KR101778656B1

KR101778656B1 - 고농도 감마아미노부티르산 생산능을 가지는 락토바실러스 브레비스 llb5238 균주를 이용하여 맥주 효모 부산물로부터 감마아미노부티르산을 생산하는 방법

Info

Publication number: KR101778656B1
Application number: KR1020150002201A
Authority: KR
Inventors: 윤석민; 양시영; 임정훈; 여명재
Original assignee: 롯데푸드 주식회사
Priority date: 2015-01-07
Filing date: 2015-01-07
Publication date: 2017-09-14
Also published as: KR20160085161A

Abstract

본 발명은 고농도 감마아미노부티르산 생산능을 가지는 락토바실러스 브레비스 LLB5238 균주를 이용하여 맥주 효모 부산물로부터 감마아미노부티르산을 생산하는 방법에 관한 것으로서, 맥주 효모 부산물의 전처리 방법, 균주의 배양 배지 및 배양 조건을 최적화하여 감마아미노부티르산의 생산량을 증가시킬 수 있는 방법을 제공한다.

Description

고농도 감마아미노부티르산 생산능을 가지는 락토바실러스 브레비스 LLB5238 균주를 이용하여 맥주 효모 부산물로부터 감마아미노부티르산을 생산하는 방법{AN OPTIMIZED METHOD OF MANUFACTURING γ-AMINOBUTYRIC ACID FROM BREWER WASTE USING Lactobacillus brevis LLB5238}

감마아미노부틸산(γ-AMINOBUTYRIC ACID, 이하 'GABA')은 억제성 신경전달물질로서, 혈압상승을 억제하고 시력증진에 효과가 있으며 불안감, 초조감 등을 진정시키는 작용을 한다. 체내 GABA 농도의 부족은 발작, 경련, 간질 증세를 일으키므로 체내 GABA 농도를 높이고자 하는 식품 또는 약제개발이 활발히 이루어지고 있는 실정이다.

현재 각종 소재에 자연적으로 GABA의 함량을 증가시키는 연구가 진행되고 있으나, 이러한 방법에 의해 제조된 제품의 GABA 함량은 최고 0.5 vol.%를 넘지 못하므로 충분하지 못하다는 한계가 있다.

이에 유산균을 이용하여 GABA를 고농도로 생산하는 방법들이 개발되고 있는바 공개특허출원 제10-2009-0123070호는 천연적으로 글루탐산을 함유하고 있는 토마토를 주원료로 하는 배지에 미생물을 접종 및 배양하여 GABA 및 유기산의 함량을 증가시키는 방법을 개시하고 있다.

다만 종래의 유산균을 사용하는 방법은 원료의 가격이 높아 GABA를 대량 생산(Scale-up)하기에는 무리가 있었다.

맥주의 생산 후에 얻어지는 맥주 효모 부산물은 국내에서만 연간 12,000톤 이상이 나오는 것으로 추정되고 있고, 효모의 대사과정 중에 발생하는 비타민, 미네랄, 아미노산 등 다양한 대사산물들이 포함되어 있어 높은 영양학적 가치가 있으며, 가격이 저렴하다는 장점이 있다.

따라서 맥주 효모 부산물을 식용에 적합하도록 가공하거나, 새로운 물질을 생산하는데 재활용할 수 있다면 경제성과 친환경성을 모두 만족시킬 수 있으므로 새로운 고부가가치를 창출할 수 있을 것이다.

이에 본 발명자들은 맥주 발효 시 효모의 대사과정에서 글루탐산이 발생하게 되며 이를 GABA 생산을 위한 기질로서 사용 가능하다는 점에 착안하여, 본 발명에 이르게 되었다.

1.공개특허출원 제10-2009-0123070호 2.공개특허출원 제10-2006-0057398호

본 발명은 값싼 맥주 효모 부산물을 기질로 사용하고, 생산조건을 최적화하여 GABA를 고농도로 생산할 수 있는 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

본 발명은 상기 방법으로 생산된 GABA를 포함하는 식품 조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

다만, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명의 일 구현예는 (a) 맥주 효모 부산물을 전처리하는 단계; 및 (b) 상기 맥주 효모 부산물이 포함된 배지에 락토바실러스 브레비스(Lactobacillusbrevis) LLB5238(기탁번호 KCCM11538P)의 종균 배양액을 첨가하고 배양하는 단계를 포함하는 감마아미노부티르산(γ-aminobutyric caid, GABA)의 생산방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 구현예는 상기 감마아미노부티르산을 포함하는 식품 조성물을 제공하는 것이다.

기타 본 발명의 구현예들의 구체적인 사항은 이하의 상세한 설명에 포함되어 있다.

본 발명은 맥주 효모 부산물을 기질로 사용하고 생산조건을 최적화하여 GABA를 고농도로 생산하므로, 경제적·친환경적이고 대량 생산에 적합한 GABA의 생산방법을 제공할 수 있다.

이하, 본 발명의 구현예를 상세히 설명하기로 한다. 다만, 이는 예시로서 제시되는 것이므로 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않으며 본 발명은 후술할 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

본 발명에 따른 GABA의 생산방법은 (a) 맥주 효모 부산물을 전처리하는 단계; 및 (b) 상기 맥주 효모 부산물이 포함된 배지에 락토바실러스 브레비스(Lactobacillusbrevis) LLB5238(기탁번호 KCCM11538P)의 종균 배양액을 첨가하고 배양하는 단계를 포함한다.

이하 각 단계에 대하여 더욱 상세하게 설명하도록 한다.

(1) 맥주 효모 부산물의 전처리

맥주 발효의 주원료인 호프(hop)는 이소휴물론(Isohumulone) 성분이 있어 쓴맛이 매우 강해 식용으로 사용시 거부감이 크고, 이소휴물론이 효모의 세포벽에 흡착되어 있으므로 효모의 세포벽 안에 존재하는 글루탐산의 배출을 어렵게 하기 때문에 이를 제거할 필요가 있다.

따라서 본 발명에서는 맥주 효모 부산물을 체(Seive)로 걸러주는 물리적 제거 방법과, pH를 조절한 세척액에 의한 세척 방법을 적용하여 효과적으로 이소휴물론 성분을 제거하였다.

또한 글루탐산이 효모의 세포벽 밖으로 용이하게 배출될 수 있도록 효모 세포 파쇄를 위해 pH조정, 저온 가열, 효소 처리 등의 방법을 적용하여 최적의 방법을 찾고자 하였다.

실시예 1 : 체( Seive )를 이용한 물리적 방법

호프(hop)로부터 유래하는 고미성분(이소휴물론)이 맥주 발효시에 작은 분자로 분해되지 않기 때문에 체(Seive)를 이용하여 물리적으로 이소휴물론을 제거할 수 있다.

맥주 효모 부산물과 동일량의 멸균 증류수를 첨가하여 전체 부피를 2배수로 제조한 다음, 메쉬 사이즈가 30 내지 150인 체에 통과시키는 과정을 다섯 차례 반복하였다.

상기 맥주 효모 부산물은 롯데주류 충주공장에서 입수하였으며, 맥주 생산을 위해 5회 반복 사용된 뒤 맥주 상등액을 회수하고 남은 부산물을 입수하여 실험을 수행하였다.

이소휴물론의 제거 정도를 측정하기 위하여 체로 거른 뒤의 맥주 효모 부산물의 쓴맛 정도(International Bitterness Units, IBU)를 측정하였다.

실시예 1의 결과는 하기의 표 1과 같다.

체의 사이즈(mesh)	쓴맛 정도(IBU)
무처리	175.1
30	170.4
50	140.6
80	113.3
100	94.2
120	측정불가
150	측정불가

표 1을 참조하면, 체를 이용한 전처리를 하지 않았을 때와 비교하여 체의 메쉬 사이즈가 촘촘해짐에 따라 IBU가 점차 감소하는 것으로 보아 이소휴물론이 제거되거 있음을 확인할 수 있다.

다만 메쉬가 120이 넘어가면 맥주 효모 부산물이 자체의 점성 등에 의해 체를 막아버리기 때문에 전처리 효과를 상실하게 된다.

따라서 체의 메쉬 사이즈는 80 내지 100, 바람직하게는 100 메쉬의 체를 사용하여 맥주 효모 부산물을 전처리하는 것이 가장 효율적일 수 있다. 100 메쉬의 체를 사용하면 IBU 기준, 이소휴물론을 46% 제거할 수 있다(이하의 실험에서는 모두 100 메쉬의 체를 사용하였음).

실시예 2 : pH를 조절한 세척액에 의한 세척 방법

맥주 효모 부산물을 원심분리하여(3000g, 10min) 상등액을 제거한 다음, 가라앉은 고형분에 pH 3 내지 pH 8의 세척수를 투여하고 현탁하는 과정을 5회 반복함으로써 세척하였다.

이소휴물론의 제거 정도를 측정하기 위하여 세척과정을 거친 맥주 효모 부산물의 쓴맛 정도(IBU)를 측정하였다.

실시예2의 결과는 하기의 표 2와 같다.

세척수의 pH	쓴맛 정도(IBU)
무처리	178.5
3	103.3
4	68.4
5	15.4
6	14.3
7	20.9
8	77.3

표 2를 참조하면, 세척 과정을 거치지 않았을 때와 비교하여 pH 5 내지 pH 7의 세척수로 세척하였을 때 쓴맛 정도가 90% 이상 현저하게 감소함을 확인할 수 있다.

맥주 효모 부산물의 초기 pH는 6.6 정도이므로 pH 조정이 필요한 범위가 작고 간단한 pH 6의 세척수를 사용하는 것이 바람직할 수 있다(이하의 실험에서는 모두 pH 6의 세척수를 사용하였음).

상기 실시예1과 실시예2의 전처리 방법을 모두 수행한 뒤 IBU를 측정하였다.

맥주 효모 부산물을 100 메쉬의 체를 사용하여 5회 반복 통과시킨 뒤, 회수한 맥주 효모 부산물을 pH 6으로 조정된 세척수로 3회 반복하여 세척하였다. 그 결과 1.5 IBU의 쓴맛 정도를 나타내었는바, 전처리하지 않은 시료와 비교할 때 99%이상의 이소휴물론이 제거되었음을 알 수 있었다.

따라서 실시예1 및 실시예2의 과정을 거침으로써, 맥주 효모 부산물의 특유의 향취 및 쓴맛을 제거하였으므로 추후 식품으로 제조하였을 때 거부감 없이 섭취할 수 있고, 효모 세포에 흡착되어 있던 이소휴물렌을 제거하였으므로 세포 내의 글루탐산이 용이하게 세포벽 밖으로 배출될 수 있다.

실시예 3 : 효모 세포의 파쇄

전술한 바와 같이 글루탐산은 효모의 세포 내에 존재하므로 상기 글루탐산을 제대로 미생물의 기질로 사용하기 위해서는 세포를 파쇄할 필요성이 있다.

상기 실시예1 및 실시예2의 과정을 거친 맥주 효모 부산물에 동일량의 멸균 증류수를 첨가하여 전체 부피를 2배수로 제조한 시료를 준비한 다음 pH, 저온 가열, 효소 처리를 수행하였다.

pH 처리의 경우 상기 시료를 원심분리하여 상등액을 제거한 뒤, 본래의 상등액과 동일량의 pH 4, pH 10으로 조정된 0.1 몰의 인산나트륨 완충액을 투여 및 현탁하여 37℃에서 2시간 동안 반응하였다.

저온 가열의 경우 상기 시료를 삼각플라스크에 일정량 투여한 뒤 내부 온도가 60, 70, 80℃로 유지되게 하여 2시간 동안 반응하였다.

효소 처리의 경우 상기 시료 100중량부를 기준으로 1중량부, 5중량부의 글루타미네이즈(Glutaminase, Sigma-Aldrich 社)를 투여한 뒤 37℃에서 2시간 동안 반응하였다.

pH, 저온 가열, 효소 처리를 마친 시료의 글루탐산의 농도를 초고성능 액체크로마토그래피(UPLC)를 이용하여 측정하였다. 그 결과는 하기의 표 3과 같다.

실험군	실험방법	글루탐산
실험군	실험방법	농도 [mg/L]	생성량(대조군 대비)
대조군	무처리	50.8	-
pH 처리	pH 4, 2시간 반응	147.0	289.4 %
pH 처리	pH 10, 2시간 반응	387.4	762.6 %
저온 가열	60℃, 2시간 반응	406.8	800.8 %
	70℃, 2시간 반응	477.3	939.6 %
	80℃, 2시간 반응	479.5	943.9 %
효소 처리	글루타미네이즈 1중량부, 37℃, 2시간 반응	396.6	780.7 %
효소 처리	글루타미네이즈 5중량부, 37℃, 2시간 반응	502.6	989.4 %

표 3을 참조하면, 효소 처리 중 글루타미네이즈 5중량부를 첨가한 실험군, 저온 가열 중 70, 80℃의 실험군에서 높은 글루탐산 농도가 측정되었다. 다만 글루타미네이즈가 고가인 점, 저온 가열과 비교하여 큰 차이를 보이지 않는 점에 비추어 세포 파쇄를 위해서 맥주 효모 부산물에 70 내지 80℃의 저온 가열을 하는 것이 바람직할 수 있다(이하의 실험에서는 모두 70℃의 저온 가열을 수행하였음).

본 발명에서는 GABA 생산을 위한 맥주 효모 부산물의 전처리 과정을 최적화함으로써 맥주 효모 부산물의 IBU를 95%이상 감소시키고, 글루탐산의 농도를 900%이상 증가시킬 수 있다.

(2) 맥주 효모 부산물로부터의 GABA 생산

전처리 단계를 거친 맥주 효모 부산물을 포함하는 배지에 GABA 생산능을 가지는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) LLB5238(이하, 'LLB5238')를 배양함으로써 GABA를 생산할 수 있다.

본 발명에서 사용된 LLB5238은 출원번호 제10-2014-0067156호에 개시된 균주이므로 이에 대한 자세한 내용은 생략하기로 한다.

실시예 4 : 맥주 효모 부산물의 함량 최적화

맥주 효모 부산물의 함량에 따른 GABA의 생산성을 확인하기 위해 증류수에 상기 맥주 효모 부산물을 10, 20, 30, 50, 75 vol.%가 되도록 첨가한 뒤, 글루코스 (glucose) 20g/L, 효모추출물 (yeast extract) 5g/L, K₂HPO₄ 2g/L, MgSO₄ 0.1g/L, MnSO₄ 0.05g/L를 첨가한 다음 멸균하여(Autoclave, 121℃, 15분) 배지를 제조하였다.

제조된 배지를 15ml 튜브에 10ml 씩 투여한 뒤, LLB5238의 종균 배양액 0.5 vol.%를 접종하고 37℃에서 48시간 동안 배양한 뒤 글루탐산과 GABA의 농도를 측정하였다. 그 결과는 하기의 표 4와 같다.

맥주 효모 부산물 [vol.%]	글루탐산 [mg/L]		GABA
맥주 효모 부산물 [vol.%]	초기	배양후	생성량 [mg/L]	GABA 생성비¹ ⁾ [%]
10	27.7	N.D	19.0	98.2
20	48.6	N.D	33.2	97.5
30	80.7	N.D	55.6	98.4
50	127.9	N.D	87.0	97.1
75	183.1	N.D	111.9	87.2

1) 첨가되는 맥주 효모 부산물의 함량이 높아질수록 글루탐산의 절대량이 늘어나기 때문에 정확한 분석을 위해 LLB5238 균주에 의해 소모되는 글루탐산의 양에 대비하여 생성되는 GABA 농도(GABA 생성량/글루탐산 소모량)를 산출하였다. 또한 GABA의 생성비는 글루탐산과 GABA의 분자량을 이용하여 몰비로 계산하였다.

표 4를 참조하면, 맥주 효모 부산물을 75 vol.%로 첨가하였을 때를 제외하고는 모두 95%가 넘는 GABA 생성비를 나타내었으므로 맥주 효모 부산물은 10 vol.% 내지 50 vol.%로, GABA의 절대 생산량 및 생산비를 모두 고려하였을 때 바람직하게는 50 vol.% 포함되는 것이 바람직할 수 있다(이하의 실험에서는 모두 50 vol.%의 맥주 효모 부산물을 포함함).

실시예 5 : 탄소원의 종류 및 함량 최적화

탄소원의 종류에 따른 GABA 생산성을 확인하기 위하여 다양한 종류의 탄소원을 첨가하여 LLB5238 균주를 배양하였다.

탄소원은 글루코스 (glucose), 프럭토스 (fructose), 수크로스 (sucrose), 락토스 (lactose), 갈락토스 (galactose), D-소비톨 (D-sorbitol)를 사용하였다.

맥주 효모 부산물 50 vol.%, 상기 탄소원 20g/L, 효모추출물 (yeast extract) 5g/L, K₂HPO₄ 2g/L, MgSO₄ 0.1g/L, MnSO₄ 0.05g/L를 첨가하고 멸균하여 (Autoclave, 121℃, 15분) 배지를 제조하였다.

상기 실시예 4와 동일한 방법으로 LLB5238을 배양한 뒤 글루탐산과 GABA의 농도를 측정하였다. 그 결과는 하기의 표 5와 같다.

탄소원 종류	글루탐산 [mg/L]		GABA
탄소원 종류	초기	배양후	생성량 [mg/L]	GABA 생성비 [%]
글루코스	119.9	0	83.3	99.1
프럭토스	122.3	38.8	44.2	75.4
수크로스	118.3	23.1	57.8	86.7
락토스	117.4	98.7	3.3	25.1
갈락토스	120.7	116.1	1.5	45.1
D-소비톨	121.7	120.8	0.1	11.8

표 5을 참조하면, 글루코스가 글루탐산에 대한 높은 이용성을 가지고, GABA를 고농도로 생성하므로 탄소원으로서 가장 적합함을 알 수 있다.

글루코스(탄소원)의 농도에 따른 GABA 생산성을 확인하기 위하여 글루코스를 5, 10, 25, 50, 100 g/L의 농도로 첨가한 뒤, 상기 실시예들과 동일한 방법으로 실험을 수행하여 글루탐산과 GABA의 농도를 측정하였다. 그 결과는 하기의 표 6과 같다.

글루코스 농도 [g/L]	글루탐산 [mg/L]		GABA
글루코스 농도 [g/L]	초기	배양후	생성량 [mg/L]	GABA 생성비 [%]
5	118.1	91.6	18.3	98.2
10	121.3	53.9	46.1	97.6
25	120.6	0	83.1	98.3
50	119.9	0	79.7	94.8
100	121.6	84.25	25.9	55.1

표 6을 참조하면, 글루탐산의 소비량 및 GABA의 생성량에 비추어 글루코스는 25 g/L 내지 50 g/L을 포함하는 것이 바람직하고, 글루탐산 이용성 및 가격 경쟁력을 고려하면 25 g/L를 포함하는 것이 더욱 바람직할 수 있다(이하의 실험에서는 모두 25 g/L의 글루코스를 탄소원으로 포함함)

글루코스의 농도가 25g/L 미만이면 글루탐산의 이용성이 낮아 경제적이지 ㅁ못하고, 100g/L를 넘어가게 되면 고농도의 글루코스에 의해 오히려 GABA 생성에 저해가 일어나기 때문이다.

실시예 6 : 질 소원의 종류 및 함량 최적화

질소원의 종류에 따른 GABA 생산성을 확인하기 위하여 다양한 종류의 질소원을 첨가하여 LLB5238 균주를 배양하였다.

질소원은 펩톤 (peptone), 효모추출물 (yeast extract), 소이톤 (soytone), 질산나트륨 (sodium nitrate), 황산암모늄 (ammonium sulfate)을 사용하였다.

맥주 효모 부산물 50 vol.%, 글루코스(탄소원) 25g/L, 상기 질소원 10g/L, K₂HPO₄ 2g/L, MgSO₄ 0.1g/L, MnSO₄ 0.05g/L를 첨가하고 멸균하여 (Autoclave, 121℃, 15분) 배지를 제조하였다.

상기 실시예 5와 동일한 방법으로 LLB5238을 배양한 뒤 글루탐산과 GABA의 농도를 측정하였다. 그 결과는 하기의 표 7과 같다.

질소원 종류	글루탐산 [mg/L]		GABA
질소원 종류	초기	배양후	생성량 [mg/L]	GABA 생성비 [%]
펩톤	120.7	0	77.3	91.4
효모추출물	127.2	0	88.5	99.3
소이톤	123.1	0	74.4	86.2
질산나트륨	121.4	108.3	0	2.7
황산암모늄	119.7	116.3	0	1.1

표 7을 참조하면, 펩톤, 효모추출물 및 소이톤을 질소원으로 사용하였을 경우 높은 GABA 생성비를 나타내고, 그 중 가장 높은 글루탐산 이용성 및 GABA 생성비를 나타내는 효모추출물이 질소원으로서 가장 적합함을 알 수 있다.

효모추출물(질소원)의 농도에 따른 GABA 생산성을 확인하기 위하여 효모추출물을 1, 2, 5, 10 g/L의 농도로 첨가한 뒤, 상기 실시예들과 동일한 방법으로 실험을 수행하여 글루탐산과 GABA의 농도를 측정하였다. 그 결과는 하기의 표 8과 같다.

효모추출물 농도 [g/L]	글루탐산 [mg/L]		GABA
효모추출물 농도 [g/L]	초기	배양후	생성량 [mg/L]	GABA 생성비 [%]
1	123.8	0	80.8	93.1
2	126.9	0	85.0	95.6
5	131.6	0	91.0	98.7
10	141.8	0	98.7	99.3

표 8을 참조하면, 효모추출물을 첨가하면 90%이상의 GABA 생성비를 얻을 수 있다는 것을 확인할 수 있다. 질소원은 탄소원과 달리 미생물의 생장 시 단백질 합성에 관여하기 때문에 표 8과 같은 결과가 도출된 것이라 판단된다. 상기 효모추출물을 10 g/L로 증가시켰을 때 GABA 생성량이 크게 증가하지 않았다는 점에 비추어 상기 효모추출물은 5 g/L 내지 10 g/L를 포함하는 것이 바람직할 수 있다(이하의 실험에서는 모두 5 g/L의 효모추출물을 질소원으로 포함함).

상기 실시예 4 내지 실시예 6을 참조하면, LLB5238 균주를 이용하여 맥주 효모 부산물로부터 GABA를 생산하기 위한 최적의 배지는 맥주 효모 부산물 500 vol.%, 글루코스 25 g/L, 효모추출물 5 g/L를 포함할 수 있다.

실시예 7 : GABA 생산을 위한 최적의 배양 조건 - 배양 온도

LLB5238 균주를 이용하여 상기 실시예들에 의해 확립된 맥주 효모 부산물을 포함하는 최적 배지로부터 GABA를 가장 높은 농도로 생산하기 위한 최적의 배양 조건을 확립하고자, 배양 온도, 배양 초기 pH, 배양 시간에 의한 GABA의 생산성을 확인하였다.

배양 온도에 따른 GABA 생산성을 확인하기 위하여 배양 온도를 25, 30, 37, 42, 50℃로 다르게 하여 상기 실시예들과 동일한 방법으로 LLB5238 균주를 배양한 뒤, 글루탐산과 GABA의 농도를 측정하였다. 그 결과는 하기의 표 9와 같다.

배양 온도 [℃]	생균수 [CFU/ml]	글루탐산 [mg/L]		GABA [mg/L]
배양 온도 [℃]	생균수 [CFU/ml]	초기	배양후	GABA [mg/L]
25	2.7 ×10⁹	123.4	58.7	39.1
30	3.6 ×10⁹	118.3	0	81.9
37	3.4 ×10⁹	122.6	0	85.3
42	2.2 ×10⁹	121.4	19.1	66.3
50	6.8 ×10⁸	119.3	116.9	0.6

표 9를 참조하면, 배양 온도가 25 내지 42℃일 때 생균수는 비슷한 정도를 보이지만, GABA 생산량을 고려하면 배양 온도를 30 내지 37℃, 바람직하게는 37℃로 하였을 때 고농도의 GABA를 생산할 수 있음을 확인할 수 있다(이하의 실험에서는 모두 37℃의 배양 온도로 배양하였음).

실시예 8 : GABA 생산을 위한 최적의 배양 조건 - 배양 초기 pH

배양 초기 pH에 따른 GABA 생산성을 확인하기 위하여 배양 초기 pH를 4, 5, 6, 7, 8로 다르게 하여 상기 실시예들과 동일한 방법으로 LLB5238 균주를 배양한 뒤, 글루탐산과 GABA의 농도를 측정하였다. 그 결과는 하기의 표 10과 같다.

배양 초기 pH	생균수 [CFU/ml]	글루탐산 [mg/L]		GABA [mg/L]
배양 초기 pH	생균수 [CFU/ml]	초기	배양후	GABA [mg/L]
4	6.1 ×10⁷	210.8	204.3	0.7
5	5.8 ×10⁸	233.2	86.5	66.0
6	3.5 ×10⁹	231.6	0	158.1
7	3.3 ×10⁹	225.7	0	156.2
8	1.9 ×10⁸	216.6	143.2	11.6

표 10을 참조하면, 배양 초기 pH가 6 내지 7℃일 때 생균수가 10⁹이상이었고 150 mg/L 이상의 GABA를 생산할 수 있었으므로, 배양 초기 pH는 상기 범위 내로 하는 것이 바람직함을 알 수 있다(이하의 실험에서는 모두 pH 6의 배양 초기 pH로 배양하였음).

실시예 9 : GABA 생산을 위한 최적의 배양 조건 - 배양 시간

배양 시간에 따른 GABA 생산성을 확인하기 위하여, 상기 실시예들을 통해 확립한 최적 배지에 LLB5238 균주를 접종하고 37℃에서 72 시간 동안 배양하면서, 일정 시간 간격으로 5ml씩 시료를 채취하여 글루탐산과 GABA의 농도를 측정하였다. 그 결과는 하기의 표 11과 같다.

배양 시간	생균수 [CFU/ml]	글루탐산 [mg/L]	GABA [mg/L]
0	4.6 ×10⁷	121.4	0
4	5.9 ×10⁷	121.6	0
8	8.9 ×10⁷	103.3	0.2
12	2.2 ×10⁸	33.6	61.2
24	6.8 ×10⁸	15.4	74.1
36	3.5 ×10⁹	0	76.6
48	3.7 ×10⁹	0	76.9
60	2.4 ×10⁹	0	74.3
72	2.5 ×10⁹	0	71.5

표 11을 참조하면, 생균수의 경우 48 시간 시점에서 가장 높은 생장성을 포였으며 그 후에는 거의 유사하거나 다소 감소하는 것을 알 수 있고, GABA의 생산량은 36 시간 내지 48 시간에서 제일 높은 것을 알 수 있다.

따라서 배양 시간은 36 내지 48 시간, 바람직하게는 생산 효율 등을 고려하여 36 시간일 때 고농도의 GABA를 생산할 수 있다.

상기 실시예 1 내지 실시예 9로부터 전처리 방법, 최적 배지 조성 및 최적 배양조건 등을 확립하였다.

본 발명에 따른 맥주 효모 부산물의 전처리는 100 메쉬의 체(Seive)를 통과한 뒤 pH 6의 세척수로 세척되고, 70℃에서 저온 가열되는 과정을 거칠 수 있다.

본 발명에 따른 GABA 생산을 위한 최적 배지 조성은 맥주 효모 부산물 500 vol.%, 글루코스 25 g/L, 효모추출물 5 g/L를 포함할 수 있고, 최적 배양조건은 배양 온도 37℃, 배양 초기 pH 6, 배양 시간 36 시간일 수 있다.

(3) 맥주 효모 부산물로부터 생산된 GABA 를 포함하는 식품 조성물의 제조

LLB5238 균주의 배양이 종료된 뒤, GABA를 포함하는 배양액에 탈지 분유 분말 (skim milk powder)을 15 중량% 되게 첨가한 다음 영하 80℃, 압력은 10mtorr 이하로 유지되는 동결건조기를 이용하여 96시간 동안 동결건조를 진행하였다. 동결건조에 의해 얻어진 분말을 회수하여 맥주 효모 부산물을 이용한 GABA 함유 분말의 제조를 완성하였다.

이렇게 제조된 GABA 함유 분말은 황갈색을 띄고 있었으며 총 171.3g이 회수되었다. 분말 내에는 3.4 × 10¹⁰ CFU/g의 LLB5238 균체를 포함하였으며 GABA 농도는 241.6mg/L인 것으로 확인되었다.

본 발명은 상기 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 제조될 수 있으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

(a) 맥주 효모 부산물을 전처리하는 단계; 및
(b) 상기 맥주 효모 부산물이 포함된 배지에 락토바실러스 브레비스(Lactobacillusbrevis) LLB5238(기탁번호 KCCM11538P)의 종균 배양액을 첨가하고 배양하는 단계를 포함하고,
상기 락토바실러스 브레비스(Lactobacillusbrevis) LLB5238(기탁번호 KCCM11538P)는 상기 배지에서 배양온도 30℃ 내지 37℃, 배양 초기 pH 6 내지 7 및 배양시간 36 내지 48 시간으로 배양되는 감마아미노부티르산(γ-aminobutyric caid, GABA)의 생산방법.
제 1 항에 있어서, 상기 전처리하는 단계는
상기 맥주 효모 부산물을 80 내지 100 메쉬의 체(sieve)로 걸러주고 pH 5 내지 7의 세척수로 세척하는 단계; 및
상기 맥주 효모 부산물을 70 내지 80℃로 저온 가열하는 단계를 포함하는 GABA의 생산방법.
제 1 항에 있어서, 상기 배지는
상기 맥주 효모 부산물 10 내지 50 vol.%;
탄소원으로 글루코스 25 g/L 내지 50 g/L; 및
질소원으로 효모추출물 5g/L 내지 10 g/L를 포함하는 GABA의 생산방법.
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