CN115322940B - 一种植物乳杆菌及其助眠抗抑郁产品和应用 - Google Patents
一种植物乳杆菌及其助眠抗抑郁产品和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及的是一种植物乳杆菌及其助眠抗抑郁产品和应用，属于微生物领域，具体为植物乳杆菌MH‑LP‑126。将该菌株接种于发芽燕麦、发芽黑豆、发芽小米、发芽豌豆、胡萝卜、葡萄糖、谷氨酸钠、竹叶和刺五加叶的混合植物基质中发酵，产物中γ‑氨基丁酸含量高，能够起到助眠和抗抑郁作用，可以应用于食品、保健品和药品中，具有很好的市场前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一种植物乳杆菌及其助眠抗抑郁产品和应用。
背景技术
γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，简称GABA）又称4-氨基丁酸，相对分子质量为103.12，它是人和动物体内最主要的一种神经信息传导物质，在人体内多存在于脊髓中。人体内缺乏GABA是导致人的身心不适症状的主要原因，这些症状包括抑郁、失眠、愤怒、恐慌、不安等等，而补充GABA的重要性就在于可以舒缓和抑制过度兴奋和激烈的神经信息传导，从而使人安定平和下来。现有研究表明，人脑一天至少要补充10-20mg以上的GABA。
长时间的压力会让人变的易怒、空虚、忧郁、睡眠困难，进而影响身体健康及生活品质。因此，研究缓解和治疗这些疾病的药物、保健品或食品就显得十分重要。为了满足应用需求，γ-氨基丁酸的生产方法就需要被改进。
现有技术中多采用生物发酵进行γ-氨基丁酸的制备：
申请号为CN202111266767.5 的中国专利中公开了一种高产γ-氨基丁酸的酿酒酵母菌以及在制备γ-氨基丁酸产品中的应用。具体包括一种高产γ-氨基丁酸的酿酒酵母菌，分类命名为酿酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae CLNJ1，已于2021年9月16日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No.23423。同时公开了利用酿酒酵母菌CLNJ制备γ-氨基丁酸的应用以及在发酵培养基中添加茶粉以提高γ-氨基丁酸的产量的方法。另外，公开了利用醋酸菌和酿酒酵母菌CLNJ制备富含γ-氨基丁酸的康普茶的方法，制备工艺简单，尤其适合大规模工业化生产。制备出来的康普茶营养价值高，又富含γ-氨基丁酸，增加了饮品的营养保健功能，具有广阔的市场需求和经济效益。
申请号为CN202180001791.8 的中国专利中公开了一种产γ-氨基丁酸的嗜热链球菌及其应用，所述产γ-氨基丁酸的嗜热链球菌命名为Streptococcus thermophilusST36，保藏在中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.20676，保藏日期为2020年9月18日。还提供了一种所述产γ-氨基丁酸的嗜热链球菌的筛选方法、一种含γ-氨基丁酸的乳制品的制备方法及利用所述制备方法制备得到的含γ-氨基丁酸的乳制品。所述产γ-氨基丁酸的嗜热链球菌的γ-氨基丁酸合成能力极强，发酵时间较短，制备得到的乳制品中含有丰富的γ-氨基丁酸，风味极佳，应用前景极其广阔。但其发酵基料成本较高，γ-氨基丁酸产率偏低，如果应用于γ-氨基丁酸的纯化制备，显然不具有优势。
挖掘一种γ-氨基丁酸产率高，且应用限制小的菌种对于γ-氨基丁酸的应用具有重要意义。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种植物乳杆菌（Lactobacillus plantarumMH-LP-126）菌株发酵植物基质生产助眠及抗抑郁物质的方法。主要包括植物乳杆菌MH-LP-126菌株的筛选获得，植物培养基质的制备，产生γ-氨基丁酸发酵条件的控制，高含γ-氨基丁酸发酵物的低温冷冻干燥，制成粉剂、压片、胶囊或直接添加于各种产品。
一方面，本发明提供了一种植物乳杆菌。
本发明菌株经中国科学院微生物研究所鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），菌株编号为MH-LP-126，即本发明提供了植物乳杆菌MH-LP-126。
所述的植物乳杆菌MH-LP-126保藏号为CGMCC No.24283，于2022年01月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
另一方面，本发明提供了一种植物乳杆菌制备物。
所述的制备物通过前述的植物乳杆菌MH-LP-126制备得到。
所述的制备物包括但不限于培养物和冻干粉中的一种或多种。
所述的培养物包括但不限于发酵液和发酵液沉淀中的一种或多种。
再一方面，本发明提供了一种植物乳杆菌MH-LP-126的培养方法。
所述的培养方法中包括将所述的植物乳杆菌MH-LP-126接种于培养基。
优选地，所述的培养基为发芽燕麦、发芽黑豆、发芽小米、发芽豌豆、胡萝卜、葡萄糖、谷氨酸钠、竹叶和刺五加叶的混合植物基质。
进一步优选地，所述的培养基中包括发芽燕麦20.0-60.0g、发芽黑豆5.0-60.0g、发芽小米5.0-60.0g、发芽豌豆5.0-60.0g、胡萝卜5.0-50.0g、葡萄糖0.5-5.0g、竹叶5.0-35.0g、刺五加叶5.0-35.0g和纯净水100.0-500.0mL。
优选地，培养温度为35-42℃，密闭无氧发酵。
更优选地，在发酵到第8-12小时开始流加谷氨酸钠溶液，溶液浓度0.5-6.0%w/v。
又一方面，本发明提供了前述的植物乳杆菌MH-LP-126和制备物中的一种或多种在制备食品中的应用。
所述的应用可以是直接向食品中添加植物乳杆菌MH-LP-126或其制备物，或者通过植物乳杆菌MH-LP-126制备γ-氨基丁酸再添加至食品中。
所述的食品可以是乳制品，优选为发酵乳。
所述的食品中还可以包括其他食品上允许的添加剂，如《食品添加剂使用标准》(GB 2760-2014)中允许的添加剂，可以是调味剂、调色剂、填充剂、崩解剂、甜味剂、润滑剂、粘合剂、pH调节剂。
优选地，所述的食品中还可以包括调味剂，如香精。
又一方面，本发明提供了前述的植物乳杆菌MH-LP-126和制备物中的一种或多种在制备保健品中的应用。
所述的应用可以是直接向保健品中添加植物乳杆菌MH-LP-126或其制备物，或者通过植物乳杆菌MH-LP-126制备γ-氨基丁酸再添加至保健品中。
又一方面，本发明提供了前述的植物乳杆菌MH-LP-126和制备物中的一种或多种在制备药品中的应用。
所述的应用可以是直接向药品中添加植物乳杆菌MH-LP-126制备物，或者通过植物乳杆菌MH-LP-126制备γ-氨基丁酸再添加至药品中。
所述的药物为镇静催眠药、降压药、降脂药和抗抑郁药物中的一种或多种。
本发明的应用通过植物乳杆菌MH-LP-126进行γ-氨基丁酸的制备然后应用于药物，因此对于γ-氨基丁酸可进行治疗的病症，本申请提供的植物乳杆菌MH-LP-126和制备物中的一种或多种都可进行制备。
如：γ-氨基丁酸能通过抑制血管紧张素肽转换酶来降低血压；γ-氨基丁酸能够抑制谷氨酸的脱羧反应，促使更多的谷氨酸与氨结合生成尿素排出体外，达到健肝利肾的功能；γ-氨基丁酸可以抑制神经诱导的气道平滑肌收缩、微血管渗漏及过敏反应，从而控制哮喘；γ-氨基丁酸作为一种抑制性神经递质参与激素的分泌调节，促进生长激素、促肾上腺皮质激素、糖皮质激素以及促性腺素的释放；γ-氨基丁酸能够促进大脑的能量代谢，活化脑血流，增加氧供给量，最终恢复脑细胞功能，改善神经机能，达到镇静安神，增强记忆的功能；γ-氨基丁酸能促进胰腺中胰岛素的分泌，有效地预防糖尿病；γ-氨基丁酸能促进酒精代谢，预防肥胖，防止动脉硬化，调节心律失常以及防止皮肤老化的作用；γ-氨基丁酸还能应用于尿毒症以及CO中毒的治疗药物。
所述的药物中还包括其他药学上可接受的载体或赋形剂。
又一方面，本发明提供了通过前述的植物乳杆菌MH-LP-126和制备物中的一种或多种进行制备的食品。
所述的食品中包括植物乳杆菌MH-LP-126制备物，或者通过植物乳杆菌MH-LP-126制备γ-氨基丁酸再添加至食品中。
又一方面，本发明提供了通过前述的植物乳杆菌MH-LP-126和制备物中的一种或多种进行制备的保健品。
所述的保健品中包括植物乳杆菌MH-LP-126制备物，或者通过植物乳杆菌MH-LP-126制备γ-氨基丁酸再添加至保健品中。
又一方面，本发明提供了通过前述的植物乳杆菌MH-LP-126和制备物中的一种或多种进行制备的药物。
所述的药品中包括植物乳杆菌MH-LP-126制备物，或者通过植物乳杆菌MH-LP-126制备γ-氨基丁酸再添加至药品中。
本发明的有益效果：
本发明提供的植物乳杆菌MH-LP-126经发酵后，发酵产物中γ-氨基丁酸产率高，可达13.021g/L。
保藏说明
中文学名：植物乳杆菌；
拉丁学名：Lactobacillus plantarum；
菌株编号：MH-LP-126；
保藏编号：CGMCC No.24283；
保藏时间：2022年01月10日；
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
基础实验例植物乳杆菌MH-LP-126的分离
采集黄浆水、酸败米汤等样品，采用平板分离法，从中筛选出306株产GABA的乳酸菌菌株，又经反复初筛、复筛，筛得一株高产GABA的菌株，对该菌株进行了形态学及生理生化鉴定，并经分子遗传学鉴定，与GenBank上已提交的16SrDNA 进行BLAST比对，结果表明，其归属于乳酸杆菌(Lactobacillus)属。由MEGA6.0软件构建的系统发育树结果表明，该菌株与Lactobacillus plantarum 16SrDNA序列同源性达99%，且与生理生化试验结果一致，因此，确定该菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。
以此菌株进行发酵试验，测得其发酵液中GABA产率为5.833g/L。然后，又对该菌株进行多次化学诱变和物理诱变，获得一株高产突变株，连续传代10次后遗传学性状稳定，将其命名为MH-LP-126。又对该菌株进行驯化，优化培养，再经过反复培养条件和发酵条件的优化，最后发酵液中平均GABA产率为6.899g/L，较初发菌株产率提高了18.28%。最后，将菌株MH-LP-126送中国科学院北京微生物研究所进行鉴定，其鉴定结果完全一致。MH-LP-126细胞形态和理化实验结果如下：
表格中空白表示无结果。
检测鉴定结论：
在实验室条件下，根据送检菌种的细胞形态、生理生化特征等实验数据综合分析，参考《伯杰氏系统细菌学手册》以及International Journal of Systematic andEvolutionary Microbiology 有关研究论文，送检菌种MH-LP-126的鉴定结果为：Lactiplantibacillus plantarum植物乳植杆菌（同种异名：Lactobacillus plantarum植物乳杆菌）。
申请人于2022年01月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24283。
以下实施例中，植物基质的制备方法参考以下：
（1）分别将燕麦、黑豆、小米、豌豆在一定条件下进行发芽，芽长不要超过种粒的25%；
（2）分别称取竹叶5.0-35.0g，刺五加叶5.0-35.0g，加水100-1000mL，加热煮沸，保持15-30min，趁热过滤，去渣，得竹刺叶溶液；
（3）将胡萝卜处理洗净，称取5.0-50.0g，切碎；另称取发芽燕麦20.0-60.0g、发芽黑豆5.0-60.0g、发芽小米5.0-60.0g、发芽豌豆5.0-60.0g和葡萄糖0.5-5.0g置于组织破碎机处理5-15min。然后，将竹刺叶溶液加入，再置于均质机中进行均质处理，即得到植物培养基质（PM）；
（4）将植物培养基质（PM）进行105-121℃灭菌15-25min，备用；
（5）称取0.5-6.0g谷氨酸钠盐，溶解于100mL纯净水中，105-121℃灭菌15-25min，备用。
以下实施例中，种子培养方法参考以下：
将上述植物培养基质（PM）稀释2-5倍，接入MH-LP-126菌种，置于35-42℃培养箱中培养12-24小时，制得成熟种子。
以下实施例中，发酵与控制方法参考以下：
将培养成熟的植物乳杆菌MH-LP-126菌种接种至灭好菌的植物培养基质（PM）中，温度控制在35-42℃，密闭无氧发酵36-96小时。在发酵到第8-12小时开始流加谷氨酸钠溶液，溶液浓度0.5-6.0%w/v，流加速度10-100mL/h。至发酵结束前12小时流加结束。也可分批进行流加，在发酵到第8-12小时开始第一次流加，以后每隔2-6小时流加一次，至发酵结束前12小时流加完毕。在流加过程中，需进行充分搅拌。
以下实施例中，低温冷冻干燥方法参考以下：
发酵结束后，迅速将高含γ-氨基丁酸的发酵物置于冷冻干燥机中进行低温冷冻干燥，至含水量≤8.0%。然后再进行粉碎，制成粉剂、压片、胶囊或添加于其它各种食品中。
以下实施例中，检测最后发酵液中平均GABA产率的方法为Berthelot比色法。
实施例1 一种植物乳杆菌的培养方法
1.将燕麦、黑豆、小米、豌豆在一定条件下分别进行发芽，芽长不要超过种粒的25%。
2.称取竹叶15.0g，刺五加叶15.0g，加水150mL，加热煮沸，保持15min，趁热过滤除渣，得竹刺叶溶液。
3.将胡萝卜处理洗净，称取15.0g，切碎。另称取发芽燕麦20.0g、发芽黑豆15.0g、发芽小米15.0g、发芽豌豆15.0g和葡萄糖0.5g置于组织破碎机处理10min。然后，将竹刺叶溶液加入，再置于均质机中进行均质处理，即得到植物培养基质（PM），将植物培养基质（PM）进行105℃灭菌15min，冷却至35℃。
4.将培养成熟的植物乳杆菌MH-LP-126菌种接种至灭好菌的植物培养基质（PM）中，温度控制在37℃，密闭无氧发酵72小时。在发酵到第8小时开始流加谷氨酸钠溶液，溶液浓度3.0%w/v，流加速度10mL/h，总流加量150mL。
5.发酵结束后，迅速将高含γ-氨基丁酸的发酵物置于冷冻干燥机中进行低温冷冻干燥，至含水量≤8.0%。然后再进行粉碎，制成粉剂、压片、胶囊或添加于其它各种食品中。
实施例2 一种植物乳杆菌的培养方法
1.将燕麦、黑豆、小米、豌豆在一定条件下分别进行发芽，芽长不要超过种粒的25%。
2.称取竹叶20.0g，刺五加叶25.0g，加水200mL，加热煮沸，保持15min，趁热过滤除渣，得竹刺叶溶液。
3.将胡萝卜处理洗净，称取25.0g，切碎。另称取发芽燕麦20.0g、发芽黑豆20.0g、发芽小米15.0g、发芽豌豆10.0g和葡萄糖0.5g置于组织破碎机处理10min。然后，将竹刺叶溶液加入，再置于均质机中进行均质处理，即得到植物培养基质（PM），将植物培养基质（PM）进行105℃灭菌15min，冷却至35℃。
4.将培养成熟的植物乳杆菌MH-LP-126菌种接种至灭好菌的植物培养基质（PM）中，温度控制在37℃，密闭无氧发酵60小时。在发酵到第10小时开始加入谷氨酸钠溶液，溶液浓度2.5%w/v，共配制200mL，以后每间隔2小时加入10.0mL，直至将200mL加完。
5.发酵结束后，迅速将高含γ-氨基丁酸的发酵物置于冷冻干燥机中进行低温冷冻干燥，至含水量≤8.0%。然后再进行粉碎，制成粉剂、压片、胶囊或添加于其它各种食品中。
实施例3 一种植物乳杆菌的培养方法
1.将燕麦、黑豆、小米、豌豆在一定条件下分别进行发芽，芽长不要超过种粒的25%。
2.称取竹叶25.0g，刺五加叶25.0g，加水250mL，加热煮沸，保持25min，趁热过滤除渣，得竹刺叶溶液。
3.将胡萝卜处理洗净，称取35.0g，切碎。另称取发芽燕麦30.0g、发芽黑豆35.0g、发芽小米25.0g、发芽豌豆25.0g和葡萄糖1.5g置于组织破碎机处理10min。然后，将竹刺叶溶液加入，再置于均质机中进行均质处理，即得到植物培养基质（PM），将植物培养基质（PM）进行105℃灭菌20min，冷却至35℃。
4.将培养成熟的植物乳杆菌MH-LP-126菌种接种至灭好菌的植物培养基质（PM）中，温度控制在37℃，密闭无氧发酵72小时。在发酵到第8小时开始流加谷氨酸钠溶液，溶液浓度3.5%w/v，流加速度20mL/h，总流加量250mL。
5.发酵结束后，迅速将高含γ-氨基丁酸的发酵物置于冷冻干燥机中进行低温冷冻干燥，至含水量≤8.0%。然后再进行粉碎，制成粉剂、压片、胶囊或添加于其它各种食品中。
实施例4 一种植物乳杆菌的培养方法
1.将燕麦、黑豆、小米、豌豆在一定条件下分别进行发芽，芽长不要超过种粒的25%。
2.称取竹叶30.0g，刺五加叶30.0g，加水300mL，加热煮沸，保持25min，趁热过滤除渣，得竹刺叶溶液。
3.将胡萝卜处理洗净，称取55.0g，切碎。另称取发芽燕麦50.0g、发芽黑豆40.0g、发芽小米25.0g、发芽豌豆15.0g和葡萄糖1.5g置于组织破碎机处理20min。然后，将竹刺叶溶液加入，再置于均质机中进行均质处理，即得到植物培养基质（PM），将植物培养基质（PM）进行105℃灭菌20min，冷却至35℃。
4.将培养成熟的植物乳杆菌MH-LP-126菌种接种至灭好菌的植物培养基质（PM）中，温度控制在37℃，密闭无氧发酵84小时。在发酵到第10小时开始加入谷氨酸钠溶液溶液浓度3.5%w/v，共配制250mL，以后每间隔3小时加入15.0mL，直至将250mL加完。
5.发酵结束后，迅速将高含γ-氨基丁酸的发酵物置于冷冻干燥机中进行低温冷冻干燥，至含水量≤8.0%。然后再进行粉碎，制成粉剂、压片、胶囊或添加于其它各种食品中。
实施例5 一种植物乳杆菌的培养方法
1.将燕麦、黑豆、小米、豌豆在一定条件下分别进行发芽，芽长不要超过种粒的25%。
2.称取竹叶40.0g，刺五加叶35.0g，加水400mL，加热煮沸，保持25min，趁热过滤除渣，得竹刺叶溶液。
3.将胡萝卜处理洗净，称取45.0g，切碎。另称取发芽燕麦40.0g、发芽黑豆50.0g、发芽小米25.0g、发芽豌豆20.0g和葡萄糖1.5g置于组织破碎机处理15min。然后，将竹刺叶溶液加入，再置于均质机中进行均质处理，即得到植物培养基质（PM），将植物培养基质（PM）进行105℃灭菌20min，冷却至35℃。
4.将培养成熟的植物乳杆菌MH-LP-126菌种接种至灭好菌的植物培养基质（PM）中，温度控制在37℃，密闭无氧发酵96小时。在发酵到第10小时开始加入谷氨酸钠溶液溶液浓度3.5%w/v，共配制400mL，以后每间隔3小时加入15.0mL，直至将400mL加完。
5.发酵结束后，迅速将高含γ-氨基丁酸的发酵物置于冷冻干燥机中进行低温冷冻干燥，至含水量≤8.0%。然后再进行粉碎，制成粉剂、压片、胶囊或添加于其它各种食品中。
以上实施例获得的发酵液中的GABA含量如下：
对比例
与现有技术中其他植物乳杆菌发酵产物对比：
Claims (15)
1.一种植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）MH-LP-126，其特征在于，保藏号为CGMCC No.24283，于2022年01月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.一种植物乳杆菌MH-LP-126制备物，其特征在于，通过权利要求1所述的植物乳杆菌MH-LP-126制备得到，所述的制备物为培养物和/或冻干粉；所述的培养物包括发酵液和/或发酵液沉淀。
3.一种植物乳杆菌MH-LP-126的培养方法，其特征在于，包括将权利要求1所述的植物乳杆菌MH-LP-126接种于培养基。
4.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述的培养基为发芽燕麦、发芽黑豆、发芽小米、发芽豌豆、胡萝卜、葡萄糖、谷氨酸钠、竹叶和刺五加叶的混合植物基质。
5.根据权利要求4所述的培养方法，其特征在于，所述的培养基中包括发芽燕麦20.0-60.0g、发芽黑豆5.0-60.0g、发芽小米5.0-60.0g、发芽豌豆5.0-60.0g、胡萝卜5.0-50.0g、葡萄糖0.5-5.0g、竹叶5.0-35.0g、刺五加叶5.0-35.0g和纯净水100.0-500.0mL。
6.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，培养温度为35-42℃，密闭无氧发酵。
7.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于，在发酵到第8-12小时开始流加谷氨酸钠溶液，溶液浓度0.5-6.0%w/v。
8.权利要求1所述的植物乳杆菌MH-LP-126和权利要求2所述的制备物中的一种或多种在制备食品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的应用为直接向食品中添加植物乳杆菌MH-LP-126或其制备物，或者通过植物乳杆菌MH-LP-126制备γ-氨基丁酸再添加至食品中。
10.权利要求1所述的植物乳杆菌MH-LP-126和权利要求2所述的制备物中的一种或多种在制备保健品中的应用。
11.权利要求1所述的植物乳杆菌MH-LP-126和权利要求2所述的制备物中的一种或多种在制备药品中的应用。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述的药品中包括γ-氨基丁酸；所述的药品为镇静催眠药、降压药和降脂药中的一种或多种。
13.包含权利要求1所述的植物乳杆菌MH-LP-126和权利要求2所述的制备物中的一种或多种的食品。
14.包含权利要求1所述的植物乳杆菌MH-LP-126和权利要求2所述的制备物中的一种或多种的保健品。
15.包含权利要求1所述的植物乳杆菌MH-LP-126和权利要求2所述的制备物中的一种或多种的药品。
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