사료는 일시에 다량 생산되므로 연중 안정적인 급여를 위해서는 저장을 해야 하는데, 수분을 제거한 저장이 건초인 반면 수분이 있는 상태에서 저장을 하는 것이 사일리지(silage)이다.

최근 들어 사일리지의 품질 향상을 위한 첨가제의 필요성에 대한 인식이 확산되면서 국내산 사일리지용 첨가제를 개발하기 위한 연구가 이루어지고 있다.

그러나, 사일리지는 가열공정을 거치지 않기 때문에 곰팡이 등과 같은 미생물들은 적당한 환경(온도, 영양 및 pH 조건)이 구비되면 번식이 용이하여 사일리지의 보관에 어려움을 겪고 있다.

또한, 사일리지 제조기술 부족과 유통, 보관 시 부주의로 곰팡이 등이 발생하면서 가축의 기호성이 감소되고 섭취량이 줄어드는 문제가 발생한다. 또한, 호기조건에 있는 사일리지는 영양적으로도 커다란 손실을 유발한다.

따라서, 사일리지에 발생하는 곰팡이를 억제함으로써 발효 효율 및 사료 저장성을 증진시킬 뿐만 아니라 사료의 영양성, 기호성 및 소화율도 향상시킬 수 있는 첨가제의 개발이 필요하다.

(특허문헌 1) KR10-2011-0125108 A

본 발명은 상기와 같은 기술적 과제를 해결하기 위하여, 신규 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-19 (KACC91816P) 균주를 제공한다.

본 발명은 상기 균주를 포함하는 항균제 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 신규 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-19 (KACC91816P) 균주를 포함하는 식물체 사일리지 제조를 위한 미생물 첨가제를 제공한다.

뿐만 아니라 본 발명은 신규 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-19 (KACC91816P) 균주를 포함하는 식물체 사일리지 제조방법을 제공한다.

그리고 본 발명의 상기 균주를 포함하는 항산화용 조성물을 또한 제공한다.

본 발명의 신규 균주는 항산화용 조성물 및 항균용 조성물로 제조될 수 있으며, 상기 항산화용 조성물 및/또는 항균용 조성물은 식품, 화장품, 의약품, 건강식품, 음료 등의 다양한 형태로 이용될 수 있다.

뿐만 아니라 본 발명은 신규 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-19 (KACC91816P) 균주를 포함하는 사료 첨가제를 제공한다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 신규 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-19 (KACC91816P) 균주를 제공한다.

상기 락토바실러스 플란타룸 KCC-19 균주는 2013년 5월 6일자로 국립농업과학원 농업유전자자원센터에 기탁하였으며, 수탁번호 KACC91816P를 부여받았다.

곰팡이 등은 발효가 불량한 사일리지에서 다량 발견되고 발효가 양호하게 된 사일리지에서는 육안으로 판별하기 어려울 정도이기 때문에 사일리지 곰팡이 억제기능이 우수한 젖산균을 선발 및 분리하여 사일리지 보존성을 높이고자 하였다.

본 발명의 발명자들은 락토바실러스 플란타룸 균주를 crimson clover silage(크림슨 크로버 사일리지)로부터 분리하는 단계; 상기 분리한 락토바실러스 플란타룸 균주의 효소 활성능을 검정하는 단계; 상기 분리한 신규 미생물인 락토바실러스 플란타룸 균주의 동정 단계; 및 상기 분리된 락토바실러스 플란타룸 균주를 이용하여 프로바이오틱 특성을 검정하는 단계를 거쳐, 항균 활성이 우수한 신규 미생물인 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) KCC-19 (KACC91816P) 균주를 얻었다.

본 발명의 실시예들에 따르면, 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) KCC-19 (KACC91816P) 균주는 부패 미생물의 활성을 저하시키고 생육을 억제시켜 항균 활성을 나타낼 수 있다.

상기와 같은 우수한 항균 효과로 인해 상기 균주는 항균용 조성물 제조에 이용할 수 있으며, 특히, 우수한 프로바이오틱 효과로 인해서 다양한 항균용 조성물을 포함하는 식품, 의약품, 화장품, 건강식품 등의 제조에 이용될 수 있다.

본 발명의 항균용 조성물이 포함되는 식품, 의약품, 화장품, 건강식품 등의 제조는 업계에서 일반적으로 실시하는 방법을 통하여 제조될 수 있다.

본 발명의 발명자들은 본 발명의 신규 균주가 독성이 없으면서, 항균 활성이 뛰어나, 우수한 프로바이오틱 제제로 이용될 수 있다는 것을 실험을 통해서 밝혀내었다.

본 발명의 균주는 바람직하게는 상기 우수한 항균 활성으로 인해 사일리지 제조시 저장성을 증진시킬 수 있고, 영양성분의 파괴를 예방할 수 있다.

또한, 부패 미생물등과 같은 원하지 않는 미생물에 의한 사일리지 풍미 감소 등을 예방하여, 가축의 기호성을 증진시킬 수 있는 추가 효과까지 얻을 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예들에 따르면, 본 발명의 신규 균주는 우수한 항산화 활성을 가지며, 본 발명의 균주를 포함하는 항산화용 조성물을 제공할 수 있다.

일반적으로 활성산소는 단백질의 SH기와 반응해서 효소의 활성을 잃게 하거나 가교결합의 형성, DNA, RNA, 효소 및 세포막을 구성하고 있는 불포화 지방산을 산화시켜 과산화지질을 형성하게 하는데, 과산화지질은 생체에 매우 유독하여 생체의 기능을 저하시켜서 결국에는 혈액순환장애, 피로, 심장병, 간장장애, 발암 등과 같은 질병의 원인이 되고 궁극적으로 노화의 원인이 된다.

본 발명의 발명자들은 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) KCC-19 (KACC91816P) 균주가 항균 효과뿐만 아니라, 상기 활성산소의 억제 효과, 즉 항산화 효과가 우수함을 실험을 통해 확인하였다.

상기와 같은 우수한 항산화 효과로 인해 상기 균주는 항산화용 조성물 제조에 이용할 수 있으며, 특히, 우수한 프로바이오틱 효과로 인해서 다양한 항산화용 조성물을 포함하는 식품, 의약품, 화장품, 건강식품 등의 제조에 이용될 수 있다.

발명의 항산화용 조성물이 포함되는 식품, 의약품, 화장품, 건강식품 등의 제조는 업계에서 일반적으로 실시하는 방법을 통하여 제조될 수 있다.

본 발명의 발명자들은 본 발명의 신규 균주가 독성이 없으면서, 항산화 활성이 뛰어나, 우수한 프로바이오틱 제제로 이용될 수 있다는 것을 실험을 통해서 밝혀내었다.

본 발명은 상기 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) KCC-19 (KACC91816P) 균주를 포함하는 식물체 사일리지 발효용 미생물 첨가제를 또한 제공한다.

상기 식물체 사일리지 발효용 미생물 첨가제를 첨가하는 대상이 되는 식물체는, 예를 들어 볏짚, 라이그라스(ryegrass), 총체보리, 총체벼, 호밀 또는 옥수수일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 가축의 사료로 이용될 수 있는 식물체라면 모두 이용될 수 있으나, 바람직하게는 이탈리안 라이그라스에 이용하는 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 발명자들은 상기 균주가 이탈리안 라이그라스 사일리지 추출물을 첨가한 배지에서 호기, 미호기 및 혐기성 조건 모두에서 우수한 성장 속도를 나타냄을 확인하였다(도 6 내지 8 참조).

상기 식물체 사일리지 발효용 미생물 첨가제는 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) KCC-19 (KACC91816P) 균주를 포함하는 배양원액, 또는 상기 배양원액의 희석액의 형태로 첨가할 수 있다.

또한 본 발명은 식물체에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-19 (KACC91816P) 균주를 첨가하는 것을 특징으로 하는 식물체 사일리지 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 식물체 사일리지 제조방법은 당업계에서 사용되는 일반적인 방법으로서, 예를 들어 식물체의 발효를 위한 복수의 발효 단계들을 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 복수의 발효 단계들은, 예를 들어 혐기성균인 초산균의 발효 단계 및 이후 젖산균의 발효 단계 등을 포함할 수 있으며, 당업자에 의해 적절한 조건으로 수행될 수 있다.

본 발명은 또한 상기 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) KCC-19 (KACC91816P) 균주를 포함하는 사료 첨가제를 제공한다.

본 발명의 사료 첨가제는 업계에서 일반적으로 이용되는 방법으로 제조될 수 있다.

본 발명의 상기 신규 균주가 독성이 없으면서, 항균 활성이 뛰어나, 우수한 프로바이오틱 제제로 이용될 수 있고, 이러한 신규 균주는 우수한 항균 활성으로 인해 사료 첨가제 제조시 저장성을 증진시킬 수 있고, 영양성분의 파괴를 예방할 수 있다.

본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 KCC-19는 우수한 항균 활성을 가진다.

또한, 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 KCC-19는 항산화 효과가 우수하다.

본 발명에 따른 상기 균주를 이용하여 다양한 항균용 조성물을 제조할 수 있다.

본 발명의 균주를 이용하여 제조된 식물체 사일리지는 가축의 소화율을 개선할 수 있고, 항균 효과가 우수하며, 풍미 개선으로 기호성을 향상시킬 수 있어 가축의 품질과 생산성을 높일 수 있다.

또한 상기 사일리지는 저장성이 향상되어 농가 소득 증대에 크게 기여할 수 있다.

본 발명의 항균용 조성물 또는 항산화용 조성물은 독성이 없어 우수한 프로바이오틱 효과를 가지므로, 식품, 의약품, 화장품, 건강식품 등 다양한 형태로 활용될 수 있다.

도 1은 호기, 미호기 및 혐기성 조건에서 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-19의 성장 및 대사산물 프로파일을 나타낸다.
도 2는 미생물의 종류에 따른 곰팡이 바이오매스 저지 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 시간에 따른 페닐 락트산 생성량 및 흡광도를 나타낸 그래프이다.
도 4는 배지 조성에 따른 생균수를 나타낸 그래프이다.
도 5는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-19의 농도에 따른 항산화 소거능을 나타낸 그래프이다.
도 6은 이탈리안 라이그라스 추출물을 포함하는 배지에서 호기성 조건일 때 KCC-19 균주의 흡광도를 나타낸 그래프이다.
도 7은 이탈리안 라이그라스 추출물을 포함하는 배지에서 혐기성 조건일 때 KCC-19 균주의 흡광도를 나타낸 그래프이다.
도 8은 이탈리안 라이그라스 추출물을 포함하는 배지에서 미호기성 조건일 때 KCC-19 균주의 흡광도를 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

시약 및 배양 배지

Antibiotic discs 및 배양 배지는 인도, Himedia,에서 구입하였다. API 50CHB 및 API-ZYM test kits는 프랑스, Bio-Merieux SA, Marcy I’Etoile에서 구입하였다. 글루코스 및 다른 화합물들은 Sigma-Aldrich로부터 구입하였다. 2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) 및 다른 시약들과 MRS medium는 Sigma-Aldrich로부터 구입하였다.

항곰팡이성 L. plantarum KCC-19의 분리 및 동정

L. plantarum KCC-19는 Arasu et al. (2013)에 기술된 방법에 따라 crimson silage로부터 분리하였다. KCC-19의 항곰팡이성 저지 스펙트럼은 Arasu et al. (2013)에 따라, indicator (Arasu et al. 2013)로 G. moniliformis 및 A. fumigatus을 사용하여, MRS agar plates에서 diffusion method 및 agar overlay method를 이용하여 결정하였다. KCC-19는 생화학적 프로파일 및 발효 패턴 연구를 기초로 확인하였다. 생화학적 프로파일은 systemic bacteriology의 Bergey’s manual에 따라 수행하였다. API 50CHL test (BioMerieux, France)는 발효 패턴에 따른 동정을 이용하였다. 16S ribosomal DNA 유전자는 Taq DNA 중합효소, following primers: 27 forward primer (5' AGA GTT TGA TCG TGG CTC AG 3') 및 1492 reverse primer (3' GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 5')로 PCR을 수행하여 KCC-19 균주의 게놈 DNA를 증폭하였다. 증폭된 PCR 산물은 QIAquickPCR purification Kit (Qiagen Ltd., Crawley, UK)로 정제하였다. 1500개의 염기쌍은 Solgent Co. Ltd. (Seoul, Korea)에서 시퀀싱하였다. 얻어진 서열은 NCBI 데이터 베이스의 BLAST search을 이용하였다. 상기 균주는 20% glycerol을 포함하는 MRS 배양액에서 -80 °C로 저장하였다. 상기 보존 배양은 실험전 18시간동안 MRS 배양액에서 두배 증식하였다.

핵산 서열 및 배양 accession number

L. plantaram KCC-19의 16S rDNA 서열은 NCBI 핵산 서열번호 KC571201으로 등록하였다. L. plantaram KCC-19 순수 배양은 국립농업과학원 농업유전자자원센터에 기탁하였으며, 수탁번호 KACC91816P를 부여받았다.

Lactobacillus sp . KCC-19의 곰팡이 바이오매스 저지 효과

곰팡이 바이오매스 저지는 100 mL MRS 배양액을 포함하는 250 ml Erlenmeyer flasks에 mid-log phase의 Lactobacillus sp. KCC-19를 접종하고 orbital incubator shaker에서 48 h동안 30^oC로 배양하여 관찰하였다. 무세포 상청액들은 12,000 rpm 으로 20 min간 원심분리하여 수집하였다. 40 mL PD 배양액의 상청액 (10 mL)은 50 mL flasks에 두고 각각의 테스트 곰팡이를 세번 접종하였다. 상기 곰팡이 균주는 5일간 30^oC에서 배양하였다. 발효조가 없는 플라스크를 양성 대조군으로 삼았다. 모든 곰팡이 균주의 성장능은 100 mM acetic acid, lactic acid, 및 succinic acid을 포함하는 PD 배양액에서 각각 체크하였는데, 이는 곰팡이 억제는 성장 배지의 영향 결핍 또는 산 생산 때문에 일어나는 것이 아니라는 것을 확실히 하기 위해서이다. 배양 후, 곰팡이 성장은 preweighed Whatman #1 filter paper에서 기건되어진 세포들을 수집하여 측정하였다. 평균 곰팡이 바이오매스는 테스트 곰팡이를 각각 측정하고 양성 대조군의 곰팡이 바이오매스와 비교하였다.

*항곰팡이 대사산물의 분리 및 동정

Lactobacillus sp. KCC-19는 2% glucose를 함유하는 3.0 L MRS 배양액을 포함하는 살균된 5 L Erlenmeyer에서 30^oC로 3일간 배양하였다. OD₆₀₀값 0.5의 준비된 세포를 스타터 배양으로 사용하였다. 발효 사이클의 마지막에, 항곰팡이성 대사산물을 포함하는 발효 배지를 12,000 rpm으로 30분간 원심분리하였다. 상청액은 hexane, ethyl acetate 및chloroform (3 × 300 mL)을 이용하여 추출하였다. 용매상은 항곰팡이 바이오매스 무정제 추출물을 얻기 위해 진공상태로 35^oC에서 농축하였다. 에틸 아세테이트 추출물은 헥산/에틸 아세테이트 혼합 용매를 이용하여 정제하였다. 순수 화합물은 ¹H nuclear magnetic resonance (NMR) (300 MHz)을 이용하여 분광기 분석을 실시하였다. ¹³C NMR spectrum은 AL-300 JEOL instrument (75.45 MHz)으로 측정하였고 전기분무 이온화 질량 분광을 기록하였다. KBr pellet method을 이용하여 적외선 분광을 기록하였다.

최소 저지 농도

최소 저지 농도(MIC)측정은 표준 참고 방법 (NCCLS 1999)에 따라 수행하였다. 화합물은 2% dimethyl sulfoxide (DMSO)와 함께 살균수에 용해시켰다. 초기 테스트 농도는 연속해서 2배씩 희석하였다. MIC는 테스트 배양의 가시적인 성장을 저지하는 가장 낮은 추출물의 농도를 측정하여 나타냈다. 항박테리아 및 항곰팡이 활성을 확인하기 위하여 세번 반복 실시하였다.

항미생물 대사산물 생산에서 질소원에 따른 영향

발효 실험을 위한 접종물을 준비하기 위하여, glycerol stock vial은 50 ml MRS medium를 포함하는 250 mL flask를 접종하기위해 사용하였다. 종균 활성 배양은 30 ^oC로 16시간동안 키웠다. 활성 배양의 두 세대는 옮겨진 대사적으로 활성인 세포들의 발효 전에 준비시켰다. 이러한 활성 배양은 종균 접종으로 사용하였다. 비연속적 발효(Batch fermentation)는 1리터 플라스크에서 수행하였다. 그 다음. 10 % (v/v) 접종물은 발효를 위해 살균된 250 mL의 MRS에 무균상태로 추가되었다. 배지가 혼합되기 충분할 정도의 낮은 속도(150 rpm)에서 교반하였다. 발효 온도는 30 ^oC로 맞추었다. 옥수수 침지액 (1%), 페닐알라닌 (5 mM) 및 트립토판 (5 mM)과 같은 다른 종류의 질소원들에 따른 항곰팡이 대사산물 생산을 연구하기 위하여 초기 MRS 배양액에 공급되었다. 발효는 48시간동안 수행하였다. 세포 및 항곰팡이 대사산물, 3-페닐 락트산의 농도를 결정하기 위하여 샘플을 주기적으로 제거하였다.

KCC-19의 단백질 분해 활성

단백질 분해 활성은 10% skim milk 에서 30°C로 42h시간 키운 KCC-19 로 측정하였다. 흡광도는 ELISA reader (Bio-Radad) (Citi et al. 1963)로 650 nm 에서 확인하였다. 결과는 검량선에 따라 milligrams/milliliter 티로신으로 표현하였다.

KCC-19 가 생산하는 자유 아미노산의 정량

탈지유에서 30°C로 42h시간 키운 KCC-19 를 준비하였다. 약 5 Ml의 발효된 탈지유를 10% (v/v) 메타포스페이트 10 mL와 혼합하고 4°C에서 20분간 12,000 rpm으로 원심분리하였다. 이후, 1 mL의 상청액을 1 mL의 시트르산 버퍼(pH 2.2)와 혼합하고 HPLC를 이용하여 양적으로 측정하였다.

낮은 pH에서 KCC-19의 성장

낮은 pH에 대한 내성은 한천평판배양법으로 결정하였다. 간단히 말해, 활성 KCC-19는 MRS 배양액에서 키우고 pH 2.5로 염산(1.0 N)을 이용해 조절한 신선한 10 mL의 MRS 배양액에 접종되었으며(1%), 30°C로 3시간 배양하였다. 샘플에서 MRS agar plates에 적절히 희석액을 플레이팅하여 초기 박테리아 수 및 0 와 3 h 에 남아있는 세포 수를 각각 측정하였다. 상기 플레이트는 30°C 로 48 h 동 안 배양하였고 자란 콜로니 수를 세었다. 실험은 3배수 실시하였다.

KCC-19의 담즙 내성 수준

두 개의 다른 담즙 염이 존재할 때 KCC-19이 자라나는 능력을, 약간의 변형을 가한 Vinderola 및 Reinheimer (2003) 방법에 따라 연구하였다. MRS-thiobroth (0.2% 소듐 티오글리콜레이트가 공급된 MRS) 및 0.3% (w/v) Oxgall가 공급된 MRS-thiobroth를 준비하고 KCC-19 1% 부유액을 접종하였다. Oxgall이 없는 샘플은 대조군으로 이용하였다. 30°C에서 24시간 배양한 후에, 박테리아의 농도는 적절한 희석액으로 플레이팅한 MRS agar에서 생균수로 체크하였다. 실험은 3배수 실시하였다.

KCC-19의 항균제 감수성(antibiotic sensitivity) 및 저항성 패턴 결정

Lactobacillus sp. KCC-19의 항균제 감수성 및 저항성을 Arasu et al. (2013)에 나타난 disc diffusion method를 이용하여 분석하였다. 박테리아 접종물은 30°C에서 24시간 MRS 배지에서 배양한 세포를 준비하였다. 25 mL의 살균된 MRS 배지를 준비하였다. 시험 균주는 굳어진 배지의 윗부분에 도말하고 10분간 건조시켰다. 다른 농도를 갖는 항균성 디스크는 배지 표면에 두고 항균제의 확선을 위해 실온에서 30분간 방치하였다. 플레이트는 48 h 동안 30 ^oC에서 배양하였다. inhibition zone은 밀리미터로 기록하고 실험은 3배수 실시하였다.

KCC-19의 용혈성 활성( Haemolytic activity)

OD_600nm값 0.5의 KCC-19를 5% (w/v) 혈액을 포함하는 agar 플레이트에 도말하고 30°C에서 48시간 배양하였다(Maragkoudakis et al. 2006).

KCC-19의 세포 표면 소수성 측정

세포 표면 소수성 분석은 Lee et al. (2011)를 약간 변형한 방법으로 수행하였다. 간단히 말해, 준비된 세포를 8000 rpm 으로 10 min간 원심분리하였다. cells는 PBS (pH 7.0)로 두번 세척하였다. 현탁액의 1 mL는 OD₅₈₀nm에서 흡광도를 측정하는데 사용되었다. 현탁액의 다른 1 mL는 동일한 부피의 n-헥사데칸 (Sigma, USA)에 추가되었고 vortex를 이용하여 2분간 혼합하였다. 상이 분리되도록 하기 위해서 30분간 실온에두었고, 가장 상층액 1 mL는 제거하고 OD₅₈₀nm에서 흡광도를 측정하였다. 소수성 퍼센트는 다음과 같이 계산하였다:(OD580 reading 1- OD580 reading2/ OD580 reading 1) × 100=% hydrophobicity.

KCC-19의 항산화 활성

KCC-19의 항산화 효과는 Li et al. (2012)등의 방법에 약간의 변형을 가한 방법에 따라 DPPH 자유 라디칼 소거능을 측정하였다. 간단히 말해, 1.0, 1.5, 2.0 및 2.5 mL의 KCC-19 cells (10⁹CFU/mL)는 1.0 ml의 메탄올성 DPPH 라디칼 용액 (0.05 mM)에 추가하였다. 상기 혼합물은 강하게 혼합하고 암조건에서 30분간 실온에서 배양하였다. 대조군은 오로지 탈이온수 및 DPPH solution을 포함하였다. Blank는 오로지 메탄올 및 cell만을 포함하였다. resulting solution의 흡광도는 12000 rpm 으로 10 분간 원심분리한 후에, 517nm에서 세 번 측정하였다.

소거능 (%) = [1-(A _sample-A _blank)/A _control]x100

분석 방법

세포 농도는 ELISA reader (Bio-Radad)로 600 _nm에서 OD값을 측정하여 결정하였다. 배양액의 3-페닐 락트산의 농도는 고성능 액체 크로마토그래피(Agilent Technologies, USA)를 이용하여 측정하였다. 10,000 g의 배양 샘플을 10분간 원심분리하여 얻은 상청액들은 Tuffryn membrane (Acrodisc, Pall Life Sciences)을 통하여 걸렀으며, 메탄올/0.05 % 트리플루오로 아세트산 (solvent A) 및 0.5 mL/min 에서 이동상으로 물/0.05 % 트리플루오로 아세트산을 이용하여 65°C에서 SB-C₁₈column(4.6mm×150mm,5)을 통해 추출하였다. 아미노산 정량을 위하여, 크로마토그래피 분리는 guard colum Zorbax Eclipse AAA 4-Pack (12.5×4.6 mm, i.d.)과 함께 Zorbax Eclipse AAA analytical (150 × 4.6 mm i.d., particle size 5 μm) column을 이용하여 수행하였으며, 상기 두 개의 column은 Agilent Technologies에서 구입하였다. 338 _nm의 파장에서 검출하였으며, column oven 온도는 40^oC로 맞추었다. 주입 슬링(sling)은 10 μl를 주입하였다. 용매계는 2.0 ml/min의 비율로 전달되고 (A) sodium dihydrogen phosphate 버퍼(40 mM) 및 (B) 아세토니트릴:메탄올:증류수 (45:45:10, v/v/v)의 혼합물로 이루어져 있다. gradient program은 다음과 같다: 0-1.9 min, 0% B; 2-21 min, 57% B; 21.1-25 min, 100% B; 25.1-30 min, 0% B.

미생물

박테리아: B. subtilis(ATCC7972), Enterococcuscloacae(ATCC29212), Staphylococcusaureus(ATCC25923),S.epidermidis(MTCC3615).

곰팡이: Aspergillusclavatus(KCTC40071), A.fumigates(KCTC40080), A.niger(KCTC40280), A. oryzae(KCTC44823), Curvularialunata(KCTC40392), Fusariumoxysporum(KCTC40051), Gibberellamoniliformis(KCTC44022), Humicolagrisea(KCTC40860), Penicilliumchrysogenum(KCTC40399) 및 P. roqueforti (KCTC 41354)는 실험을 위해 사용되었다.

결과

crimson silage로 부터 얻은 락토바실러스 균주 KCC-19는 박테리아 및 곰팡이의 성장을 잠재적으로 저지하고, 항산화제 및 프로바이오틱으로 이용할 수 있는 특성들을 선발하였다. 전체 155 LAB 콜로니들은 crimson silage로부터 분리하였고 박테리아 및 손상 진균류(spoilage fungus)에 대한 항미생물 효과를 스크리닝하였다. 의심되는 LAB 균주의 28%에서 항곰팡이 효과가 발견되었고, 17%는 우수한 항박테리아 활성을 나타내었다. 이들 균주 중에서, KCC-19 균주는 B. subtilis, E.cloacae, S. aureus, S. epidermidis와 같은 식품 부패 미생물 및 A. clavatus, A.fumigates, A.niger, A. oryzae, C. lunata, F. oxysporum, G. moniliformis, H.grisea, P. chrysogenum 및 P. roqueforti과 같은 곰팡이의 성장을 억제하였다. 균주 KCC-19는 그람-양성, 카탈라제 음성 그리고 당 발효를 할 수 있으며 산을 분비하였다. 모든 테스트 부패 균들에 대해서 가장 높은 항미생물 활성을 나타내었다. 균주 KCC-19는 생리학적, 생화학적 특성을 확인하였으며 세균 계통분류학의 Bergey’s manual에 언급된 정보를 확인하였다. 상기 균주의 탄수화물 발효 패턴은 API 50 CHL micro identification system을 통하여 확인하였다. 16S rDNA 유전자 증폭 및 시퀀싱 분석을 통하여 상기 균주 KCC-19 가 L. plantarum와 100% 상동성이 있음을 확인하였다. 상기 균주는 기탁번호 KACC91816P으로 기탁하였다.

쉐이크 플라스크(Shake flask) 배양 및 KCC-19의 세포 외 대사산물 생산 프로파일

KCC-19 균주 및 KACC 91096의 세포 외 대사산물 생산 프로파일은 호기성 조건으로 MRS 배지에서 배양하여 측정하였다. 다른 표준 LAB 균주들과 비교를 한 결과, KCC-19는 상대적으로 초기 단계에서 우수한 성장률을 보였다(도 1 참조). 6시간 배양 후 KCC-19 및 KACC 91096 균주들의 OD₆₀₀값은 각각, 1.41 및 1.28으로 기록되었다. KCC-19 및 KACC 91096의 μmax 값은 각각 0.193 및 0.123/h로 나타났다. 산화적 대사는 필수적인 세포 성장 성분의 합성에 중요한 역할을 하므로, 산화경로의 활성화 때문에 KCC-19의 성장율이 더 좋을 것으로 생각되었다. 이러한 결과는 24시간 배양후에, 발효된 배양액의 pH 가 3.7로 떨어지는 것으로부터 알 수 있었다. 이것은 분명히, LAB 균주들은 유기산을 분비할 수 있다는 것을 나타낸다. KACC 91096은 상대적으로 가장 많은 양의 젖산을 24시간 배양후에 생산하였고, KCC-19는 또한 상당히 많은 양의 젖산, 아세트산 및 숙신산들을 생산하였다.

KCC-19의 항곰팡이 바이오매스 저지 효과

KCC-19의 발효액은 여과후에 항곰팡이 활성을 측정하였다. 폐배지(spent medium)는 분명히, 곰팡이 바이오매스의 건조 중량 측정에 근거할 때 유기산을 포함하는. MRS 대조군 및 MRS 배지와 비교하여 곰팡의 성장을 억제하였다(도 2 참조). 이러한 결과를 통해 KCC-19의 상청액은 9개의 곰팡이 균주들에 대해 더 좋은 항곰팡이 활성을 가지고 있다는 것을 밝혔다. F. oxysporum, A. oryzae, A. clavatus 및 A. niger는 곰팡이들 중에서 가장 감수성이 높은, 60%이상의 곰팡이 바이오매스 저지를 기록하였으며,A .fumigates, P. chrysogenum 및 H. grisea는 각각 55.5% 내지 58.7%의 범위를 기록하였으나, 다른 부패 균들에 대해서는 활성이 낮았다. 유기산은 곰팡이 바이오매스 성장에서 분명한 감소를 보여주지 않았는데, 이것은 폐배지에서 다른 대사산물이 존재한다는 것을 입증하는 것이다.

저지 특성 및 항곰팡이 대사산물의 동정

항곰팡이 대사산물은 헥산, 클로로포름 및 에틸 아세테이트와 같은 유기 용매를 이용하여 순차적으로 분리되었다. 이들 추출물의 항박테리아 감수성 패턴은 KCC-19로부터 획득한 에틸 아세테이트 추출물이 분명한 활성을 보여줌으로써 밝혀졌다(하기 표 1 참조).

미정제 추출물의 항박테리아 및 항곰팡이 활성 및 Lactobacillus plantarum KCC-19 에서 획득한 화합물

Microorganism	Minimum Inhibitory Concentration (MIC) (mg/mL)
Microorganism	HE	CE	EE	C	S*
Bacteria:
B. subtilis	__	__	10.00	10.00	2.5
E. cloacae	__	__	10.00	10.00	25
S. aureus	__	__	10.00	>5.00	6.25
S. epidermidis	__	__	5.00	>5.00	50
Fungi:
A. clavatus	10.00	ND	7.50	2.50	50
A. fumigates	10.00	__	7.50	5.00	50
A. niger	10.00	__	10.00	5.00	25
A. oryzae	__	__	5.00	2.50	25
C. lunata	__	__	10.00	5.00	37.5
F. oxysporum	>10.00	__	5.00	7.50	25
G. moniliformis	10.00	ND	10.00	5.00	75
H. grisea	__	__	__	10.00	100
P. chrysogenum	>10.00	>10.00	5.00	2.50	50
P. roqueforti	>10.00	>10.00	10.00	2.50	25
S (streptomycin), bacterial control reference; S (ketoconazole), fungal control reference; HE, hexane extract; CE, chloroform extract; EA, ethyl acetate extract; C, compound; ND, not determined.

상기 표 1을 참조하면, S. epidermidis는 MIC 5 mg/ mL을 나타냈으나, 다른 추출물들은 MIC 10 mg/ml을 각각 나타냈다. 헥산 및 클로로포름 추출물은 박테리아 균주에 대해 활성을 나타냈다. 헥산 및 에틸 아세테이트 추출물은 곰팡이 균주들에 대해 눈에 띄는 antagonistic activity을 나타냈고 에틸 아세테이트 추출물은 헥산 추출물에 비해서 상대적으로 더 우수한 활성을 보였다. 헥산 추출물은 A. clavatus, A.fumigates, A.niger 및 G. moniliformis들에서 MIC 10 mg/ mL을 나타냈다. A. oryzae, C. lunata , 및 H. grisea에는 활성을 보이지 않았다. 에틸 아세테이트 추출물은 A. oryzae , F. oxysporum 및 P. chrysogenum에 대해 MIC 5 mg/ mL을 보였다. 에틸 아세테이트 추출물의 MIC 5 값은 다른 추출물들에 비해 상대적으로 더 우수한 활성을 보여주었다. 화합물의 MIC 값은 항생제 스트렙토마이신 및 케타코나졸 표준 광역(항균) 스펙트럼을 비교한다. 그러나, 화합물들은 MIC값 2.5-10 mg/ mL을 갖는 항곰팡이 균주에 대해 활성을 보여주었다. 화합물들은 담갈색이며 반고체이며 밝혀졌다(M+ m/z 165). 상기 화합물은 페닐기를 가지는 것으로 밝혀졌고, IR, ¹HNMR및 13C NMR 스펙트럼을 통하여 구조를 밝혀내었다. 상기 질량 스펙트럼은 m/z 165에서 분자이온 피크 (100%) 및 다른 관련 fragment를 보였다.

대사산물에 대한 질소원의 효과

대사산물 생산에 대한 다른 질소원들의 효과는 호기성 조건으로 측정하였다. 24시간 배양 후, 옥수수 침지액(corn steep liquor), 페닐 알라닌(phenyl alanine), 트립토판(tryptophan) 및 MRS 배지에서 기록된 OD₆₀₀은 각각 3.61, 3.25, 3.19 및 3.1이었다(도 3 참조). 48시간에서 최종 페닐 락트산 농도는 상대적으로 페닐 알라닌의 농도(3.77 mM)보다 높았으며, 뒤이어 CSL (3.49 mM)보다도 높았다. 대조군 MRS 배지 및 트립토판에서, 생산 패턴은 상대적으로 유사하였다. 이러한 결과는 분명 CSL 및 페닐알라닌은 성장 및 항곰팡이 대사산물 생산에서 최고의 질소원이라는 것을 나타내었다.

발효유에서 다양한 유리 아미노산

KCC-19의 단백질 분해 활성은 8.3 / mL 티로신 유리로 측정하였다. 발효된 탈지 분유에 존재하는 각각의 유리 아미노산의 양은 HPLC를 이용하여 정량하였다. 자유 아미노산의 함량은 1.81 mg/1000 mL 내지 120.5 mg/1000 mL의 범위를 나타냈다(하기 표 2 참조).

Lactobacillus plantarum KCC-19에 의한 발효된 탈지 분유에서 유리 아미노산의 함량 (mg/1000 mL) (n=3)

No.a)	Amino Acids	Quantity (mg/ 1000 mL)
1	Aspartate	31.08± 0.14
2	Glutamate	120.50± 0.53
3	Asparagine	27.70± 0.60
4	Serine	17.87± 0.34
5	Glutamine	9.68± 0.59
6	Histidine	4.38± 0.13
7	Glycine	23.15± 0.77
8	Threonine	11.33± 0.577
9	Arginine	45.56± 0.51
10	Alanine	9.51± 0.47
11	Tyrosine	1.81± 0.11
12	Cystine	6.32± 0.27
13	Valine	27.03± 0.05
14	Norvaline	NDb)
15	Methionine	38.13± 0.32
16	Tyrptophan	29.50± 0.49
17	Phenyl alanine	83.3
18	Isoleucine	30.65± 0.43
19	Leucine	73.39± 0.52
20	Proline	61.15± 0.78
21	Lysine	17.28± 0.29
^a)No., the elution order of free amino acids from HPLC chromatograms. ^b)ND,notdetected.

상기 표 2에 나타난 바에 따르면, 아르기닌, 히스티딘, 이소루신, 루신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 및 발린을 포함하는 9개의 필수 아미노산이, 유리된 아미노산의 전체 함량의 48%를 차지하였다. 필수 아미노산들 중에서; 페닐알라닌이 가장 높은 함량을 나타냈고(83.3 mg/1000 mL) 전체 필수 아미노산의 >26%을 기록하였으며, 반면에 히스티딘은 가장 낮은 수준을 기록하였다(4.38 mg/1000 mL). 발효유에서 발견된 주요 아미노산들은 글루타민 (120.5 mg/1000 mL), 루신 (73.39 mg/ 1000 mL), 아르기니 (45.56 mg/1000 mL)이다. 그러나 발린은 발효된 시료에서 발견되지 않았다.

L. plantaram KCC-19의 프로바이오틱 특성

위장에서 미생물의 생존 능력은 유익한 프로바이오틱 세균의 가장 중요한 특징 가운데 하나이다. 그러므로, 낮은 pH 및 고농도의 담즘 염 환경에서 KCC-19 의 생존능력을 연구하였다. pH 2.5, 3.0 및 4.0에서 L. plantarum KCC-19의 생존력은 표 3에 나타냈다.

상기 표 3은 Lactobacillus plantarum KCC-19의 프로바이오틱 특성을 나타낸 것이다.

상기 표 3에 나타나 결과에 따르면, 세포는 대조군에서 잘 자랐으며, pH 2.5에서 생존력이 점차 감소하였고, pH 3.0 및 4.0에서 균주들이 안정적으로 성장하는 것을 보여주었다. 담즙 염(Oxgall (0.2% and 0.3%) 및 소듐 타우로콜레이트 (0.2% 및 0.3%)의 존재 하에서 상기 균주들의 생존 능력은 도 4에 나타냈다. 이러한 결과는 상기 균주는 소듐 타우로콜레이트가 존재할 때 자랄 수 있으나, oxgall에 약한 민감도를 가진다는 것을 나타내었다. 상기 균주는 agar의 용혈성에 대해서 negative 결과를 보였고, 따라서 자연 상태에서 독성이 없는 것을 알 수 있었으며 높은 소수성을 보여주었다(100%). 본 연구에서 시험한 모든 항균제들은 L. plantarum KCC-19의 성장을 저지하였고 유사한 민감도 패턴을 보여주었다(표 4 참조)

상기 표 4는 Lactobacillu splantarum KCC-19에 대한 다양한 항균제들의 상대적인 감수성 패턴을 나타낸 것이다.

상기 표 4의 inhibition zone은 MRS agar 배지(MRSA)에서 30^oC로 48시간 동안 상기 균주들을 배양한 후에 측정하였다. 본 발명의 균주는 프로바이오틱스로 사용하기에 안전하다고 생각된다.

자유 라디칼 소거능

L. plantarum KCC-19의 자유 라디칼 소거 효과는 DPPH 용량 의존적으로 활성이 나타나는 것으로 밝혀졌고, 2.5 mL의 10⁹CFU/mL에서 높은 라디칼 소거능(41.22%)을 가지는 것으로 나타났다(도 5 참조).

국립농업과학원 농업유전자원센터

KACC91816P

20130506

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락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-19 (KACC91816P) 균주를 포함하는 항산화용 가축 사일리지 사료 조성물.
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