KR100631857B1 - 감마아미노부틸산(ｇａｂａ) 고생산성 균주인락토바실러스 브레비스 오피케이-3 - Google Patents
감마아미노부틸산(ｇａｂａ) 고생산성 균주인락토바실러스 브레비스 오피케이-3 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 감마아미노부틸산(GABA)의 생산능이 우수한 락토바실러스 브레비스 오피케이-3 및 그 용도로서, 스트레스에 시달리는 현대인이나 수험생, 알코올 과다 섭취자 등 GABA 농도가 낮아 이의 보충을 요하는 사람에게 매우 유용한 식품첨가물, 사료첨가물 또는 의학적 용도로서 제공될 수 있다.
감마아미노부틸산, 락토바실러스 브레비스
Description
본 발명은 신규한 감마아미노부틸산(GABA)을 고농도로 생산할 수 있는 유산균주에 관한 것으로, 보다 상세하게는 김치로부터 분리해 낸 유산균으로서 감마아미노부틸산(GABA)을 고농도로 생산하는 락토바실러스 브레비스 종에 속하는 신규한 미생물에 관한 것이다.
김치는 우리고유의 발효식품으로서 풍부한 유산균을 내포하고 있어 성인병 예방, 항암 효과, 소화 및 강장효과 등의 영양학적 우수성을 지니고 있다. 또한 사스의 돌풍으로 인해 피해가 막심했던 중국 및 대만 등지에서도 김치가 사스 예방에 효과가 있다고 알려지면서 소비가 증가된 것으로 알려져 있다. 김치유산균을 배양하게 되면 배양유산균 및 그 생성물을 여러 기능성 식품의 소재로 활용할 수 있다. 유산균은 배양조건의 최적화를 통해 대량배양 및 고부가가치를 가지는 유용물질의 대량 생산이 가능하고 균주나 세포 고정화를 통해서 유용물질을 고순도로 생산할 수 있다.
감마아미노부틸산(GABA)은 억제성 신경전달물질로서 혈압상승을 억제하고 시력증진에 효과가 있으며 불안감, 초조감 등을 진정시키는 작용을 하는 것으로 알려진 물질이다. 동물의 경우 뇌, 심장, 폐, 신장 등에 분포되어 있으며, 식물의 경우 발아현미, 녹차 등에서 주로 발견되고 있다. 스트레스에 시달리는 현대인이나 수험생, 알코올 과다 섭취자의 경우 뇌와 혈중 GABA 농도가 낮은 것으로 보고되어 있으며, 체내 GABA 농도의 극심한 부족은 발작, 경련, 간질 증세를 일으키는 것으로 알려져 있어 이들 증세를 완화 내지는 치료하기 위해 체내 GABA 농도를 높이고자 하는 식품 또는 약제개발의 노력이 요구되고 있지만, 현재까지 김치로부터 GABA를 고농도로 생산하는 유산균주를 개발한 사례는 매우 미미하다.
본 발명은 상기 종래기술이 가지는 문제를 해결하기 위해 제안된 것으로 그 목적은 스트레스에 시달리는 현대인이나 수험생, 알코올 과다 섭취자 등 GABA 농도가 낮은 사람에게 매우 유용한 GABA 고생산능을 가지는 유산균주를 제공함에 있다.
본 발명의 다른 목적은 GABA 고생산능을 가지는 유산균주를 배양하여 배양물로부터 GABA를 제조하는 방법을 제공함에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 GABA 고생산성 균주 또는 동균주가 생산하는 GABA를 함유하는 식품조성물을 제공함에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 GABA 고생산성 균주 또는 동균주가 생산하는 GABA 를 함유하는 가축급여용 사료조성물을 제공함에 있다.
상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 감마아미노부틸산(GABA) 고생산성 균주인 락토바실러스 브레비스 오피케이-3을 제공한다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 브레비스 오피케이-3 균을 배양하여 배양물로부터 감마아미노부틸산(GABA)를 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 감마아미노부틸산(GABA) 고생산성 균주인 락토바실러스 브레비스 오피케이-3 또는 동균주가 생산하는 감마아미노부틸산(GABA)를 함유하는 식품조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 감마아미노부틸산(GABA) 고생산성 균주인 락토바실러스 브레비스 오피케이-3 또는 동균주가 생산하는 감마아미노부틸산(GABA)를 함유하는 사료조성물을 제공한다.
이하, 본 발명의 내용을 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 발명에 따른 균주는 감마아미노부틸산(GABA)의 생산능이 우수한 락토바실러스 브레비스 오피케이-3으로서, 스트레스에 시달리는 현대인이나 수험생, 알코올 과다 섭취자 등 GABA 농도가 낮아 이의 보충을 요하는 사람에게 매우 유용한 식품첨가물, 사료첨가물 또는 의학적 용도로서 제공될 수 있다.
본 발명에 따른 균주는 막대모양의 간균의 형태를 가지고 있으며, 통성혐기성이며 때로는 호기적으로 작용을 하여 자라며, 장안에 정착하여 정장작용에 도움 을 주는 것으로 확인되었다.
또한, 최적생육온도는 35∼37℃로 나타났으며, 그람양성으로서 운동성은 양호하였으며, 카탈라아제 실험결과 양성으로 나타났다. 또한 이산화탄소를 생성하였으며, 당발효에 있어서, 수크로오즈, 프록토오즈, 글루코오즈 등에 대하여 발효능이 확인되었다.
상기 균주가 생산하는 감마아미노부틸산(GABA)은 상기 균주자체와 혼합하여 또는 단독으로 식품제조분야, 사료제조업 등의 첨가물로서 유용하게 활용될 수 있다. 또한, 체내 GABA 농도의 극심한 부족을 겪고 있는 사람으로서 발작, 경련, 간질 증세를 가지고 있는 사람들에게는 이들 증세의 완화 내지는 치료를 위한 약제학적 조성물로도 제공될 수 있다.
상기 본 발명에 따른 균주의 배양시 배양배지로는 MRS 브로스(Difco)가 사용될 수 있으며, 바람직하게는 36∼38℃, 보다 바람직하게는 35∼37℃에서 배양할 수 있다.
상기 얻어진 배양물은 바람직하게는 액체배양을 하여 세포를 회수한 후 동결건조하여 g당 함량을 측정한 다음 동결건조 파우더의 형태로서 다양한 식품조성물에 첨가되어질 수 있다. 식품첨가제로 사용하는 경우 상기 유산균주는 특별히 한정되지는 아니하나, 식품조성물내에서 7×108개/g 이상으로 되는 양으로 하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 얻어진 배양물을 사료첨가제로 하는 경우에는 이를 가축에 직접 음용시켜도 좋고, 배양물을 원심분리시켜 상등액은 가축에 직접 음용시키거나 또는 사료에 혼합하여 섭취시키며, 원심분리하여 회수한 균체는 사료에 혼합하여 섭취시켜도 무방하다. 또한, 상기 배양물을 적당한 부형제와 혼합하여 분말건조 또는 동결건조 등의 방법을 통해 고형화(또는 분말화)하여 이를 사료에 첨가하여 주어도 좋다. 상기 부형제의 예를 들면, 옥수수분말, 대두분말, 대두박 등을 들 수 있다. 사료첨가제로 사용하는 경우 상기 유산균주는 특별히 한정되지는 아니하나, 사료조성물내에서 최소 3×108개/g 이상으로 되는 양으로 하는 것이 바람직하다.
이하 본 발명의 내용을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명하기로 한다. 다만 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 한정되어지는 것으로 해석되어져서는 아니된다.
<실시예 1> 유산균주의 분리 및 균학적 특성
시중에 판매되고 있는 김치를 구입하여 김치국물을 멸균수로 희석하였다. 상기 희석액을 GABA 고생산 유산균의 분리 및 계수를 위해 1％ 펩톤수를 사용하여 10-1∼10-8 농도로 희석하고, 그 희석액 1㎖를 취하여 평판계수용 아가(PCA)로 평판 배양 37℃에서 48시간 배양하여 나타난 콜로니를 총균수로 하였다. GABA 고생산 총균수의 측정과 동일한 방법으로 MRS 브로스에 0.002％ 브롬페놀블루를 첨가한 배지에 25℃에서 72시간 상기 김치희석액을 배양하여 나타난 콜로니를 관찰하고, 환이 없 고 짙은 청색을 띄는 것을 류코노스톡(Leuconostoc)으로 계수하였고 환이 있거나 청색 또는 흰색을 띄는 콜로니를 락토바실러스로 구분하여 계수하였다. m-엔테로코커스 아가(Difco)를 사용하여 백색의 콜로니는 페지오코커스로, 적색은 스트렙토코커스로, 핑크색은 에어로코커스로 계수하였다. 이상의 작업은 3회반복하여 평균치를 구하였다. 효모는 효모-몰트 추출아가(YM)를 사용하여 락토바실러스와 동일한 방법으로 계수하였다.
상기 선별된 균주들은 1차적으로 TLC를 이용하여 균주의 GABA 생산성 유무를 측정하였다. TLC 조건은 용매=부탄올:아세트산:물=4:1:1로 하여 용매를 준비하였으며, 닌히드린 염색법을 이용하여 염색하여 확인하였다. 표준시약은 시그마 표준품을 사용하였으며, TLC의 전개시간은 대략 30분 정도로 하였다. TLC를 이용한 1차 선별실험결과의 콜로니에서 GABA를 생성하는 것으로 확인된 샘플은 2차 선별용 샘플로서 준비하였다.
상기 과정을 통해 1차 선별된 균주를 다시 MSG를 1％, 3％, 5％ 처리하여 아미노산 자동분석기를 이용하여 GABA 함량을 측정하였다. GABA의 형광유도체화를 위해 AccQ Fluor 시약을 사용하였으며, 이들 유도체의 분리를 위해 AccQ Tag 칼럼을 사용하였다. GABA 분석에 있어서의 최종시료는 아미노산 자동분석에 필요한 시료의 순도를 감안하여 0.45㎛ PVDF 필터(Millipore)를 이용하여 여과한 후 분석에 사용하였다.
샘플 중의 GABA 함량을 측정하기 위해 -70℃로 보관된 샘플로부터 유기용매 혼합액(메탄올:클로로포름:증류수=12:5:3)을 가하여 섞어준 다음 GABA을 포함하는 수용액 층은 4℃하에서, 12000rpm에서 15분 동안 원심분리하여 얻었다. 원심분리하여 얻은 액을 재차 원심분리하여 혹시 존재할지 모르는 불순물을 제거하였다. 상기 얻어진 상등액을 동결건조하여 소량의 물로 녹여준 후 0.45㎛ PVDF 필터로 여과하여 분석에 사용하였다. GABA의 형광 유도체화를 위하여 AccQ Tag 시약을 사용하였으며, 이들 유도체의 분리를 위해 3.9mm ×150mm AccQ Tag TM(Nova-PakTM C18,Waters) 칼럼(column)을 사용하였다. 칼럼으로부터 유도체를 용출시키기 위해 AccQ Tag Eluent A와 60％ 아세토니트릴(acetonitrile)을 98:2의 비율로 1㎖/min 유속으로 흘려주었다. GABA 함량은 표준 아미노산의 결과와 비교하여 산출하였으며 그 결과 가장 많은 GABA를 생산하는 균주를 본 발명에 따른 균주로서 최종선발하였다.
선별된 균주를 200㎖의 MRS 브로스에 0.5g 접종하여 30℃에서 16∼20시간 진탕 배양 증식시켰다. 완전히 증식된 MRS 브로스 10㎖를 멸균 튜브에 넣고 8000×g, 8분간 원심분리하여 균체를 얻었다. 균체에 MRS 브로스 : 글리세롤을 5:1의 비율로 구성한 냉동배지(freezing media) 5㎖를 넣고 보텍스 혼합기로 잘 섞어 준 후 크리오관에 넣어 즉시 -40℃로 냉동하였다(3분). 냉동된 균주는 이 후 유산균 접종을 위한 스타터로 사용되었다.
<실시예 2> 유산균주의 동정
GABA 고생산성 균주의 동정을 위하여 형태학적, 생화학적 특성을 "Bergey's Manual of Determinative bacteriology"에 따라 조사하였다. 최적 생육온도, 그람염색, 운동성, 카탈라아제 테스트, CO2 생성 유무 및 당을 발효하여 여러 가지 유기산들을 생성하는 것은 API 50-CHL 키트(BioMerieux, France)를 사용하여 조사하였다. (표 1, 표 2)
<표 1>
| 선발균주 | |
| 세포의 그람염색 | 그람양성균주 |
| 형태 | 간균 |
| 포자생성 | - |
| 포도당 배지에서의 가스생성능 | CO2 생성 |
| 카탈라아제 생성능 | + |
| 15℃에서 생장능력 | + |
| 45℃에서 생장능력 | - |
| 미생물 크기(㎛) | 1.0-1.5㎛ |
<표 2>
| 탄수화물 | 선발균주 | |
| 1 | 말토오즈 | + |
| 2 | D-(+)-글루코오즈 | + |
| 3 | 람노오즈 | - |
| 4 | 덱스트로오즈 | + |
| 5 | D-락토오즈 | + |
| 6 | D-(+)-트레할로오즈 | + |
| 7 | D-(+)-만노오즈 | + |
| 8 | 수크로오즈 | + |
| 9 | D-솔비톨 | - |
| 10 | 이뉼린 | - |
| 11 | D-만니톨 | + |
| 12 | D-(+)-자일로오즈 | - |
| 13 | D-(-)-아라비노오즈 | - |
| 14 | D-(+)-셀로비오즈 | + |
| 15 | 메틸α-D-글루코피라노사이드 | ± |
| 16 | L-아르기닌 | - |
| 17 | D-(+)-라피노오즈 | + |
최종적인 동정을 위하여 분리균의 16s DNA 서열을 결정하여 알려진 균주들과 비교하였다. PCR용 프라이머들은 Bionex에서 제작한 것으로 16s F : 5'-GGCATGCCTAATACATGCAAGT-3', 16s R : 5'-TTCTCCTACGGCTACCTTGTTAC-3'을 사용하였 다.
균주 동정을 위한 16s rDNA 염기서열은 다음 과정을 통해 조사되었다. 배지는 MRS 브로스(Difco)를 사용하였고 락토바실러스와 Weissella속 균주는 37℃, 류코노스톡속 균주와 김치 젖산균 WL6는 30℃에서 배양하였으며, PCR용 염색체 DNA는 Puregene(Gentra System, Inc.) 키트를 사용하여 추출하였다.
PCR 기기는 Biometra제(tampa,Florida USA)를 사용하였고, Taq DNA 중합효소는 Promega(Madison, Wisconsin, USA)제를 사용하였고, 기타 시약은 특급의 제품을 구매하여 사용하였다.
PCR 방법은 Biometra제(tampa, Florida USA)를 사용하였고, 락토바실러스 브레비스 OPK-3 16S rDNA 세트(16s F, 16s R)는 변성 단계를 95℃에서 5분 실시하였고, 증폭 단계를 35 사이클(95℃ 30초, 50℃ 30초, 72℃ 1분 30초)로 하였으며, 연장 단계를 72℃에서 10분으로 하였다. 증폭된 DNA는 1％(w/v) 아가로오즈 젤에 전개하였으며, 분자량 DNA 마커는 λDNA를 EcoRⅠ(Promega)으로 절단한 것을 사용하였다.
본 발명 유산균의 16s rDNA 염기서열을 조사한 결과는 서열번호 1과 같이 약 1,500bp의 염기서열을 조사하였으며 분자계통학적 염기서열 검색을 사용한 미생물 동정 결과 락토바실러스 브레비스(LOCUS D37785 Lactobacillus brevis)와 99％ (562bp/564bp) 상동성을 보여 락토바실러스 브레비스로 동정되어 이를 락토바실러스 브레비스 OPK-3 균주로 명명하였다. 상기 본 발명에 따른 유산균주는 한국미생물보존센터에 2004.5.27일자로 KFCC 11330으로서 기탁되어졌다.
<실험예> 락토바실러스 브레비스 오피케이-3을 이용한 GABA 생산능 측정
GABA 함량측정 및 분석방법은 HPLC를 이용한 GABA분석에 준하여 실험을 실행하였으며, MSG 5％ 처리하였을 때 본 발명에 따른 균주와 공지의 균주를 비교실험한 결과는 하기 표 3과 같았다.
| 균주 | GABA함량(nmol/㎖) |
| Lactobacillus OPK-3 | 2503.08 |
| Lactobacillus plantarum kctc3103 | 30.09 |
| Lactobacillus brevis kctc 41028 | 2.09 |
| Lactobacillus brevis kctc 41029 | 5.15 |
상기와 같이 본 발명에 따른 유산균주는 공시균주에 비하여 최대 400배 이상의 GABA 생산량을 보이므로 식품, 사료 및 의학적인 용도로서 매우 유용하게 활용될 수 있음을 알 수 있다. 의학적인 용도로서 제공되는 경우에는 이를 산제, 정제, 환제 등 제형에 구애받음이 없이 다양한 형태로 제공될 수 있다.
<제조예 1> 락토바실러스 브레비스 오피케이-3을 이용한 요구르트 분말 식품의 제조
정제수 67중량부에 분리대두단백 10중량부, 탈지분유 9중량부, 유청단백 1중량부, 포도당 2중량부, 자당 2중량부, 베타사이클로덱스트린 1중량부를 혼합, 균질화하고 90℃ 온도에서 10분간 열처리한 후 냉각시킨 시료에 락토바실러스 브레비스 OPK-3 원말 (300억개/g 이상) 8중량％를 혼합하여 40℃, 8시간 동안 항온 정치배양하고 생성된 발효커드를 균질화한 다음 과채발효엑기스 30중량부, 요구르트향 0.07 중량부, 물 69.93 중량부를 혼합하여 멸균, 냉각한 당액과 1:2의 비율로 혼합, 균질화하였다. 이 액상의 발효혼합물을 150℃에서 분사건조기(Spray dryer)로 분말화하여 분말요구르트를 제조하였다.
<제조예 2> 락토바실러스 브레비스 오피케이-3을 이용한 사료조성물의 제조
시중에서 음식물찌꺼기를 수거하여 이물질을 제거한 다음, 수산화나트륨을 사용하여 pH 6으로 중화하고, 옥침수와 당밀을 각각 20중량부, 10중량부의 농도로 혼합 첨가한 후, 50g 측량하여 121℃에서 15분간 멸균하였다. 이 멸균된 음식물찌꺼기에 본 발명에 따른 락토바실러스 브레비스 OPK-3을 음식물 찌꺼기 1g당 1×107개 정도 접종한 후, 37℃에서 20시간 동안 발효 및 숙성시켜 발효사료를 만들었다.
본 발명에 의한 유산균주는 감마아미노부틸산(GABA) 고생산성 균주로서, 스트레스에 시달리는 현대인이나 수험생, 알코올 과다 섭취자 등 GABA 농도가 낮은 사람에게 매우 유용한 식품첨가물 또는 의학적 용도로서 제공될 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (4)
- 감마아미노부틸산(GABA) 고생산성 균주인 락토바실러스 브레비스 오피케이-3(KFCC-11330)
- 락토바실러스 브레비스 오피케이-3(KFCC-11330) 균을 배양하여 배양물로부터 감마아미노부틸산(GABA)을 제조하는 방법
- 감마아미노부틸산(GABA) 고생산성 균주인 락토바실러스 브레비스 오피케이-3(KFCC-11330)를 함유하는 식품조성물
- 감마아미노부틸산(GABA) 고생산성 균주인 락토바실러스 브레비스 오피케이-3(KFCC-11330)를 함유하는 사료조성물
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