CN115873743B - 一株高产尿囊素的发酵粘液乳杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株高产尿囊素的发酵粘液乳杆菌及其应用，属于微生物发酵技术领域。本发明的发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillus fermentum) LF‑1，已于2022年5月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2022658。本发明从黄酒发酵液中筛选出1株可以高产尿囊素的新型发酵粘液乳杆菌Limosilactobacillus fermentum，在MRS培养基中可发酵生成尿囊素，产量高达610.59 mg/L。将该菌株应用于黄酒酿造，可以将醪液中的尿酸转化为尿囊素，最终黄酒发酵液中尿囊素的含量可达1417.84mg/L，比对照组增加了50%以上，且黄酒的发酵周期缩短了40%。此外，黄酒发酵液中常规理化指标符合黄酒国标的要求。
Description
技术领域
本发明涉及一株高产尿囊素的发酵粘液乳杆菌及其应用，属于微生物发酵技术领域。
背景技术
尿囊素(allantoin)，亦称乙醛酰脲或 5-脲基乙内酰脲，尿囊素广泛存在于自然界，如尿囊液、蛆排池物及胎儿尿中，也有资料记载除去人和类人猿之外的所有哺乳动物的尿囊中皆有。在一些植物体中，如烟草粒、麦种、甜菜、药用倒提壶草、紫藤花以及紫草科中的雏菊根等亦有尿囊素，其中雏菊根的含量多达0.8%。天然尿囊素虽然广泛存在与自然界中，但数量有限。
尿囊素具有促进细胞生长、加快伤口愈合、杀菌止痛、调节植物生长等功效，广泛应用于医药行业、化妆品添加剂以及农业领域等。由于尿囊素的广泛应用，导致市场需求量增加，且当前天然尿囊素产量较低，因此无法满足市场需求。国外在四十年代开始用化学方法合成尿囊素，直到七十年代末日本和西德才实现工业化生产。目前尿囊素主要依靠化学合成方法制得，然而运用合成法制备尿囊素有产率低、废弃物污染等问题，实现大规模生产有一定的局限性。
尿囊素在部分动物体内的产生途径如：两栖类、鱼类等脊椎动物，由嘌呤碱基生成尿酸，在自身尿酸酶的作用下，氧化生成尿囊素后被排出体外。然而，由于人及其它灵长类哺乳动物体内没有尿酸酶，其排泄物是尿酸。因此，嘌呤代谢的最终产物是由不同的生物种类体内不同代谢阶段决定的。乳酸菌作为肠道固有有益菌群，在食品、保健品和药品等领域有着广泛的应用。近年来国内外对益生乳酸菌在辅助治疗高尿酸症（HUA）方面的研究越来越多，将高产尿囊素的乳酸菌进行降尿酸的应用，可以避免或减轻传统的严格饮食限制对HUA患者生活质量的影响。目前，日本明治株式会社、大冢制药株式会社已相继筛选到多株具有高效嘌呤核苷降解能力的乳酸菌，并利用动物实验验证其有效性，其中明治株式会社Lactobacillus gasseriPA-3产品已进入商业化应用。
发明内容
本发明的目的是提供了一株高产尿囊素的发酵粘液乳杆菌L. fermentum及其应用。所述发酵粘液乳杆菌L. fermentum能产尿囊素，并且能将尿酸高效转化为尿囊素。所述发酵粘液乳杆菌LF-1于2022年5月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2022658。
本发明提供了一株高产尿囊素的发酵粘液乳杆菌LF-1，已于2022年5月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2022658。
本发明还提供了一种微生物制剂，所述微生物制剂中含有上述发酵粘液乳杆菌LF-1。
在一种实施方式中，所述微生物制剂包括液态制剂或固态制剂。
在一种实施方式中，所述微生物制剂含有≥1×107CFU所述发酵粘液乳杆菌LF-1。
本发明还提供了上述发酵粘液乳杆菌LF-1，或上述微生物制剂在食品、医药、日用化学或农业领域中的应用。
本发明还提供了上述发酵粘液乳杆菌LF-1，或上述微生物制剂在制备含有尿囊素的产品中的应用。
在一种实施方式中，所述应用为在产品制备过程中添加发酵粘液乳杆菌LF-1和/或发酵粘液乳杆菌LF-1的发酵上清液。
在一种实施方式中，所述产品包括但不限于食品、皮肤外用药品、化妆品、肥料、饲料。
在一种实施方式中，所述食品包括但不限于发酵食品。
在一种实施方式中，所述发酵食品包括但不限于谷物发酵制品、豆类发酵制品和乳类发酵制品。
本发明还提供了一种生产尿囊素的方法，所述方法为将上述发酵粘液乳杆菌LF-1接种于培养基中进行发酵培养。
在一种实施方式中，所述发酵粘液乳杆菌LF-1的接种量至少为1×107cfu/mL。
在一种实施方式中，所述培养基为MRS培养基。
在一种实施方式中，所述MRS培养基的配方为5~15 g/L蛋白胨，5~15 g/L牛肉膏，2~8 g/L酵母粉，10~30 g/L葡萄糖，2~8 g/L乙酸钠，1~3 g/L柠檬酸铵，1~3 g/L磷酸氢二钾，0.5~1.5 mL/L吐温-80，0.5~0.6 g/L七水合硫酸镁，0.2~0.3 g/L一水合硫酸锰。
在一种实施方式中，所述发酵培养的条件为35~38℃培养至少24 h。
本发明提供了一种高尿囊素黄酒的制备方法，所述方法为将上述发酵粘液乳杆菌LF-1或上述益生菌制剂活化扩大培养后，制备菌液，按0.1%～1%（v/v）的比例与酒母、水、糯米、麦曲原料混匀后落罐，进行发酵。
在一种实施方式中，所述菌液的浓度为1×107cfu/mL。
在一种实施方式中，将发酵粘液乳杆菌LF-1接种至活化培养基活化12-16 h，接种到500 mL发酵罐进行发酵，培养温度37℃，pH 6.02，培养时间24 h，经4℃，8000 r/min，离心8 min制备菌液(1×107cfu/mL)。在不改变其它工艺的情况下，将菌液(1×107cfu/mL)应用于黄酒酿造，开始落罐后以0.1~1%（v/v）的比例与酒母、水、糯米、麦曲原料混匀后，进行发酵。
有益效果：
本发明的发酵粘液乳杆菌L. fermentum在MRS液体培养基中产尿囊素的含量高达610.59 mg/L，并且耐受11%以下（v/v）的酒精。在加入尿酸的无菌水中，发酵粘液乳杆菌LF-1对尿酸的转化率达93.74%，将尿酸转化为尿囊素，尿囊素含量为254.45 mg/L。进行黄酒酿造，相比不添加发酵粘液乳杆菌L. fermentum进行黄酒酿造优越之处在于，在保持黄酒风味的基础上，黄酒发酵液中尿酸的转化转化率达100%。当发酵后期结束时，相比没有加入发酵粘液乳杆菌L. fermentum的黄酒发酵液，接种了发酵粘液乳杆菌L. fermentum的醪液中尿囊素的含量升高了710.05 mg/L，且黄酒的发酵周期缩短了40%。此外，发酵粘液乳杆菌L. fermentum分离于黄酒发酵醪液，属于《可用于食品的菌种名单》，属于食品安全的乳酸菌。
生物材料保藏：
发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillus fermentum) LF-1，于2022年5月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2022658。
附图说明
图1 发酵粘液乳杆菌L. fermentum在MRS液体培养基中培养时菌体的生长曲线。
图2发酵粘液乳杆菌在黄酒发酵过程中酒精耐受性。
图3 实验组加入发酵粘液乳杆菌L. fermentum与对照组不加乳酸菌（传统黄酒）时尿酸与尿囊素含量的变化。
具体实施方式
本发明提供一株高产尿囊素的发酵粘液乳杆菌L. fermentum及其应用，下面结合具体实施例对本发明进一步详细说明。
原料说明：
本发明发酵粘液乳杆菌L. fermentum菌株分离于黄酒浸米水与发酵液中；分别将发酵粘液乳杆菌Limosilactobacillus fermentumLF-1命名为LF-1，发酵粘液乳杆菌Lactobacillus fermentum strainLG1命名为LG1，乳杆菌Lactobacillus sp.KLDS 1.0714命名为KLDS，发酵粘液乳杆菌Lactobacillus fermentum culture-collectionIMAU:80800命名为IMAU均来源于黄酒发酵液；糯米为市售圆糯米；生麦曲与熟麦曲以及黄酒发酵液均来自于古越龙山绍兴酒股份有限公司；N85酿酒酵母来自于本实验室储存；尿酸和尿囊素购自阿拉丁试剂官网。
本发明涉及的检测方法如下：
总酸、总糖、酒精度、氨基酸态氮：检测方法见GB/T13662-2018黄酒分析方法。
高效液相色谱法测定嘌呤含量参照：李慧慧，王明力，卢义龙. 盐析-吸附法去除豆浆中嘌呤物质的探究[J]. 食品科技，2015 (7): 90-93.
下述实施例中涉及的培养基如下：
MRS液体培养基（g/L）：10g/L蛋白胨，10g/L牛肉膏，5g/L酵母粉，20g/L葡萄糖，5g/L乙酸钠，2g/L柠檬酸铵，2g/L磷酸氢二钾，1mL/L吐温-80，0.58g/L七水合硫酸镁，0.25g/L一水合硫酸锰。
MRS固体培养基（g/L）：10g/L蛋白胨，10g/L牛肉膏，5g/L酵母粉，20g/L葡萄糖，5g/L乙酸钠，2g/L柠檬酸铵，2g/L磷酸氢二钾，1mL/L吐温-80，0.58g/L七水合硫酸镁，0.25g/L一水合硫酸锰，20 g/L琼脂。
CaCO3-MRS固体培养基（g/L）：10g/L蛋白胨，10g/L牛肉膏，5g/L酵母粉，20g/L葡萄糖，5g/L乙酸钠，2g/L柠檬酸铵，2g/L磷酸氢二钾，1mL/L吐温-80，0.58g/L七水合硫酸镁，0.25g/L一水合硫酸锰，10g/L碳酸钙，20 g/L琼脂。
实施例1 发酵粘液乳杆菌LF-1筛选与鉴定方法：
分别取若干黄酒发酵液加5 mL生理盐水，充分摇匀，将其再依次稀释到10-7。涂布碳酸钙MRS平板，置于厌氧罐中37℃培养48~96 h，挑取单菌落接种至MRS液体培养基，培养24 h，镜检确定菌株形态后，提取基因组进行16S rDNA鉴定。
用Ezup株式细菌基因组提取试剂盒(上海生工)提取该菌的基因组，以基因组为模板，以细菌16S rDNA通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R (5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)进行PCR，扩增16S rDNA基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，并送至上海天霖生物公司测序，将序列与NCBI已有序列比对，确定该菌为发酵粘液乳杆菌Limosilactobacillus fermentum(序列相似度为99％)，将其命名为LF-1。
发酵粘液乳杆菌LF-1为革兰氏阳性菌，杆状，部分细胞聚集形成短链，过氧化氢酶检测为接触酶阴性，运动型的试验证明无运动性，不还原硝酸盐，不会液化明胶，可利用阿拉伯糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖麦芽糖、蜜二糖、蔗糖、木糖等8种糖类，可产生乳酸。其形态学特征：在MRS固体培养基中其菌落为圆形，且边缘整齐，呈不透明的乳白色，表面湿润光滑且不产色素。
将发酵粘液乳杆菌LF-1接种于MRS液体培养基37℃培养80 h，培养期间吸取一定的培养基测定发酵粘液乳杆菌LF-1的菌浓，生长曲线如图1所示。
实施例2产尿囊素乳酸菌能力的检测
尿囊素检测方法参考文献（黄久遂，蔡素芬，黎丽欣. 尿囊素乳膏中尿囊素的含量测定 [J].今日药学, 2016, 26 (05): 340-341.）。将MRS培养基中活化的发酵粘液乳杆菌LF-1按2％（v/v）接种量接种到MRS液体培养基中，37℃厌氧静置培养12-16 h，然后连续传代2次，离心获得菌体。按2%（v/v）的接种量将菌体接种于装有10 mL MRS液体培养基中的三角瓶中，设置实验组和对照组，其中，一份MRS液体培养基，作为对照组；另一份加入200 μL（OD600=1.398）二级活化后的菌体，作为实验组。在培养箱37°C静置培养24 h，取2 mL培养液，于4℃，8000 r/min，离心8 min收集上清液，利用HPLC分别检测两者尿囊素的含量。同时运用此方法对不同乳酸菌进行产尿囊素能力检测，具体情况如下表1。
表1 不同菌株产尿囊素的含量
由表1可知，不同菌株产尿囊素的能力差异显著，其中发酵粘液乳杆菌LF-1在MRS液体培养基中的尿囊素生成量最高，达610.59 mg/L。
实施例3 发酵粘液乳杆菌LF-1耐酒精能力的检测
选取菌株产尿囊素能力最强的发酵粘液乳杆菌LF-1进行乳酸菌酒精耐受性试验，将发酵粘液乳杆菌株LF-1进行二次活化（37℃，12 h），按2%（v/v）的接种量接种至酒精度为0、5、8、11、14%（v/v）的MRS培养基中，30℃静置培养，定时测定OD600检测其生长情况。结果显示该菌株能耐受11%以下（v/v）的酒精（图2）。
实施例4 发酵粘液乳杆菌LF-1降尿酸能力的检测
尿酸检测方法参考文献（Tsuboi H, Kaneko N, Satou A, et al., Lactic acidbacteria having action of lowering blood uric level: CA2851018[P] 2017-10-03.）：尿囊素检测方法参考案例2。
将MRS培养基中活化的发酵粘液乳杆菌LF-1按2％（v/v）接种量接种到MRS液体培养基中，37℃厌氧静置培养12-16 h，然后连续传代2次。按2%（v/v）的接种量接种于装有10mL MRS液体培养基中的三角瓶中，静置培养24 h，设置实验组和对照组，取2份2 mL（OD600=1.398）培养液于4℃，8000r/min，离心8 min收集菌体。经灭菌后的无菌水洗涤2~3次，向清洗后的菌体中加入500 μL的尿酸（1 g/L）与500 μL的无菌水作为实验组；另一份加入1 mL的无菌水作为对照组，重悬菌体后置于恒温培养箱（37℃静置培养）反应24 h。随后迅速将反应液置于沸水浴中5 min，终止反应。8000 r/min离心8 min，除去菌体，收集上清液。用HPLC分别检测两者尿囊素的含量。结果发现对照组未检测出尿酸与尿囊素，而实验组中的尿酸含量从500 mg/L将至31.26 mg/L，且生成254.45 mg/L的尿囊素。
以上结果说明本发明所用的发酵粘液乳杆菌不仅能高效合成尿囊素，还能将尿酸转化为尿囊素，有效减少机体内尿酸的形成和积累。因此，将此菌株应用于黄酒发酵，进一步减少黄酒中尿酸的含量。
实施例5 不添加发酵粘液乳杆菌LF-1黄酒酿造
黄酒酿造工艺流程：浸米-蒸饭-冷却-拌曲-落罐-前酵-后酵-过滤澄清-煎酒。
浸米：取适量糯米，加水浸过米层10 cm，28℃浸泡2天。
蒸饭：浸泡后的糯米进行常压蒸煮，大量蒸汽冒出后维持25 min。
冷却：将蒸熟的糯米置于通风摊凉至室温。
拌曲：按照13 g生麦曲、4 g熟麦曲每100 g糯米的比例添加麦曲，并摊拌均匀。
落罐：将拌好的糯米和麦曲、水(170 mL/100 g糯米)、酵母种子液(10%v/v)一起加入发酵罐，混合均匀。
前酵：30℃发酵4-7天。
后酵：15℃发酵15天左右。
过滤：澄清。
煎酒：将玻璃瓶置于80℃水浴锅中，加热30 min。
实验室传统发酵前酵是10天，运用HPLC法检测不添加乳酸菌黄酒中尿酸与尿囊素的含量分别为164.4mg/L和707.34mg/L，黄酒国标如下表2。
表2 实验室传统黄酒发酵的国标检测
实施例6 发酵粘液乳杆菌LF-1在黄酒酿造中的应用
将实施例2筛选到的发酵粘液乳杆菌LF-1接种至活化培养基MRS (pH6.02)，37℃活化培养12-16 h后，将种子液接种到500 mL三角瓶中，加发酵栓后于37℃培养24 h。然后通过4℃，8000 r/min，离心8 min制备菌液(1×107cfu/mL)。进行黄酒酿造时，在不改变其它工艺的情况下，落罐时将菌液以0.1%~1%（v/v）的比例与酒母、水、糯米、麦曲原料混匀后，进行发酵。加入发酵粘液乳杆菌后LF-1，实验室黄酒发酵的前酵是6天。运用HPLC法检测加入发酵粘液乳杆菌LF-1黄酒中的尿酸与尿囊素的含量分别为0 mg/L和1417.84 mg/L（如图3所示）。与实施例5中未加入发酵粘液乳杆菌LF-1的传统黄酒相比，该黄酒中的尿酸完全降解并转化为尿囊素，且尿囊素的含量增加了50%以上，且缩短了发酵周期，加入发酵粘液乳杆菌LF-1的黄酒国标如下表3。
表3 实验室加发酵粘液乳杆菌黄酒发酵的国标检测
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (6)
1.发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillus fermentum)LF-1在制备含有尿囊素的产品中的应用；所述发酵粘液乳杆菌LF-1已于2022年5月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2022658。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为在产品制备过程中添加发酵粘液乳杆菌LF-1。
3.一种生产尿囊素的方法，其特征在于，所述方法为将发酵粘液乳杆菌LF-1接种于培养基中进行发酵培养；所述发酵粘液乳杆菌LF-1已于2022年5月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2022658。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述培养基为MRS培养基。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述MRS培养基的配方为5~15 g/L蛋白胨，5~15 g/L牛肉膏，2~8 g/L酵母粉，10~30 g/L葡萄糖，2~8 g/L乙酸钠，1~3 g/L柠檬酸铵，1~3 g/L磷酸氢二钾，0.5~1.5 mL/L吐温-80，0.5~0.6 g/L七水合硫酸镁，0.2~0.3 g/L一水合硫酸锰。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的条件为35~38℃培养至少24 h。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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