KR101305800B1 - 글루타메이트 디카르복실라아제 활성을 갖는 신규 락토바실러스 균주 및 이를 이용한 아미노부틸산 제조방법 - Google Patents

글루타메이트 디카르복실라아제 활성을 갖는 신규 락토바실러스 균주 및 이를 이용한 아미노부틸산 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 글루타메이트 디카르복실라아제 활성을 갖는 신규한 미생물 락토바실러스 BFC90 (KCTC 11584BP)와 락토바실러스 BFC110(KCTC 11601BP ) 균주를 이용하여 아미노부틸산을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 락토바실러스 균주를 사용하면 고농도의 아미노부틸산을 생산할 수 있다.
아미노부틸산, 글루타메이트 디카르복실라아제, 락토바실러스

Description

글루타메이트 디카르복실라아제 활성을 갖는 신규 락토바실러스 균주 및 이를 이용한 아미노부틸산 제조방법 {Method for Amino Butyric Acid Production Using Lactobacillus sp. BFC 90 and BFC 110 Containing Glutamate Decarboxylase}
본 발명은 글루타메이트 디카르복실라아제 활성을 갖는 락토바실러스 BFC90 (KCTC 11584BP)와 락토바실러스 BFC110(KCTC 11601BP) 균주 및 이를 이용하여 아미노부틸산을 제조하는 방법에 관한 것이다.
아미노부틸산(amino butyric acid, amino butyrate, 4-amino butyric acid, gamma-amino butyric acid, 2-amino butyric acid)은 아민기와 카르복시기가 있는 탄소수 4개의 아미노산의 일종이며 아민기의 위치에 따라 2, 3, 4-아미노부틸산으로 불린다. 특히 4-아미노부틸산은 억제성 신경전달 물질로써 혈압상승을 억제하고 시력증진에 효과가 있으며 불안감, 초조감 등을 진정시키는 작용을 하는 것으로 알려진 물질이다. 동물의 경우 뇌, 심장, 폐, 신장 등에 분포되어 있으며, 식물의 경우 발아 현미, 녹차 등에서 주로 발견되고 있다. 4-아미노부틸산은 글루탐산(염)(glutamic acid, glutamate, monosodium glutamate, disodium glutamate)을 전 구체로 하여 생성되는데 이에 관여하는 효소가 글루타메이트 디카르복실라아제(glutamate decarboxylase)로 알려져 있다. 이 효소는 미생물과 동물세포에 이르기까지 널리 발견되고 있으며 아포효소(apoenzyme)상태로 존재하다 아미노부틸산 합성이 필요할 때 피리독살-5-포스페이트(pyridoxal-5-phosphate)에 의해 활성화되는 것으로 알려져 있다. 아미노부틸산을 화학소재의 전구체나 바이오폴리머의 원료로 사용할 수 있는 방안들이 보고되고 있다.
본 발명의 목적은 전통 식품에서 유래한 글루타메이트 디카르복실라아제 활성을 가지는 락토바실러스 BFC90 (KCTC 11584BP)과 BFC110(KCTC 11601BP) 균주를 제공하는데 있다. 이에, 본 발명자들은 글루탐산 또는 글루탐산염을 전구체로 사용하여 아미노부틸산을 제조하는 발효법 및 효소법을 제시함으로써 효율적으로 아미노부틸산 생산이 가능함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 글루타메이트 디카르복실라아제 활성을 갖는 신규한 락토바실러스 BFC90 (KCTC 11584BP) 또는 락토바실러스 BFC110 (KCTC 11601BP) 균주를 제공한다.
본 발명은 락토바실러스 BFC90 (KCTC 11584BP) 또는 락토바실러스 BFC110 (KCTC 11601BP) 균주의 배양액 내에 글루탐산 및 글루탐산염으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 기질을 첨가하는 단계를 포함하는 아미노부틸산의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 락토바실러스 BFC90 (KCTC 11584BP) 또는 락토바실러스 BFC110 (KCTC 11601BP) 균주를 배양하는 단계; 및 상기 배양된 균주를 회수하여 글루탐산 및 글루탐산염으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 기질과 접촉시키는 단계를 포함하는 아미노부틸산의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따라 국내 전통 식품에서 분리한 락토바실러스 BFC90 (KCTC 11584BP) 또는 락토바실러스 BFC110 (KCTC 11601BP) 균주는 글루탐산과 글루탐산염을 전구체로 사용하여 발효법이나 효소법을 통하여 고농도의 아미노부틸산을 제조할 수 있다. 이렇게 생산된 아미노부틸산은 식품 첨가물 또는 화학소재의 원료로 사용될 수 있다.
본 발명은 글루타메이트 디카르복실라아제 활성을 갖는 신규한 락토바실러스 BFC90 (KCTC 11584BP) 또는 락토바실러스 BFC110 (KCTC 11601BP) 균주를 제공한다.
본 발명에 따른 락토바실러스 BFC90 (KCTC 11584BP) 또는 락토바실러스 BFC110 (KCTC 11601BP) 균주는 전통식품 중에서도 김치에서 분리된 미생물로써 락토바실러스 속 균주 배양에 널리 쓰이고 있는 MRS배지에서 성장하며, pH 6.0, 37℃, 정체 배양 또는 호기 배양에서 빠른 성장을 보인다. 두 미생물은 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁번호 KCTC 11584BP(2009.11.4)과 KCTC11601BP(2009.11.20)으로 기탁되어 있다.
본 발명에 따른 락토바실러스 BFC90 (KCTC 11584BP) 또는 락토바실러스 BFC110 (KCTC 11601BP) 은 글루탐산과 글루탐산염을 기질로 하여 아미노부틸산을 제조할 수 있는데 이에 관여하는 효소가 글루타메이트 디카르복실라아제다. 글루타메이트 디카르복실라아제는 균주의 세포내에 존재하여 세포내로 글루탐산이 존재할 때 필요에 따라 아미노부틸산으로 전환하는 역할을 하게 되며 이 효소의 활성에 따라 아미노부틸산 생산속도가 결정된다.
또한 본 발명은 락토바실러스 BFC90 (KCTC 11584BP) 또는 락토바실러스 BFC110 (KCTC 11601BP) 균주의 배양액 내에 글루탐산 및 글루탐산염으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 기질을 첨가하는 단계를 포함하는 아미노부틸산의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 한 구체예에 따르면, 맥아당, 포도당, 과당, 갈락토오서, 유당, 설탕, 아라비노오스 또는 글리세롤로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 탄소원을 추가로 첨가할 수 있다. 상기 탄소원은 바람직하게는 맥아당 또는 포도당일 수 있다.
본 발명에 따른 기질은 글루탐산 및 글루탐산염으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있는데 글루탐산은 용해도가 10 g/L로 매우 적으나 적정 pH를 조절하기 위해 사용할 수 있으며, 글루탐산염은 600 g/L의 고농도로 용해가 가능하며 나트륨이 하나로 평형화된 글루탐산 1나트륨(monosodium glutamate, MSG)과 2개로 평형화된 글루탐산 2나트륨(disodium glutamate)이 사용될 수 있다. 본 발명에서는 10~50 g/L의 기질을 사용시에는 글루탐산 1 나트륨과 글루탐산을 9:1의 비율로 기질을 제조하였고 100 g/L의 기질을 사용시에는 글루탐산 1 나트륨만을 사용하였다.
본 발명에 따른 아미노부틸산 제조 방법은 발효법과 효소법으로 나뉠 수 있다. 발효법은 상기 기술한 바와 같이, 락토바실러스 균주를 배양하는 중에 배양액 내에 기질을 첨가하여 아미노부틸산 전환을 유도하는 방법으로서, 미생물 균주의 배양 및 효소반응의 유도가 필요하다. 미생물 배양을 위해 탄소원 및 질소원의 최 적화가 필요하며 세포 성장 중에 기질을 첨가함으로써 효소반응을 유도가 매우 중요하다고 볼 수 있다. 본 발명에서는 12~20시간 사이에 기질을 첨가하였으며 세포농도를 증가시키기 위하여 탄소원으로 맥아당과 포도당을 사용하였다.
효소법은 락토바실러스 균주만을 회수한 후 효소반응을 통해 아미노부틸산을 생산하는 방법이다. 효소법은 배양과 효소반응의 2단계로 이루어지며 조효소인 피리독살-5-포스페이트의 첨가반응에 의해 반응속도가 증가하기 때문에 적절한 농도의 조효소가 필요로 하지만 발효법은 조효소 없이 전구체의 첨가만으로도 아미노부틸산을 제조할 수 있는 장점을 가진다. 그러나, 아미노부틸산을 고순도로 회수할 시에는 효소법이 장점을 지닌다.
따라서 본 발명은 락토바실러스 BFC90 (KCTC 11584BP) 또는 락토바실러스 BFC110 (KCTC 11601BP) 균주를 배양하는 단계; 및 상기 배양된 균주를 회수하여 글루탐산 및 글루탐산염으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 기질과 접촉시키는 단계를 포함하는 아미노부틸산의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 한 구체예에 따르면, 상기 회수한 균주를 기질과 접촉시키기 전에 회수한 균주에 EDTA, 계면활성제, 우레아, 구아니딘 또는 라이소자임을 처리하거나 초음파, 균질기 또는 동결-녹임을 반복한 파쇄법을 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이는 세포벽의 투과성을 높임으로써 기질과의 반응을 보다 빨리하기 위함이다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 회수한 균주에 조효소를 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이 때, 상기 조효소는 이에 한정되는 것은 아니지만 피 리독살-5-포스페이트일 수 있다.
본 발명에 따른 효소법의 반응 온도는 세포배양과 비슷한 온도인 30~40℃에서 최적이었으며 pH는 3.0~5.0의 비교적 낮은 범위에서 효과적이었다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 아미노부틸산 생산을 위한 균주의 스크리닝
제조된 아미노부틸산을 식용이 가능하면서도 화학소재로 사용하기 위하여 균주를 전통식품에서 분리하고자 하였다. 스크리닝에 사용된 전통식품은 1) 지역별 가정용/시판용 김치, 젓갈, 장류 등의 식품에서 350여종, 2) 한국생명공학연구원에서 분양받은 40여종, 3) 식물에서 분리한 300여종의 균주 등 총 690여종의 균주를 대상으로 선별작업을 수행하였다. 선별방법은 5% 글루탐산염을 첨가한 MRS평판배지에서 성장이 우수한 균주를 분리한 후, 10% 글루탐산염에서 아미노부틸산을 고농도로 생산하는 능력을 가진 균주를 분리하였다. 모든 균주는 락토바실러스에 최적화된 37℃, MRS배지에서 48시간 동안 배양하였다. 최종적으로 액상배양 후 아미노부틸산 생산성이 높은 락토바실러스 BFC90 (KCTC 11584BP)과 락토바실러스 BFC110 (KCTC 11601BP)을 선별할 수 있었다.
최종 선별 균주
최종 스크리닝 균주 (4종)
BFC-90 가정용김치 BFC-109 상업용김치 BFC-110 상업용김치 BFC-274 가정용김치
실시예 2: 선별된 균주의 아미노부틸산 전환 확인
각종 탄소원의 종류에 따른 균체 증식과 아미노부틸산 생산성에 미치는 영향을 검토하기 위하여 탄소원을 제외한 MRS배지를 기본배지로 사용하여 각각의 다른 탄소원을 첨가한 후 37℃에서 24-48시간 플라스크 배양하여 아미노부틸산 생산성, 균체 증식 및 pH 변화를 관찰하였다. MRS배지에서 BFC-90과 BFC-110 균주 모두에서 높은 아미노부틸산 생산성을 보였으며 갈락토오스와 맥아당 등이 적합한 탄소원임을 알 수 있었다.
다양한 탄소원에서 아미노부틸산 생산
　 BFC-90 (24시간) BFC-110 (48시간)
탄소원 세포농도
(OD660)		 pH 아미노부틸산
(g/L)		 세포농도
(660nm)		 pH 아미노부틸산
(g/L)
포도당 0.326 5.43 2.431 0.548 6.41 3.828
맥아당 0.667 4.75 4.185 1.281 5.23 6.069
과당 0.616 5.16 0.606 0.758 4.72 -
갈락토오스 0.188 5.69 4.533 0.321 6.21 5.513
유당 0.304 6.30 3.438 0.717 7.29 4.466
설탕 0.194 6.42 2.782 0.366 7.42 2.923
아라비노오스 0.323 5.20 2.429 0.384 5.81 -
글리세롤 0.072 6.48 0.609 0.169 6.97 -
MRS 0.065 5.49 5.543 0.982 6.91 5.654
실시예 3: 발효법을 이용한 아미노부틸산 제조
선별 균주를 16~ 24시간 배양한 후 전구체인 글루탐산염 30 g/L를 첨가하여 글루타메이트 디카르복실라아제의 발현을 유도한 후 지속적인 아미노부틸산 전환을 유도하기 위하여 탄소원인 포도당과 전구체인 글루탐산과 글루탐산염을 간헐적으로 첨가하여 아미노부틸산 농도를 높이기 위한 유가식 배양방법을 아미노부틸산 제조법으로 사용하였다. 선별 균주의 초기 배양 및 전환반응을 위해 20 g/L의 맥아당 및 갈락토오스를 기질로 사용하여 아미노부틸산을 효과적으로 생산할 수 있으며, 배양 12시간에 전구체인 글루탐산(염)을 30 g/L의 농도로 첨가하였고 24시간이 지난 후부터 12시간마다 포도당 10 g/L를 첨가하여 효소활성을 유지하도록 하였다(도 1). 전구체인 글루탐산과 글루탐산염이 완전히 소모된 48시간에 다시 글루탐산과 글루탐산염을 20 g/L 첨가하여 아미노부틸산 생산을 유도하였다. 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이 전구체인 글루탐산과 글루탐산염은 첨가후 8시간이 지난 20시간이후부터 아미노부틸산으로 전환되는 것을 알 수 있으며 28시간 후인 40시간에는 잔류 글루탐산이 관찰되지 않았으며 대부분 아미노부틸산으로 전환된 것을 알 수 있다.
실시예 4: 효소법을 이용한 아미노부틸산 제조
아미노부틸산을 100 g/L 이상의 고농도로 생산하기 위하여 균체내 효소를 이용한 생물전환반응을 수행하였다. 선별 균체를 24시간 배양후 세포를 원심분리하여 상등액은 버리고 균체만을 회수하였다. 기질과의 반응을 보다 빨리하기 위하여 세포벽 투과성을 높일 수 있도록 EDTA첨가법, 계면활성제 첨가법, 우레아 또는 구아니딘 첨가법, 라이소자임 처리법, 초음파, 균질기 또는 동결-녹임을 반복한 파쇄법의 사용이 가능하였으며 다만 본 실시예 4에서는 경제성과 시간 면에서 가장 편리한 EDTA첨가법을 사용하였다. 효소 반응은 조효소인 피리독살-5-포스페이트(pyridoxal-5-phosphate)를 필요로 하며 조효소가 없어도 아미노부틸산 제조는 가능하나 조효소 존재시 더 빠른 반응속도를 보였다. 효소반응은 세포농도에 비례하여 아미노부틸산 생산속도가 증가하였으며, 기질에 대한 반응 저해성은 없는 것으로 나타났다. 최적 pH는 3.0~6.0 사이였고 온도는 20~50℃에서 모두 활성을 나타냈다. 도 3에서는 효소전환법을 이용한 아미노부틸산 생산의 한 예를 보였다. 본 실험에 사용된 효소는 회수된 세포를 140 OD로 현탁하여 준비한 후 40 mM EDTA로 세포투과성을 높여서 준비되었다. 초기 기질인 글루탐산과 글루탐산염 200 g/L와 조효소인 20 μM 피리독살-5-포스페이트를 첨가한 후 pH 4.0, 30℃에서 68시간 반응하였으며 최종적으로 90%이상의 수율과 100 g/L의 아미노부틸산을 생산할 수 있었다.
도 1은 본 발명에 따라 락토바실러스 BFC90 균주를 배양하면서 전구체 및 탄소원을 첨가하면서 아미노부틸산을 생산하는 방법에 관한 것으로 배양시간에 따른 세포성장과 탄소원의 농도변화를 나타낸 그림이다.
도 2는 아미노부틸산의 농도를 얇은 막 크로마토그리피(thin layer chromatography)를 이용하여 분석한 것이다.
도 3은 본 발명에 따라 락토바실러스 BFC90균주를 회수한 후 효소전환반응에 의해 아미노부틸산을 생산하는 방법에 관한 것으로 반응시간에 따른 아미노부틸산의 생성 농도를 나타낸 그림이다.

Claims (5)

  1. 글루타메이트 디카르복실라아제 활성을 갖는 락토바실러스 BFC90 (KCTC 11584BP) 또는 락토바실러스 BFC110 (KCTC 11601BP) 균주.
  2. 락토바실러스 BFC90 (KCTC 11584BP) 또는 락토바실러스 BFC110 (KCTC 11601BP) 균주의 배양액 내에 글루탐산 및 글루탐산염으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 기질을 첨가하는 단계를 포함하는 아미노부틸산의 제조방법.
  3. 락토바실러스 BFC90 (KCTC 11584BP) 또는 락토바실러스 BFC110 (KCTC 11601BP) 균주를 배양하는 단계;
    상기 배양된 균주를 회수하여 글루탐산 및 글루탐산염으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 기질과 접촉시키는 단계를 포함하는 아미노부틸산의 제조방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 회수한 균주를 기질과 접촉시키기 전에 회수한 균주에 EDTA, 계면활성제, 우레아, 구아니딘 또는 라이소자임을 처리하거나 초음파, 균질기 또는 동결-녹임을 반복한 파쇄법을 수행하는 단계를 추가로 포함하는 아미노부틸산의 제조방법.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 회수한 균주에 조효소를 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 아미노부틸산의 제조방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20040069437A (ko) * 2003-01-29 2004-08-06 변유량 신규한 락토바실러스 속 균주 및 이를 이용한감마-아미노부티르산의 제조방법
KR20040094489A (ko) * 2003-05-02 2004-11-10 주식회사 바름인 유산균에 의해 감마-아미노부틸산이 강화된 발효물의생산방법과 이를 이용하여 생산된 감마-아미노부틸산이강화된 발효물 및 그의 이용
KR20060006342A (ko) * 2004-07-15 2006-01-19 전북대학교산학협력단 감마아미노부틸산(ｇａｂａ) 고생산성 균주인락토바실러스 브레비스 오피케이-3
KR20080045320A (ko) * 2006-11-20 2008-05-23 우석대학교 산학협력단 감마-아미노부틸산 함량이 증가된 유산균 발효물과 그의제조방법 및 이를 포함하는 약제학적 제제

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