CN110791451B

CN110791451B - 一株植物乳杆菌jylp-326及其对睡眠的改善应用和产品

Info

Publication number: CN110791451B
Application number: CN201911164848.7A
Authority: CN
Inventors: 曹维超; 马明磊; 潘玉林; 李翠华; 司书锋; 李桂华; 闫洪伟; 刘玉江; 孙川; 王维新; 周文浩
Original assignee: Shandong Zhongke Jiayi Bio Engineering Co ltd
Current assignee: Shandong Zhongke Jiayi Bio Engineering Co ltd
Priority date: 2019-11-25
Filing date: 2019-11-25
Publication date: 2020-10-02
Anticipated expiration: 2039-11-25
Also published as: CN110791451A

Abstract

本发明涉及改善睡眠技术领域，具体涉及一株植物乳杆菌JYLP‑326及其对睡眠的改善应用和产品，产品包含植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)JYLP‑326粉剂。该产品能够通过调整肠道菌群平衡，维护肠道菌群的完整性，从而降低肠道病患的焦虑症状，减少应激反应，改善情绪；该产品能够调节GABA、5‑羟色胺水平，使机体保持稳态，抑制焦虑和抑郁症状；该产品还具有调节机体激素水平，维持精神状态，缓解精神疲劳的功能。

Description

一株植物乳杆菌JYLP-326及其对睡眠的改善应用和产品

技术领域

本发明涉及改善睡眠技术领域，具体涉及一株植物乳杆菌JYLP-326及其对睡眠的改善应用和产品。

背景技术

根据《中国成人失眠诊断与治疗指南》的定义，失眠是指患者对睡眠时间和(或)质量不满足并影响日间社会功能的一种主观体验。失眠的常见病症为入睡困难、睡眠质量下降和睡眠时间减少，记忆力、注意力下降等。

随着社会经济的快速发展和自然环境的不断变化，人们的生活节奏普遍加快，在各种压力下，中年人和青少年也开始出现失眠问题，目前全世界有近30亿人遭受失眠困扰，我国也有6亿人存在失眠问题，失眠已成为全社会的巨大隐患。

现阶段，常用的治疗失眠的药物主要为化学合成类药物，泪如巴比妥类、苯二氮卓类及非苯二氮卓类短效药物，这些药物虽然具有确切的疗效，但患者易产生依赖，长期服用更是有可能引发医源性疾病。因此，提供一种既能改善睡眠质量，又不会产生药物依赖或不良反应的产品是十分必要的。

发明内容

针对现有技术缺少不会产生药物依赖或不良反应的改善睡眠质量的产品的技术问题，本发明提供一株植物乳杆菌JYLP-326及其对睡眠的改善应用和产品，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)JYLP-326较其他菌种粘附性更强，肠道定植能力更好；能够明显缓解因失眠症导致的体重下降；增加睡眠时间，调节下丘脑GABA分泌量。

第一方面，本发明提供一株植物乳杆菌JYLP-326，所述植物乳杆菌JYLP-326已于2019年6月27日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏单位的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC NO.18038。

进一步的，所述植物乳杆菌JYLP-326是从广西巴马的发酵糯米中获得的。

第二方面，本发明提供一种上述植物乳杆菌JYLP-326对睡眠的改善应用。

第三方面，本发明提供一种改善睡眠的产品，所述产品包含植物乳杆菌JYLP-326粉剂。

进一步的，所述植物乳杆菌粉剂的制备方法为将植物乳杆菌JYLP-326接种到MRS培养基平板中，接种量为1％，在37℃下培养后，对MRS菌液进行离心、真空冷冻干燥处理，获得菌粉。

进一步的，所述MRS培养基包括以下组分：

蛋白胨10g、牛肉粉5g、酵母粉4g、K₂HPO₄·7H₂O 2g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、CH₃COONa·3H₂O 5g、MgSO₄·7H₂O 0.2g、MnSO₄·4H₂O 0.05g、吐温80 1mL、蒸馏水1000mL。

进一步的，所述产品还包括低聚异麦芽糖。

进一步的，所述产品中植物乳杆菌JYLP-326的含量为50亿/g、150亿/g、250亿/g、500亿/g或1000亿/g。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

①本发明提供一株植物乳杆菌JYLP-326，较其他菌种粘附性更强，肠道定植能力更好；能够明显缓解因失眠症导致的体重下降；增加睡眠时间，调节下丘脑GABA分泌量。

②本发明还提供一种改善睡眠的产品，该产品能够通过调整肠道菌群平衡，维护肠道菌群的完整性，从而降低肠道病患的焦虑症状，减少应激反应，改善情绪；该产品能够调节GABA、5-羟色胺水平，使机体保持稳态，抑制焦虑和抑郁症状；该产品还具有调节机体激素水平，维持精神状态，缓解精神疲劳的功能。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是测试例1中JYLP-326与其他菌株在40个视野下的粘附数量柱形图；

图2是测试例2中大鼠体重增加量柱形图；

图3是测试例2中大鼠睡眠潜伏期柱状图；

图4是测试例2中大鼠睡眠时间柱状图；

图5是测试例2中大鼠下丘脑GABA含量柱状图；

图6是测试例3中8周间的平均匹兹堡睡眠质量指数柱状图；

图7是测试例3中8周后不同组睡眠质量柱状图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1植物乳杆菌JYLP-326的分离和鉴定

1、菌源

广西巴马当地传统工艺制作的糯米发酵食品。

2、菌株的分离

(1)广西巴马，对当地传统工艺制作的糯米发酵食品取样操作，取样过程用灭菌的取样匙进行操作，避免其他部位接触样品以防污染。取出样品后立即冷藏盒保存，并编号记录；

(2)对样品液体做十倍梯度稀释，每个梯度取100μL均匀涂布于MRS固体平板培养基上，随后取出置于厌氧罐中，37℃厌氧培养过夜；

MRS培养基包括以下组分：

蛋白胨10g、牛肉粉5g、酵母粉4g、K₂HPO₄·7H₂O 2g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、CH₃COONa·3H₂O 5g、MgSO₄·7H₂O 0.2g、MnSO₄·4H₂O 0.05g、吐温80 1mL、蒸馏水1000mL；

次日可见平板上长有形态大小各异的菌落，挑取若干乳酸菌的特征菌落作二代划线纯化处理，平板厌氧活化1天，得培养物，随后做菌株鉴定。

3、植物乳杆菌JYLP-326的鉴定

(1)鉴定单位

生工生物工程(上海)股份有限公司。

(2)引物序列

27F：5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'；

1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。

(3)鉴定的序列

(4)鉴定结果

该菌株被鉴定为Lactobacillus plantarum(植物乳杆菌)，其分类单元为：Bacteria；Firmicutes；Bacilli；Lactobacillales；Lactobacillaceae；Lactobacillus。

实施例2一种改善睡眠的产品

一种改善睡眠的产品，产品包含植物乳杆菌JYLP-326和低聚异麦芽糖，其中植物乳杆菌JYLP-326的含量为150亿/g；

产品的制备方法包括以下步骤：

(1)将植物乳杆菌JYLP-326接种到MRS培养基平板中，接种量为1％，在37℃下培养后，对MRS菌液进行离心、真空冷冻干燥处理，获得菌粉；

MRS培养基包括以下组分：

(2)将步骤(1)治好的植物乳杆菌JYLP-326与低聚异麦芽糖按比例复配，得到产品，低聚异麦芽糖购自保龄宝生物股份有限公司。

测试例1JYLP-326与其他菌株肠道定植能力对照

本测试例对菌株在40个视野下的粘附数量进行测试。

1、试剂

MRS培养基：蛋白胨10g、牛肉粉5g、酵母粉4g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、K₂HPO₄·7H₂O 2g、CH₃COONa·3H₂O 5g、MnSO₄·4H₂O 0.05g、MgSO₄·7H₂O 0.2g、吐温80 1mL；

DMEM培养基购于GIBCO公司；

PBS(1L，pH7.4)：KH₂PO₄ 0.27g、Na₂HPO₄ 1.42g，NaCl 8g，KCl 0.2g，加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1L。

2、粘附操作

将Caco-2细胞分别置于含10％热灭活新生牛血清和双抗(青霉素浓度100U/mL、链霉素1.0μg/mL)的DMEM培养液中，于37℃、5％CO₂、相对湿度95％的二氧化碳培养箱中孵育，每天换1次培养液，3～4d传代1次，15～20d后将细胞接种于24孔培养板中，接种密度约为5×10⁵CFU/mL，待细胞长至单层后进行黏附试验。

将活化好的JYLP-326按体积分数为1％的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃培养12～14h，离心收集菌体(4000g，4℃，10min)，后用无菌PBS(pH7.4)洗涤3次，将菌体重悬于PBS中，用PBS将菌悬液稀释调整至所需要的浓度(3×10⁸CFU/mL)。

将已长成单层的细胞用灭菌PBS(pH7.4)漂洗2次，每孔加入0.5mL植物乳杆菌JYLP-326菌悬液(细菌浓度为3×10⁸CFU/mL)和0.5mL新鲜的DMEM培养液，置于37℃、5％CO₂、相对湿度95％的二氧化碳培养箱中孵育1h，用灭菌的PBS(pH7.4)漂洗细胞5次，以除去未黏附的细菌；漂洗完后，用甲醛固定，革兰染色，镜检，倒置显微镜下计算40个随机视野下100个细胞上黏附的细菌数。

对比菌株编号：ATCC8014、ATCC14917、ACCC11095、CICC21809、CICC22703、CICC6238、CICC6073。上述菌种均来源于开放的菌种保藏库，能够在市面上购买得到。

计算每个细胞黏附的平均细菌数，每个处理做3个平行，计算结果如图1所示，结果表明JYLP-326与其他对照菌株相比具有较强的粘附性。

测试例2JYLP-326对失眠小鼠的改善实验

1、失眠小鼠模型建立

(1)实验动物

Wistar雄性大鼠100只(广东省医学实验动物中心提供)，8-9周龄，体重180-220g。

(2)试剂

对氯苯丙氨酸(PCPA)，美国Sigma公司，CAS NO.742400-2；

戊巴比妥钠，国药集团化学试剂有限公司，批号WS20130601。

(3)失眠小鼠模型

将100只大鼠先适应性喂养7天，大鼠自由进食饲料和水，垫料保持干燥；7天后称量体重，随机分成正常对照组(10只)，造模组(90只)，造模组腹腔注射PCPA混悬液，连续注射2天，PCPA临用前按大鼠400mg/kg用量，用弱碱性生理盐水配置成混悬液备用，空白组腹腔注射等体积弱碱性生理盐水，第一次腹腔注36h后，大鼠出现昼夜节律缺失，日间与夜晚皆活动不断，戊巴比妥钠翻正实验，空白组与造模组睡眠潜伏期、总睡眠时间有统计学意义，提示造模成功。

2、实验分组及给药

空白组：正常大鼠，连续7天给生理盐水灌胃；

模型组：失眠大鼠，连续7天给生理盐水灌胃；

对照组：失眠大鼠，连续7天喂食低聚异麦芽糖0.02g；

实验组1：失眠大鼠，连续7天喂食100亿JYLP-326菌粉0.02g；

实验组2：失眠大鼠，连续7天喂食100亿ATCC14917菌粉0.02g；

实验组3：失眠大鼠，连续7天喂食100亿ACCC11095菌粉0.02g；

实验组4：失眠大鼠，连续7天喂食100亿CICC21809菌粉0.02g；

实验组5：失眠大鼠，连续7天喂食100亿CICC22703菌粉0.02g；

实验组6：失眠大鼠，连续7天喂食100亿CICC6238菌粉0.02g；

实验组7：失眠大鼠，连续7天喂食100亿CICC6073菌粉0.02g。

3、体重检测

分别于分组给药前、实验结束时称量体重，观察体重增加量。

测量结果如图2所示，模型组大鼠体重增加量明显低于空白组大鼠，对照组虽然高于模型组，但低于实验组。实验组中喂食JYLP-326菌粉的小组，小鼠体重高于其他实验小组。JYLP-326能够对失眠症导致的体重下降有明显的缓解效果。

4、睡眠潜伏期、总睡眠时间

大鼠造模36h后，各组均腹腔注射戊巴比妥钠30mg/kg，提起大鼠尾巴，将大鼠腹部朝上放在垫块上，记录大鼠的睡眠潜伏期及睡眠持续时间，以翻正反射丧失为发生睡眠，以翻正反射恢复为觉醒。如果怀疑翻正反射是否真正复原，于第一次翻正后立即重新背位平躺，如在1min之内又自动翻过来则前一次的时间即为恢复时间，否则以第二次翻过来的时间为准。从给药到翻正反射消失的时间为睡眠潜伏期，从翻正反射消失到恢复的时间为总的睡眠时间。

测试结果如图3、图4所示，失眠模型组大鼠睡眠的潜伏期明显高于空白组；对照组和实验组也高于空白组，其中实验组中的JYLP-326最低。菌株JYLP-326能够迅速度过睡眠潜伏期；相反的，实验组睡眠时间高于模型组较高，实验组中的菌株JYLP-326睡眠时间最接近空白组。

5、GABA含量检测

采用高效液相色谱仪以邻苯二甲醛柱前衍生，反相柱分离，pH值6.0醋酸盐缓冲溶液与甲醇二元梯度洗脱，测定下丘脑GABA的含量。

(1)样品处理

大鼠在喂食7天结束后，水合氯醛腹腔注射麻醉后直接断头取脑，冰盘上分离下丘脑先从视交叉和乳头体后缘之间冠状垂直切除，再从中线左右各旁开2mm切除两边脑组织，最后将标本修整成2mm×4mm类长方体，冰冻生理盐水漂洗后滤纸拭干，眼科剪刀切成小碎块，称取10mg下丘脑组织，制备脑组织匀浆上清液。

(2)高效液相色谱仪测定含量

将标准品溶于人工脑脊液中，其浓度为1mmol/L，分装后-20℃冷藏，临用前稀释10倍和100倍，以GABA的标准品对峰面积作校准曲线，以外标法计算标本浓度。

检测结果如图5所示，失眠大鼠对于普通大鼠，GABA含量有明显下降，但实验组有明显的缓解，大鼠在睡眠时间有大幅增加的同时，GABA的含量趋于正常，其中JYLP-326效果最为明显，GABA分泌量更为接近。

测试例3睡眠临床实验

选取自愿接受益生菌治疗实验的成年失眠患者150名，分为空白组、对照组和试验组三组，每组50人，试验期间，每位患者仍然按照原来的生活饮食习惯不变。

空白组：正常生活饮食习惯；

对照组：每天服用1g低聚异麦芽糖；

试验组：JYLP-326每天服用150亿/g有效活菌数的菌粉1g；

试验内容：实验对象第二天起床后，填写匹兹堡睡眠量表，统计不同实验组之间平均分值的变化、实验结束后不同睡眠质量阶段的人数对照，实验持续8周时间。统计结果如下表1、图6所示。

表1

8周后实验结束，不同组睡眠质量对照如表2、图7所示。

表2

人数	空白组	对照组	试验组
				高(0-3分)	1	2	12
中(4-8分)	10	16	36
				低(9-16分)	37	34	10
差(17分以上)	12	8	2

根据上述实验结果可知，JYLP-326菌株对失眠状况有明显的改善。

尽管通过参考附图并结合优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求所述的保护范围为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东中科嘉亿生物工程有限公司

<120> 一株植物乳杆菌JYLP-326及其对睡眠的改善应用和产品

<130> 2019

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

agagtttgat cmtggctcag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ggttaccttg ttacgactt 19

<210> 3

<211> 1509

<212> DNA

<213> 植物乳杆菌 Lactobacillus plantarum

<400> 3

tggctcagga ctaacgctgg cggcgtgcct aatacatgca agtcgaacga actctggtat 60

tgattggtgc ttgcatcatg atttacattt gagtgagtgg cgaactggtg agtaacacgt 120

gggaaacctg cccagaagcg ggggataaca cctggaaaca gatgctaata ccgcataaca 180

acttggaccg catggtccga gcttgaaaga tggcttcggc tatcactttt ggatggtccc 240

gcggcgtatt agctagatgg tggggtaacg gctcaccatg gcaatgatac gtagccgacc 300

tgagagggta atcggccaca ttgggactga gacacggccc aaactcctac gggaggcagc 360

agtagggaat cttccacaat ggacgaaagt ctgatggagc aacgccgcgt gagtgaagaa 420

gggtttcggc tcgtaaaact ctgttgttaa agaagaacat atctgagagt aactgttcag 480

gtattgacgg tatttaacca gaaagccacg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata 540

cgtaggtggc aagcgttgtc cggatttatt gggcgtaaag cgagcgcagg cggtttttta 600

agtctgatgt gaaagccttc ggctcaaccg aagaagtgca tcggaaactg ggaaacttga 660

gtgcagaaga ggacagtgga actccatgtg tagcggtgaa atgcgtagat atatggaaga 720

acaccagtgg cgaaggcggc tgtctggtct gtaactgacg ctgaggctcg aaagtatggg 780

tagcaaacag gattagatac cctggtagtc cataccgtaa acgatgaatg ctaagtgttg 840

gagggtttcc gcccttcagt gctgcagcta acgcattaag cattccgcct ggggagtacg 900

gccgcaaggc tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg 960

tttaattcga agctacgcga agaaccttac caggtcttga catactatgc aaatctaaga 1020

gattagacgt tcccttcggg gacatggata caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg 1080

tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttattatcag ttgccagcat 1140

taagttgggc actctggtga gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc 1200

aaatcatcat gccccttatg acctgggcta cacacgtgct acaatggatg gtacaacgag 1260

ttgcgaactc gcgagagtaa gctaatctct taaagccatt ctcagttcgg attgtaggct 1320

gcaactcgcc tacatgaagt cggaatcgct agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa 1380

tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg agagtttgta acacccaaag 1440

tcggtggggt aaccttttag gaaccagccg cctaaggtgg gacagatgat tagggtgaag 1500

tcgtaacaa 1509

Claims

1.一株植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）JYLP-326，其特征在于，所述植物乳杆菌JYLP-326已于2019年6月27日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏单位的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCCNO.18038。

2.如权利要求1所述的一株植物乳杆菌JYLP-326，其特征在于，所述植物乳杆菌JYLP-326是从广西巴马的发酵糯米中获得的。

3.如权利要求1所述的植物乳杆菌JYLP-326在制备改善睡眠的产品上的应用。

4.一种改善睡眠的产品，其特征在于，所述产品包含植物乳杆菌JYLP-326粉剂。

5.如权利要求4所述的一种改善睡眠的产品，其特征在于，所述植物乳杆菌粉剂的制备方法为将植物乳杆菌JYLP-326接种到MRS培养基平板中，接种量为1%，在37℃下培养后，对MRS菌液进行离心、真空冷冻干燥处理，获得菌粉。

6.如权利要求5所述的一种改善睡眠的产品，其特征在于，所述MRS培养基包括以下组分：

蛋白胨 10g、牛肉粉 5g、酵母粉 4g、K₂HPO₄•7H₂O 2g、柠檬酸三铵 2g、葡萄糖 20g、CH₃COONa•3H₂O 5g、MgSO₄•7H₂O 0.2g、MnSO₄•4H₂O 0.05g、吐温80 1mL、蒸馏水 1000mL。

7.如权利要求4所述的一种改善睡眠的产品，其特征在于，所述产品还包括低聚异麦芽糖。

8.如权利要求4所述的一种改善睡眠的产品，其特征在于，所述产品中植物乳杆菌JYLP-326的含量为50亿/g、150亿/g、250亿/g、500亿/g或1000亿/g。