KR100661823B1

KR100661823B1 - Ｇａｂａ 고생산능을 가지는 신규한 락토코커스 유산균,이를 이용한 발효스타터 및 ｇａｂａ의 생산방법

Info

Publication number: KR100661823B1
Application number: KR1020040096547A
Authority: KR
Inventors: 오석흥; 박기범
Original assignee: 우석대학교 산학협력단
Priority date: 2004-11-23
Filing date: 2004-11-23
Publication date: 2006-12-27
Also published as: KR20060057398A

Abstract

본 발명은 GABA 고생산능을 가지는 신규한 락토코커스 속 유산균을 제공한다. 상기 유산균은 GABA 생산능이 종래 알려진 유산균에 비하여 월등하여 발효 유제품, 특히 치즈의 제조공정에 사용이 가능하다.

GABA, 락토코커스

Description

ＧＡＢＡ 고생산능을 가지는 신규한 락토코커스 유산균, 이를 이용한 발효스타터 및 ＧＡＢＡ의 생산방법{Lactococcus sp. Having High GABA Producing Property and Fementation Starter Using The Strain and Producing Method of GABA Using The Strain}

도 1은 본 발명에 따른 락토코커스 유산균의 현미경 관찰사진

본 발명은 발효유제품의 제조공정에 활용가능한 발효락토코커스 속 유산균, 이를 이용한 발효스타터 및 GABA의 생산방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 감마아미노부틸산(이하, GABA라 칭함) 고생산능을 가지는 신규한 락토코커스 속 유산균, 이를 이용한 발효스타터 및 GABA의 생산방법에 관한 것이다.

GABA는 억제성 신경전달물질로서 혈압상승을 억제하고 시력증진에 효과가 있으며 불안감, 초조감 등을 진정시키는 작용을 하는 것으로 알려진 물질이다. 동물의 경우 뇌, 심장, 폐, 신장 등에 분포되어 있으며, 식물의 경우 발아현미, 녹차 등에서 주로 발견되고 있다. 스트레스에 시달리는 현대인이나 수험생, 알코올 과다 섭취자의 경우 뇌와 혈중 GABA 농도가 낮은 것으로 보고되어 있으며, 체내 GABA 농도의 극심한 부족은 발작, 경련, 간질 증세를 일으키는 것으로 알려져 있어 이들 증세를 완화 내지는 치료하기 위해 체내 GABA 농도를 높이고자 하는 식품 또는 약제개발의 노력이 요구되고 있다.

발효식품 중 치즈는 단백질과 지방을 농축시켜 만든 것으로서 함유된 성분들이 발효과정 중에 분해되어 체내에서 소화흡수가 용이한 상태로 되어 있기 때문에 유제품의 꽃으로 불리우는 고급 식품이다. 또한 치즈는 저장성이 좋고 기타 식품첨가물이 없는 자연식품이기 때문에 누구나 안심하고 먹을 수 있는 좋은 식품이다.

덧붙여 치즈는 쌀과 야채를 주식으로 하는 우리에게 부족된 영양을 보충해 주기 위한 영양 보충 식품이다. 치즈는 위산과다인 경우에는 단백질성분의 완충효과로 중화제 역할을 할 수 있으며, 노인의 골다공증 방지에도 좋은 칼슘이 많이 함유되어 있어 질병치료와 예방에도 좋은 식품이며, 유당이 치즈속에는 없기 때문에 유당불내증이 있어 우유를 마시지 못하는 사람도 마음놓고 먹을 수 있는 식품이므로 우리의 식탁에 매일 올라와야 할 좋은 식품이다.

유산균은 치즈와 같은 발효유 제품뿐만 아니라 김치, 장류등 대부분 자연발효 식품에서 매우 중요한 역할을 담당하는 미생물 군이다. 하지만 이러한 유산균을 식품으로부터 섭취하는데 있어서는 한계성이 있고 GABA 및 유용아미노산을 많은 양 섭취할 수 있는 방법은 의약품 형태의 제제를 먹지 않는 이상 곤란하다.

우리나라는 고추장, 간장, 된장, 김치 등 발효기술을 이용하여 식품제조에 널리 사용해 온 나라임에도 불구하고 이와 관련한 미생물의 개량관련 기술은 그다지 활발하지 못한 실정이다. 덧붙여 요즘 요구르트나 치즈 등의 발효유제품에 대한 소비자의 기호가 다양화되면서 기능성이 우수한 물질을 생산하는 균주의 개발 및 특성화 균주의 개발은 매우 시급하다.

본 발명은 상기 종래기술이 가지는 문제를 해결하기 위하여 제시되는 것으로 그 목적은 발효유제품의 제조공정에 활용가능하며, GABA 생산능이 우수한 신규 락토코커스 속 유산균을 제공함에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 GABA 생산능이 우수한 신규 락토코커스 속 유산균을 포함하는 발효스타터를 제공함에 있다.

본 발명의 다른 목적은 식품첨가물로서 또는 의학적인 활성성분으로서 매우 유용한 GABA를 생물학적인 방법을 통해 대량으로 생산하는 방법을 제공함에 있다.

상기한 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 GABA 고생산능을 가지는 신규한 락토코커스 속 유산균을 제공한다. 상기 유산균은 GABA 생산능이 종래 알려진 유산균에 비하여 월등하여 발효 유제품의 제조를 위한 제조공정에 사용이 가능하다.

상기 유산균은 시판되는 치즈로부터 분리되어진 것이며, GABA의 생산능이 종래 락토바실러스 플란타럼, 락토바실러스 브레비스, 락토바실러스 랙티스에 비하여 100-500배 가량 높은 것으로 밝혀졌다. 상기 균주의 균학적 특성은 하기 표 1에서와 같다.

<표 1>

특성	선발균주
세포의 그람염색	그람양성
형태	구균
포자생성	-
포도당 배지에서의 가스생성능	CO₂ 생성
카탈라아제 생성능	+
15℃에서의 생장능력	+
45℃에서의 생장능력	-
미생물 크기(㎛)	1.0-1.5

상기 특성을 가지는 본 발명에 따른 유산균은 1차적으로 TLC를 수행하여 GABA 생성능이 있는 균주들을 선발하였으며, 동 실험에서 선발된 균주들을 대상으로 2차적으로 아미노산 자동분석기를 이용하여 이 중에서 가장 많은 함량의 GABA를 생산하는 것으로 확인된 균주를 최종적으로 선발한 것으로, 동 균주는 2004.11.01일 자로 한국미생물보존센터를 기탁기관으로 하여 KFCC-11338호로 기탁되어졌다.

상기 본 발명에 따른 유산균 락토코커스 오피씨 1(KFCC-11338)는 치즈생산용 발효스타터로서 적합하며, 발효스타터는 상기 균주 이외의 다른 유산균주가 더 포함되어질 수 있으며, 바람직하게는 락토코커스 랙티스, 락토바실러스 플란타럼, 락토바실러스 브레비스의 혼합균주의 형태로서 이용되어질 수 있다. 상기 혼합균주들을 구성하는 각 유산균주의 조성비는 특별한 한정을 요하지는 아니하므로, 예를 들어 동일한 비율로서 조성되어도 무방하다.

또한 본 발명은 GABA 고생산능을 가지는 락토코커스 오피씨 1(KFCC-11338)을 배양하여 배양물로부터 GABA를 생산하는 방법을 제공한다. 이때 사용가능한 배양배지로는 엠알에스(MRS) 브로스, 엠17(M17) 브로스, 비에이치아이(BHI) 브로스 등이 있다. 배양온도로는 35 - 37 ℃가 적합하다. 통상적으로 배양시간은 특별한 한정을 요하지는 아니하나, 1 - 2 일 정도가 적합하다. 바람작하게는 상기 균주는 비에이치아이(BHI)배지에서 생육이 활발한 것으로 관찰되었고, 35 - 37 ℃에서 생육이 왕성한 것으로 확인되었다.

GABA생산량을 높이기 위한 방법으로는, 예를 들어 엠에스지(MSG)를 기질로 첨가하는 방법에 따라 GABA 고함유 유산균을 다양한 제형으로서 식품첨가물 또는 의학적인 활성성분으로서 제공되어질 수 있다.

이하, 본 발명의 내용을 실시예를 통해 보다 상세하게 설명하고자 하나, 본 발명의 권리범위가 여기에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 유산균주의 분리 및 균학적 특성

시중에 판매되고 있는 치즈 및 유제품을 구입하여 1g 당 5㎖의 멸균수로 희석하였다. GABA 고생산 유산균의 분리 및 계수를 위하여 상기 희석액을 1％ 펩톤수를 사용하여 10^-1-10^-8농도로 희석하였다. 상기 희석액 1㎖를 취하여 평판계수용 아가(PCA)로 37℃에서 48시간 배양하여 나타난 콜로니를 총균수로 하였다. 동일한 방법으로 구균 선별 배지인 M17 한천배지(Difco)에 30℃에서 72시간 상기 샘플 희석액을 배양하여 나타난 콜로니를 관찰하였고, 상기 콜로니를 선발하여 개개별로 액 체 배지에 48시간 재배양하여 TLC선발 실험에 사용하였다.

상기 선별된 균주들은 1차적으로 TLC를 이용하여 균주의 GABA 생산성 유무를 측정하였다. TLC를 위한 용매로는 부탄올:아세트산:물=4:1:1인 혼합용매가 사용되었으며, 닌히드린 염색법을 이용하여 확인하였다. 표준시약은 시그마 표준품을 사용하였으며, TLC의 전개시간은 대략 30분 정도로 하였다. TLC를 이용한 1차 선별실험결과 콜로니에서 GABA를 생성하는 것으로 확인된 샘플은 2차 선별용 샘플로서 준비하였다.

상기 과정을 통해 1차 선별된 균주를 다시 MSG를 1％, 3％, 5％ 처리하여 아미노산 자동분석기를 이용하여 GABA 함량을 측정하였다.

샘플 중의 GABA 함량을 측정하기 위해 -70℃로 보관된 샘플로부터 유기용매 혼합액(메탄올:클로로포름:증류수=12:5:3)을 가하여 섞어준 다음 GABA을 포함하는 수용액 층은 4℃하에서, 12000×g에서 15분 동안 원심분리하여 얻었다. 원심분리하여 얻은 액을 재차 원심분리하여 혹시 존재할지 모르는 불순물을 제거하였다. 상기 얻어진 상등액을 동결건조하여 소량의 물로 녹여준 후 0.45㎛ PVDF 필터로 여과하여 분석에 사용하였다. GABA의 형광 유도체화를 위하여 AccQ Tag 시약을 사용하였으며, 이들 유도체의 분리를 위해 3.9mm ×150mm AccQ Tag ^TM(Nova-Pak^TM C18,Waters) 칼럼(column)을 사용하였다. GABA 함량은 표준 아미노산의 결과와 비교하여 산출하였으며 그 결과 가장 많은 GABA를 생산하는 균주를 본 발명에 따른 균주로서 최종선발하였다.

선별된 균주를 200㎖의 BHI 브로스에 0.5g 접종하여 30℃에서 16 - 20시간 진탕 배양하여 증식시켰다. 완전히 증식된 균주를 함유하는 BHI 브로스 10㎖를 멸균 튜브에 넣고 8000×g, 8분간 원심분리하여 균체를 획득하였다. 균체에 BHI 브로스:글리세롤을 5:1의 비율로 구성한 냉동배지(freezing media) 5㎖를 넣고 볼텍스 혼합기로 잘 섞어 준 후 크리오관에 넣어 즉시 -40℃로 냉동하였다(3분). 냉동된 균주는 이 후 유산균 접종을 위한 스타터로 사용되었다.

<실시예 2> 유산균주의 동정

GABA 고생산성 균주의 동정을 위하여 형태학적, 생화학적 특성을 "Bergey's Manual of Determinative bacteriology"에 따라 조사하였다. 최적 생육온도, 그람염색, 운동성, 카탈라아제 테스트, CO₂생성 유무 및 당을 발효하여 여러 가지 유기산들을 생성하는 것은 API 50-CHL 키트(BioMerieux, France)를 사용하여 조사하였다. (표 1, 표 2)

<표 2>

	탄수화물	선발균주
1	말토오즈	+
2	D-글루코오즈	+
3	람노오즈	-
4	글리세롤	-
5	락토오즈	+
6	트레할로오즈	+
7	D-만노오즈	-
8	리보스	+
9	솔비톨	-
10	갈락토스	+
11	만니톨	-
12	D-자일로오즈	-
13	D-아라비노오즈	-
14	셀로비오즈	+
15	살리신	+
16	멜리비오스	-
17	D-라피노오즈	-
18	이눌린	-
19	자일리톨	-
20	D-아라비톨	-
21	글루코네이트	+
22	아미돈	+
23	이노시톨	+
24	아미그달린	+
25	아도니톨	-

최종적인 동정을 위하여 분리균의 16s rDNA 서열을 결정하여 알려진 균주들과 비교하였다. PCR용 프라이머들은 Bionex에서 제작한 것으로 포워드 프라이머는 5'-GAACGCTGGCGGCGTGCCTAAT-3', 리버스 프라이머는 5'-GTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAA-3'을 사용하였다.

균주 동정을 위한 16s rDNA 염기서열은 다음 과정을 통해 조사되었다. 배지는 MRS 브로스(Difco)를 사용하였고 락토바실러스와 Weissella속 균주는 37℃, 류코노스톡속 균주와 김치 젖산균 WL6는 30℃에서 배양하였으며, PCR용 염색체 DNA는 Puregene(Gentra System, Inc.) 키트를 사용하여 추출하였다.

Taq DNA 중합효소는 Promega(Madison, Wisconsin, USA)제를 사용하였고, 기타 시약은 특급의 제품을 구매하여 사용하였다. PCR 방법은 Biometra제(tampa, Florida USA)를 사용하였고, 16S rDNA 세트(OPC 16s F, OPC 16s R)는 변성 단계를 95℃에서 5분 실시하였고, 증폭 단계를 35 사이클(95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분 30초)로 하였으며, 연장 단계를 72℃에서 10분으로 하였다. 증폭된 DNA는 1％(w/v) 아가로오즈 젤에 전개하였으며, 분자량 DNA 마커는 λDNA를 EcoRⅠ(Promega)으로 절단한 것을 사용하였다.

본 발명 유산균의 16s rDNA 염기서열을 조사한 결과는 서열번호 1과 같이 약 1,304bp의 염기서열을 조사하였으며 분자계통학적 염기서열 검색을 사용한 미생물 동정 결과 락토코커스 랙티스(Acess No. AB100798) 와 98％의 상동성을 보여 락토코커스 랙티스로 동정되어 이를 락토코커스 랙티스 OPC-1 균주로 명명하였다 (도 1참조). 상기 본 발명에 따른 유산균주는 한국미생물보존센터에 2004.11.01일자 KFCC-11338호로서 기탁되어졌다.

<실험예> Lactococcus OPC-1을 이용한 GABA 생산능 측정

GABA 함량측정 및 분석방법은 HPLC를 이용한 GABA분석에 준하여 실험을 실행하였으며, MSG 5％ 처리하였을 때 본 발명에 따른 균주와 공지의 균주를 비교실험한 결과는 하기 표 3과 같았다.

균주	GABA함량(nmol/㎖)
Lactococcus OPC-1	3020.08
Lactobacillus plantarum kctc3103	30.09
Lactobacillus brevis kctc 41028	2.09
Lactococcus lactis kctc 3115	5.15
Lactococcus lactis kctc 3191	6.45

상기와 같이 본 발명에 따른 유산균주는 공시균주에 비하여 최대 400배 이상 의 GABA 생산량을 보이므로 식품, 사료 및 의학적인 용도로서 매우 유용하게 활용될 수 있음을 알 수 있다. 의학적인 용도로서 제공되는 경우에는 이를 산제, 정제, 환제 등 제형에 구애받음이 없이 다양한 형태로 제공될 수 있다.

<제조예 1> 치즈의 제조

치즈의 제조과정은 커드를 제조하기 위하여, 탈지유를 치즈 배트에 옮겨 63℃에서 30분간 살균하고, 30℃로 냉각시킨 후 실시예1에서 준비한 발효스타터를 5％(v/v)로 접종하였다. 탈지유의 산도가 0.18％에 도달되었을 때, 탈지유 450kg에 대하여 렌넷 1 ml를 1:40의 부피비율로 물과 희석하여 첨가한 다음, 렌넷 응고의 최적 pH인 4.80으로 감소될 때까지 계속 정치하여 커드를 생성시켰다.

이렇게 제조된 커드를 가로, 세로 1/2인치 크기로 절단하고 15분간 정치한 다음, 처음 40분간은 34.4℃, 그후 30분간은 38.9℃, 그 다음 20분간은 42.2℃, 그후 10분간은 44.4℃로 가온시키고, 유청의 pH를 3.9N NaOH 또는 2.2N 젖산을 이용하여 pH 4.5로 고정하였다. 그 후, 가온을 계속하여 처음 20분간은 48.9℃, 그 다음 30분간은 55.5℃까지 가온시킨 다음, 55.5℃에서 20분간 방치하여 유청을 제거하고, 15분간씩 2회 수세하여 커드의 온도가 4.4℃로 유지되도록 하였다.

상기 커드에 드레싱할 크림 드레싱은 커드 1,000g에 대하여 크림(지방 35％, 고형분 42.29％) 170g, 탈지유(지방 0.05％, 고형분 8.5％) 250g, 탈지분유(지방 0.5％, 고형분 97％) 20g 및 식염 15g을 혼합하고, 49℃에서 예비가열하여 7,000바(bar)에서 5분간 균질화시킨 다음, 80℃에서 40분간 살균하여 제조하였다. 이를 상 기에서 제조된 커드에 드레싱하여 드레싱 비율 30％, 드레싱 고형량 24％, 드레싱 지방 13％인 카테지 치즈를 제조하였다.

<제조예 2> 분말요구르트의 제조

정제수 67중량부에 분리대두단백 10중량부, 탈지분유 9중량부, 유청단백 1중량부, 포도당 2중량부, 자당 2중량부, 베타사이클로덱스트린 1중량부를 혼합, 균질화하고 90℃ 온도에서 10분간 열처리한 후 냉각시킨 시료에 실시예 1의 락토코커스 랙티스 OPC-1 원말 (300억개/g 이상) 8중량％를 혼합하여 38℃, 8시간 동안 항온 정치배양하고 생성된 발효커드를 균질화한 다음 과채발효엑기스 30중량부, 요구르트향 0.07 중량부, 물 69.93 중량부를 혼합하여 멸균, 냉각한 당액과 1:2의 비율로 혼합, 균질화하였다. 이 액상의 발효혼합물을 150℃에서 분사건조기(Spray dryer)로 분말화하여 분말요구르트를 제조하였다.

본 발명은 종래 알려진 유산균에 대비하여 GABA의 생산능이 매우 우수한 유산균을 제공한다. 상기 본 발명에 따른 유산균은 발효유제품의 제조를 위한 발효스타터로서 사용이 가능하며, 특히 GABA 함유량이 높은 치즈제조에 적합하여 고부가가치 지향의 식품산업에 기여하는 바가 지대할 것으로 기대된다.

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Claims

GABA 고생산능을 가지는 락토코커스 오피씨 1(KFCC-11338)
GABA 고생산능을 가지는 락토코커스 오피씨 1(KFCC-11338)을 함유하는 발효스타터
GABA 고생산능을 가지는 락토코커스 오피씨 1(KFCC-11338)을 함유하는 치즈생산용 발효스타터
제 2항 또는 제 3항에 있어서, 발효스타터는 락토코커스 랙티스, 락토바실러스 플란타럼, 락토바실러스 브레비스의 혼합균주임을 특징으로 하는 발효스타터
GABA 고생산능을 가지는 락토코커스 오피씨 1(KFCC-11338)을 배양하여 배양물로부터 GABA를 생산하는 방법