CN115725437B

CN115725437B - 一株高效利用嘌呤的发酵粘液乳杆菌及其在黄酒酿造中的应用

Info

Publication number: CN115725437B
Application number: CN202210863188.7A
Authority: CN
Inventors: 陆健; 王湘林; 吴殿辉
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2022-07-20
Filing date: 2022-07-20
Publication date: 2024-04-30
Anticipated expiration: 2042-07-20
Also published as: CN115725437A

Abstract

本发明公开了一株高效利用嘌呤的发酵粘液乳杆菌及其在黄酒酿造中的应用，属于微生物发酵技术领域。本发明的发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillus fermentum)LF‑1，已于2022年5月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉大学，保藏编号为CCTCCNO：M 2022658。本发明从黄酒发酵液中筛选出1株可以高效降解嘌呤的新型发酵粘液乳杆菌Limosilactobacillus fermentum，将该菌株应用于黄酒酿造，缩短了黄酒的发酵周期并降低了黄酒发酵液中68.48％的嘌呤含量，且发酵粘液乳杆菌LF‑1可以实现对腺苷、鸟苷、肌苷和尿酸的降解。

Description

一株高效利用嘌呤的发酵粘液乳杆菌及其在黄酒酿造中的应用

技术领域

本发明涉及一株高效利用嘌呤的发酵粘液乳杆菌及其在黄酒酿造中的应用，属于微生物发酵技术领域。

背景技术

高尿酸血症(Hyperuricemia,HUA)是因嘌呤代谢或排泄失常而导致血尿酸含量显著超过正常范围的慢性临床综合征。HUA不仅是痛风病症发生的生化基础，而且也与糖尿病、心脑血管疾病及尿酸盐肾病等慢性肾病的发生密切相关，严重威胁人类健康。

目前，HUA的防治主要采用药物控制和限制人体嘌呤物质的摄入量。HUA治疗药物虽然有效但副作用大，在临床治疗上的应用受到一定限制。对于饮食限制来说，由于高嘌呤食物众多，严格限制饮食会降低患者生活质量，且难以长期坚持，不能达到预期的效果。有研究表明酒是痛风的最相关独立因素，尤其是啤酒、黄酒等。如日本研究人员对啤酒与嘌呤碱基的代谢影响进行了研究，发现酒中的核酸尤其是嘌呤碱与痛风的形成有直接关系。目前黄酒的饮用者大都是中老年人，其新陈代谢相对较慢，同时促进尿酸合成的酶和抑制尿酸合成的酶两者之间的平衡易被破坏。如果摄入的嘌呤碱含量较高，将会极大影响其体内尿酸水平并最终引发痛风，对降低黄酒中嘌呤含量研究可为补充完善我国食物成分数据库提供数据，为痛风等嘌呤代谢障碍性疾病患者的健康饮酒提供参考。

乳酸菌作为肠道固有有益菌群，在食品、保健品和药品等领域有着广泛的应用。近年来国内外对益生乳酸菌在辅助治疗HUA方面的研究越来越多，如日本明治乳业株式会社的研究表明，格氏乳杆菌PA-3能够胞外降解核苷，吸收核苷进入胞内，降低肠道对核苷类物质的吸收，达到降低血尿酸的效果。应用乳酸菌对HUA进行防治可以避免或减轻传统的严格饮食限制对患者生活质量的影响。目前，日本明治株式会社、大冢制药株式会社已相继筛选到多株具有高效嘌呤核苷降解能力的乳酸菌，并利用动物实验验证其有效性，其中明治株式会社Lactobacillus gasseri PA-3产品已进入商业化应用，而我国在该领域研究尚在起步阶段。

因此，本发明的意义在于从黄酒发酵液中筛选得到一株能够高效吸收利用嘌呤的发酵粘液乳杆菌，并将其应用于黄酒酿造中，从而能够高效吸收并利用发酵液中的嘌呤，减少尿酸的形成，提高黄酒的饮用安全性，以期为研发具有自主知识产权的低嘌呤黄酒奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供了一株能高效吸收利用嘌呤的发酵粘液乳杆菌L.fermentum。所述发酵粘液乳杆菌L.fermentum能高效降解黄酒中的嘌呤。所述发酵粘液乳杆菌LF-1于2022年5月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2022658。

本发明提供了一株高效吸收利用嘌呤的发酵粘液乳杆菌LF-1，已于2022年5月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2022658。

本发明还提供了一种用于降解嘌呤的益生菌制剂，所述益生菌制剂中含有上述发酵粘液乳杆菌LF-1。

在一种实施方式中，所述益生菌制剂包括液态制剂或固态制剂。

在一种实施方式中，所述益生菌制剂含有≥1×10⁷CFU所述发酵粘液乳杆菌LF-1。

本发明还提供了上述发酵粘液乳杆菌LF-1，或上述益生菌制剂在降解嘌呤方面的应用，所述应用不涉及疾病的诊断或治疗。

本发明还提供了上述发酵粘液乳杆菌LF-1，或上述益生菌制剂在制备食品或药品中的应用。

在一种实施方式中，所述应用为在食品制备过程中添加上述发酵粘液乳杆菌LF-1，或上述益生菌制剂。

在一种实施方式中，所述食品包括乳制品、酒类、饮料类或水产制品。

在一种实施方式中，所述食品包括发酵食品。

在一种实施方式中，所述发酵食品包括但不限于发酵鱼、发酵泡菜、发酵肉制品。

本发明提供了一种低嘌呤黄酒的制备方法，所述方法为将上述发酵粘液乳杆菌LF-1或上述益生菌制剂活化扩大培养后，制备菌液，按0.1％～1％(v/v)的比例与酒母、水、糯米、麦曲原料混匀后落罐，进行发酵。

在一种实施方式中，所述菌液的浓度为1×10⁷cfu/mL。

本发明的一种实施方式中，将发酵粘液乳杆菌LF-1接种至活化培养基活化12-16h，接种到500mL发酵罐进行发酵，培养温度37℃，pH 6.02，培养时间24h，经4℃，8000r/min，离心8min制备菌液(1×10⁷cfu/mL)。在不改变其它工艺的情况下，将菌液(1×10⁷cfu/mL)应用于黄酒酿造，开始落罐后以0.1～1％(v/v)的比例与酒母、水、糯米、麦曲原料混匀后，进行发酵。

有益效果：

本发明的发酵粘液乳杆菌L.fermentum进行黄酒酿造，相比不添加发酵粘液乳杆菌L.fermentum进行黄酒酿造优越之处在于，在保持黄酒风味的基础上，显著降低黄酒发酵液中嘌呤的含量，当发酵后期结束时，相比没有加入发酵粘液乳杆菌L.fermentum的黄酒发酵液，接种了发酵粘液乳杆菌L.fermentum的醪液中嘌呤类物质的含量降低了68.48％。发酵粘液乳杆菌LF-1对腺苷、鸟苷和肌苷的降解率分别为98.41％、83.39％、97.35％，并且发酵粘液乳杆菌LF-1对尿酸的降解率达到93.74％，将尿酸降解为尿囊素，含量可达254.45mg/L。此外，发酵粘液乳杆菌L.fermentum分离于黄酒发酵醪液，属于《可用于食品的菌种名单》，属于食品安全的乳酸菌。

生物材料保藏：

发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillus fermentum)LF-1，于2022年5月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2022658。

附图说明

图1发酵粘液乳杆菌L.fermentum在MRS液体培养基中培养时菌体的生长曲线。

图2分别加入发酵粘液乳杆菌L.fermentum、鼠李糖乳杆菌Lactobacillusrhamnos、植物乳杆菌Lactiplantibacillus plantarum与对照组不加乳酸菌(传统黄酒)时嘌呤含量的变化。

图3发酵粘液乳杆菌在黄酒发酵过程中酒精耐受性。

具体实施方式

本发明提供一株能高效吸收利用嘌呤的发酵粘液乳杆菌L.fermentum及其应用，下面结合具体实施例对本发明进一步详细说明。

原料说明：

本发明发酵粘液乳杆菌L.fermentum菌株、鼠李糖杆菌Lactobacillus rhamnos命名为LR-20S、植物乳杆菌Lactiplantibacillus plantarum命名为2J-6、均分离于黄酒浸米水与发酵液中；糯米为市售圆糯米；生麦曲与熟麦曲以及黄酒发酵液均来自于古越龙山绍兴酒股份有限公司；N85酿酒酵母来自于本实验室储存；腺嘌呤和黄嘌呤购自阿拉丁试剂官网，鸟嘌呤和次黄嘌呤购自上海泰坦科技有限公司。

本发明涉及的检测方法如下：

总酸、总糖、酒精度、氨基酸态氮：检测方法见GB/T13662-2018黄酒分析方法。

高效液相色谱法测定嘌呤含量参照：李慧慧，王明力，卢义龙.盐析-吸附法去除豆浆中嘌呤物质的探究[J].食品科技，2015(7):90-93.

下述实施例中涉及的培养基如下：

MRS液体培养基(g/L)：10g/L蛋白胨，10g/L牛肉膏，5g/L酵母粉，20g/L葡萄糖，5g/L乙酸钠，2g/L柠檬酸铵，2g/L磷酸氢二钾，1mL/L吐温-80，0.58g/L七水合硫酸镁，0.25g/L一水合硫酸锰。

MRS固体培养基(g/L)：10g/L蛋白胨，10g/L牛肉膏，5g/L酵母粉，20g/L葡萄糖，5g/L乙酸钠，2g/L柠檬酸铵，2g/L磷酸氢二钾，1mL/L吐温-80，0.58g/L七水合硫酸镁，0.25g/L一水合硫酸锰，20g/L琼脂。

CaCO₃-MRS固体培养基(g/L)：10g/L蛋白胨，10g/L牛肉膏，5g/L酵母粉，20g/L葡萄糖，5g/L乙酸钠，2g/L柠檬酸铵，2g/L磷酸氢二钾，1mL/L吐温-80，0.58g/L七水合硫酸镁，0.25g/L一水合硫酸锰，10g/L碳酸钙，20g/L琼脂。

实施例1发酵粘液乳杆菌L.fermentum筛选与鉴定

分别取若干黄酒发酵液加5mL生理盐水，充分摇匀，将其再依次稀释到10^-7。涂布碳酸钙MRS平板，置于发酵罐中37℃培养48～96h，挑取单菌落接种至MRS液体培养基，培养24h，镜检确定菌株形态后，提取基因组进行16S rDNA鉴定。具体情况如下：

用Ezup株式细菌基因组提取试剂盒(上海生工)提取该菌的基因组，以基因组为模板，以细菌16S rDNA通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)为引物来进行PCR，扩增16S rDNA基因(核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示)，并送至上海天霖生物公司测序，将序列与NCBI已有序列比对，确定该菌为发酵粘液乳杆菌L.fermentum(序列相似度为99％)，将其命名为LF-1。

发酵粘液乳杆菌L.fermentum(LF-1)为革兰氏阳性菌，杆状，部分细胞聚集形成短链，过氧化氢酶检测为接触酶阴性，运动型的试验证明无运动性，不还原硝酸盐，不会液化明胶，可利用阿拉伯糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖麦芽糖、蜜二糖、蔗糖、木糖等8种糖类，可产生乳酸。其形态学特征：在MRS固体培养基中其菌落为圆形，且边缘整齐，呈不透明的乳白色，表面湿润光滑且不产色素。

将发酵粘液乳杆菌L.fermentum(LF-1)接种于MRS液体培养基37℃培养80h，培养期间吸取一定的培养基测定发酵粘液乳杆菌LF-1的菌浓(图1)。

实施例2发酵粘液乳杆菌LF-1嘌呤利用能力的检测

从黄酒发酵液中筛选出22株降嘌呤乳酸菌菌株，随机从22株乳酸菌选取3株进行黄酒酿造，并检测传统发酵黄酒与加入不同乳酸菌后发酵黄酒的嘌呤含量。

嘌呤筛选方法参考文献(Tsuboi H,Kaneko N,Satou A,et al.,Lactic acidbacteria having action of lowering blood uric level:CA2851018[P]2017-10-03.)：将MRS培养基中活化的发酵粘液乳杆菌LF-1按2％(v/v)接种量接种到MRS液体培养基中，37℃厌氧静置培养12-16h，然后连续传代2次。将乳酸菌经二级活化后，按2％(v/v)的接种量接种于装有10mL MRS液体培养基中的三角瓶中，设置实验组和对照组，其中，一份加入浓度为1g/L的四种嘌呤各100μL，作为实验组；另一份加入400μL的无菌水，作为对照组。在培养箱37℃静置培养24h，取2mL培养液，于4℃，8000r/min，离心8min收集上清液，用HPLC分别检测两者嘌呤的含量。同时运用此方法对不同乳酸菌进行降嘌呤能力检测，具体情况如下表1。

嘌呤降解率计算公式＝[1-(C₁-C₂)/40]×100％

(C₁：实验组培养24h后培养液中嘌呤的浓度；C₂：对照组培养24h后培养液中嘌呤的浓度；40：实验组中实际加入嘌呤标准品的浓度，即40mg/L)。

表1不同菌株的嘌呤降解率

由表1可知，不同菌株降解嘌呤的能力差异显著，其中发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillus fermentum LF-1)在MRS培养基中的嘌呤平均降解率较高为87.72％，鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnos LR-20S)腺嘌呤的降解率为79.92％，而嘌呤的平均降解率30.76％。植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum 2J-6)的鸟嘌呤降解率为71.21％，而嘌呤的平均降解率为49.61％。即选择1株嘌呤平均降解能力最高的乳酸菌进行黄酒发酵，并随机选择2株嘌呤平均降解能力＜60％的作为对比进行黄酒发酵实验。因此，选择这三株菌应用于黄酒发酵，进一步探究不同嘌呤降解能力的菌株对黄酒中嘌呤含量的影响(图2)。

实施例3发酵粘液乳杆菌LF-1降解嘌呤前体物质和尿酸能力的检测

利用HPLC测定实施例2中筛选到的三株乳酸菌对腺苷、鸟苷、肌苷和尿酸的降解能力，结果如下表：

表2不同菌株的腺苷、鸟苷、肌苷和尿酸的降解率

由表2可知，本发明中的发酵粘液乳杆菌LF-1可以实现针对腺苷、鸟苷、肌苷降解率达到80％以上，同时尿酸降解率最高达到93.74％。

实施例4发酵粘液乳杆菌LF-1耐酒精能力的检测

选取菌株嘌呤降解能力最强的发酵粘液乳杆菌LF-1进行乳酸菌酒精耐受性试验，将发酵粘液乳杆菌株LF-1进行二次活化(37℃，12h)，按2％(v/v)的接种量接种至酒精度为0、5、8、11、14％(v/v)的MRS培养基中，30℃静置培养，定时测定OD₆₀₀检测其生长情况。具体情况如下图3。结果显示该菌株能耐受11％以下(v/v)的酒精(图3)。

实施例5发酵粘液乳杆菌LF-1产尿囊素能力的检测

尿囊素检测方法参考文献(黄久遂，蔡素芬，黎丽欣.尿囊素乳膏中尿囊素的含量测定[J].今日药学,2016,26(05):340-341.)将MRS培养基中活化的发酵粘液乳杆菌LF-1按2％(v/v)接种量接种到MRS液体培养基中，37℃厌氧静置培养12-16h，然后连续传代2次。将乳酸菌经二级活化后，按2％(v/v)的接种量接种于装有10mL MRS液体培养基中的三角瓶中，静置培养24h，设置实验组和对照组，取2份2mL培养液于4℃，8000r/min，离心8min收集适量菌体。经灭菌后的无菌水洗涤2～3次，向清洗后的菌体中加入500μL的尿酸(1g/L)与500μL的无菌水作为实验组；另一份加入1mL的无菌水作为对照组，重悬菌体后置于恒温培养箱(37℃静置培养)反应24h。随后迅速将反应液置于沸水浴中5min，终止反应。8000r/min离心8min，除去菌体，收集上清液。用HPLC分别检测两者尿囊素的含量。结果发现对照组未检测出尿囊素，而实验组检测出尿囊素含量为254.45mg/L。

本发明所用的发酵粘液乳杆菌能将腺苷、鸟苷和肌苷转化为腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤和黄嘌呤，菌株通过嘌呤代谢可将嘌呤类物质最终转化为尿酸，并最终将尿酸转化为尿囊素，有效减少机体内尿酸的形成和积累。

实施例6不添加发酵粘液乳杆菌LF-1黄酒酿造

黄酒酿造工艺流程：浸米-蒸饭-冷却-拌曲-落罐-前酵-后酵-过滤澄清-煎酒。

浸米：取适量糯米，加水浸过米层10cm，28℃浸泡2天。

蒸饭：浸泡后的糯米进行常压蒸煮，大量蒸汽冒出后维持25min。

冷却：将蒸熟的糯米置于通风摊凉至室温。

拌曲：按照13g生麦曲、4g熟麦曲每100g糯米的比例添加麦曲，并摊拌均匀。

落罐：将拌好的糯米和麦曲、水(170mL/100g糯米)、酵母种子液(10％v/v)一起加入发酵罐，混合均匀。

前酵：30℃发酵4-7天。

后酵：15℃发酵15天左右。

过滤：澄清。

煎酒：将玻璃瓶置于80℃水浴锅中，加热30min。

运用HPLC法检测不添加乳酸菌黄酒中嘌呤的含量为341.56mg/L。

实施例7发酵粘液乳杆菌LF-1在黄酒酿造中的应用

将实施例2筛选到的发酵粘液乳杆菌LF-1接种至活化培养基MRS(pH6.02)，37℃活化培养12-16h后，将种子液接种到500mL发酵罐进行发酵，培养温度37℃，培养时间24h，经4℃，8000r/min，离心8min制备菌液(1×10⁷cfu/mL)。进行黄酒酿造时，在不改变其它工艺的情况下，落罐时将菌液以0.1％～1％(v/v)的比例与酒母、水、糯米、麦曲原料混匀后，进行发酵。运用HPLC法检测加入发酵粘液乳杆菌LF-1黄酒中的嘌呤含量为107.24mg/L(如图2所示)。与实施例3中未加入发酵粘液乳杆菌LF-1的传统黄酒相比，该黄酒的嘌呤含量降低了68.48％。

实施例8鼠李糖乳杆菌LR-20S在黄酒酿造中的应用

将鼠李糖乳杆菌LR-20S接种至活化培养基MRS(pH6.02)，37℃活化培养12-16h后，将种子液接种到500mL发酵罐进行发酵，培养温度37℃，培养时间24h，经4℃，8000r/min，离心8min制备菌液(1×10⁷cfu/mL)。进行黄酒酿造时，在不改变其它工艺的情况下，落罐时将菌液以0.1％～1％(v/v)的比例与酒母、水、糯米、麦曲原料混匀后，进行发酵。如图2运用HPLC法检测加入鼠李糖乳杆菌LR-20S黄酒中嘌呤的含量为272.18mg/L。与实施例3中未加入鼠李糖乳杆菌LR-20S的传统黄酒相比，该黄酒的嘌呤含量降低了23.59％。

实施例9植物乳杆菌2J-6在黄酒酿造中的应用

将植物乳杆菌2J-6接种至活化培养基MRS(pH6.02)，37℃活化培养12-16h后，将种子液接种到500mL发酵罐进行发酵，培养温度37℃，培养时间24h，经4℃，8000r/min，离心8min制备菌液(1×10⁷cfu/mL)。进行黄酒酿造时，在不改变其它工艺的情况下，落罐时将菌液以0.1％～1％(v/v)的比例与酒母、水、糯米、麦曲原料混匀后，进行发酵。如图2运用HPLC法检测加入植物乳杆菌黄酒中嘌呤的含量为278.23mg/L。与实施例3中未加入植物乳杆菌2J-6的传统黄酒相比，该黄酒的嘌呤含量降低了18.54％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一株发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillus fermentum)LF-1，已于2022年5月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2022658。

2.一种用于降解嘌呤的益生菌制剂，其特征在于，所述益生菌制剂中含有权利要求1所述的发酵粘液乳杆菌LF-1。

3.权利要求2所述的益生菌制剂含有≥1×10⁷ CFU的发酵粘液乳杆菌LF-1。

4.权利要求1所述的发酵粘液乳杆菌LF-1或权利要求2或3所述的益生菌制剂在降解嘌呤方面的应用，所述应用不涉及疾病的诊断或治疗。

5.权利要求1所述的发酵粘液乳杆菌LF-1或权利要求2或3所述的益生菌制剂在制备食品中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，在食品制备过程中添加权利要求1所述的发酵粘液乳杆菌LF-1，或权利要求2或3所述的益生菌制剂。

7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述食品为乳制品、饮料类或水产制品。

8.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述食品为酒类。

9.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述食品为发酵食品。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述发酵食品为发酵泡菜或发酵肉制品。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述发酵肉制品为发酵鱼。

12.一种低嘌呤黄酒的制备方法，其特征在于，所述方法为将权利要求1所述的发酵粘液乳杆菌LF-1或权利要求2或3所述的益生菌制剂活化扩大培养后，制备菌液，按体积比0.1%～1%的比例与酒母、水、糯米和麦曲原料混匀后落罐，进行发酵。