CN111944711A - 一种能够降解嘌呤核苷的短乳杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种能够降解嘌呤核苷的短乳杆菌及其应用。本发明筛选获得了一株短乳杆菌，命名为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)，株号ZJUNIT05，保藏号为CGMCC No.18445，该菌株具有高效降解嘌呤核苷的能力，同时可以耐受人体通常条件下的酸性环境和胆盐浓度，可以在肠道内分解摄入食物中的嘌呤核苷，从而减少小肠对嘌呤核苷的吸收。因此短乳杆菌(Lactobacillus brevis)ZJUNIT05是开发辅助治疗高尿酸血症的微生物菌剂或药物的良好菌株。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种能够降解嘌呤核苷的短乳杆菌及其应用。
背景技术
高尿酸血症是由于人体内嘌呤代谢紊乱，尿酸生成过多或尿酸排泄减少，继而导致血液中尿酸含量超出正常水平的代谢性疾病，现代医学研究发现，高尿酸血症与痛风、高血压、高脂血症、动脉粥样硬化、肥胖、胰岛素抵抗等疾病的发生密切相关。虽然高尿酸血症与基因、环境、性别、年龄及生活饮食习惯等因素都有关，发病原因较为复杂，但是随着人们物质生活的丰富和饮食结构的变化，高尿酸血症及其相关病症发病率在我国快速增加，已成为现代人的高发疾病之一。
目前高尿酸血症的治疗主要是通过服用药物和饮食限制。主要是服用降尿酸药物，如别嘌呤醇、丙磺舒、苯溴马隆等通过抑制尿酸生成或促进尿酸排泄以达到降血尿酸水平的目的，同时辅以饮食理疗，限制摄入高嘌呤食物。药物治疗存在过敏以及个体差异限制等问题。而高嘌呤食物种类众多，如红肉、肝肾胰等内脏、鱼类、禽类、啤酒等。另外，鲜味剂中的鸡精、蚝油、鱼露等的主要成分为5’-呈味核苷二钠的嘌呤类。饮食限制也就意味着改变生活方式，患者几乎难以长时间遵循严格的饮食控制，其生活质量将受到严重的影响。
随着对乳酸菌人体益生作用以及其较小的副作用研究的深入，乳酸菌对疾病的辅助治疗功效越来越受到关注与重视，人体吸收嘌呤的主要形式是嘌呤核苷酸，通过口服具有高效分解嘌呤核苷的微生态菌剂，让其在肠道内分解摄入食物中的嘌呤核苷，可以降低肠道对嘌呤核苷的吸收量，从而达到降低血尿酸水平的目的。因此，用乳酸菌对高尿酸血症进行辅助治疗和预防可以避免或减轻严格饮食限制对患者正常生活的影响。开发辅助治疗高尿酸血症的微生态菌剂的关键就是获得具有高效降解嘌呤核苷的食品安全级微生物。
公开号为CN110684685A的发明申请公开了一种发酵乳杆菌Lactobacillusfermentum 9-4菌株，保藏号为CCTCC NO：M 2019619，其具有降解嘌呤的能力，但对肌苷和鸟苷的分解率最高也只有50％～60％左右，降解能够较差。
公开号为CN106754479A的发明申请公开了一种弯曲乳杆菌，命名为弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)5-1，保藏号为CGMCC No.12891，该菌株对肌苷和鸟苷的降解率能够达到90％左右。
不同种类的乳酸杆菌具有其自身特有的代谢途径，这不但会影响其制作食品时的发酵性能、同时也会影响食品的品质、风味和营养功能等性质，因此获得不同菌属具有高效嘌呤核苷的代谢能力菌株，对于开发不同种类具有辅助降解血尿酸的微生物发酵食品具有重要现实意义。
发明内容
本发明提供了一种能够降解嘌呤核苷的短乳杆菌及其应用，能够高效降解嘌呤核苷。
一种能够降解嘌呤核苷的短乳杆菌，命名为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)，株号ZJUNIT05，保藏号为CGMCC No.18445。
该菌株形态学特征为：在MRS固体培养基中菌落为圆形，边缘整齐且稍透明，乳白色，表面湿润光滑，不产色素。
该菌株生理及生化特性：菌株的糖酵解反应结果为发酵型，可以同化七叶苷和麦芽糖；不能同化甘露醇、山梨醇、棉子糖、蔗糖、菊糖、乳糖、纤维二糖和水杨苷；1％马尿酸钠的反应结果呈阴性。
该菌株具有高效降解嘌呤核苷的能力，该菌株可以在肠道内分解摄入食物中的嘌呤核苷，从而减少小肠对嘌呤核苷的吸收量。该菌株可以耐受接近人体饱腹状态下的胃液酸性条件(pH 3.0)。该菌株可以耐受人体小肠正常胆盐浓度。
本发明又提供了一种包含所述短乳杆菌的菌剂。优选的，所述短乳杆菌的浓度不小107cfu/mL。更优选的，所述短乳杆菌的浓度不小108cfu/mL。
本发明又提供了所述的短乳杆菌在制备预防高尿酸血症的饮用水添加物、食品添加物或饮料添加物中的应用。
本发明又提供了所述的短乳杆菌在制备治疗和预防高尿酸血症的药物中的应用。
本发明还提供了所述的菌剂在制备治疗和预防高尿酸血症的药物中的应用。
本发明还提供了一种治疗和预防高尿酸血症的药物，活性成分为如权利要求1所述的短乳杆菌。
本发明筛选获得了一株短乳杆菌，命名为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)，株号ZJUNIT05，保藏号为CGMCC No.18445，该菌株具有高效降解嘌呤核苷的能力，同时可以耐受人体通常条件下的酸性环境和胆盐浓度，可以在肠道内分解摄入食物中的嘌呤核苷，从而减少小肠对嘌呤核苷的吸收。因此短乳杆菌(Lactobacillus brevis)ZJUNIT05是开发辅助治疗高尿酸血症的微生物菌剂或药物的良好菌株。
附图说明
图1为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)ZJUNIT05菌株在MRS培养基中的生长曲线图。
图2为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)ZJUNIT05菌株耐酸性检测结果图。
图3为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)ZJUNIT05菌株在以0.3％胆盐浓度的MRS培养基中，耐胆盐能力检测结果图。
具体实施方式
实施例1
短乳杆菌(Lactobacillus brevis)ZJUNIT05菌种的分离筛选及纯化鉴定。
1、乳酸菌的分离
将从浙江省宁波市的超市购买的泡菜充分混匀后，吸取泡菜汁，用0.9％ NaCl无菌水溶液稀释合适的倍数后，涂布在MRS固体平板上，37℃静置培养 48h，获得单菌落。
2、乳酸菌菌株的筛选
对于反应液中剩余肌苷和鸟苷含量的测定，采用高效液相色谱法(即HPLC 法)，色谱条件：安捷伦EX1600SM高效液相色谱仪；反相色谱柱：Hypersil ODS2 C18(4.6mm×250mm)；流动相：0.01M KH2PO4∶色谱甲醇(纯甲醇)＝5∶95 (V/V)；流速：1mL/min；柱温：30℃；测定波长：260nm。
以反应液(1.26mM的肌苷和鸟苷溶解于0.1M、pH 7.0K3PO4)浓度为基准，按照一定的浓度梯度稀释至5个不同浓度的反应液分别进样，以峰面积为纵坐标，反应液浓度为横坐标，建立标准曲线。
从平板上挑取单菌落，接种于MRS培养基(蛋白胨10g，酵母提取物4g，牛肉膏5g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，柠檬酸三铵2g，吐-80 1g，硫酸镁0.20g，硫酸锰0.05g，磷酸氢二钾2g，琼脂15～17g，加水至1000mL，调pH至6.2，121℃灭菌20min。)中，于37℃静置培养24h。一部分用于保存，另一部分以2％的接种量传代2次活化菌种，作为种子培养基。取2mL种子培养基，于3000r/min 离心10min收集菌体。用无菌0.9％NaCl溶液清洗菌体2次。
向清洗后的菌体中加入750mL的反应液(含有1.26mM肌苷和1.26mM鸟苷的0.1M、pH7.0K3PO4溶液)，重悬菌体后置于恒温混匀仪中(37℃，800r/min) 反应1h。反应后迅速将反应液置于沸水浴中5min，终止反应。12000r/min离心 1min，除去菌体，收集上清液。用HPLC法测定上清液中肌苷和鸟苷的含量。按如下公式计算肌苷和鸟苷的降解率：降解率＝(C原液-C残液)÷C原液×100％，其中C原液为母液中的浓度，C残液为残留的浓度(浓度单位均为g/L)。取分离得到的一株对肌苷和鸟苷的降解能力分别达到98.07％和97.10％的菌株做菌种鉴定，并命名为ZJUNIT05。
通过上述分离和筛选获得的乳酸菌，其中一株对肌苷和鸟苷的降解率最高，均在95％以上。将其编号为菌株ZJUNIT05，形态学特征：在MRS固体培养基菌落为圆形，边缘整齐且稍透明，乳白色，表面湿润光滑，不产色素。
3、菌株鉴定
3.1、乳酸菌糖发酵反应
将菌株ZJUNIT05以2％的接种量接种到新的MRS培养基中活化。取活化后的菌种2ml，3000r/min下离心2min，除去上清液，用0.9％NaCl溶液重悬清洗，3000r/min离心10min，重复清洗2次，最后重悬于0.9％NaCl溶液。按照乳酸菌微量生化鉴定条操作说明书操作，将菌体悬液接种到试剂条中，37℃静置培养24h后。根据反应液的颜色变化判断反应的阴阳性结果。糖发酵的结果通过对比《伯杰氏细菌鉴定手册(第八版)》中的糖发酵特性，初步判断菌株的菌属。
该菌株生理及生化特性：菌株的糖酵解反应结果为发酵型(表1)，能同化七叶苷和麦芽糖；不能同化甘露醇、山梨醇、棉子糖、蔗糖、菊糖、乳糖、纤维二糖和水杨苷；1％马尿酸钠的反应结果是阴性。
表1菌株对糖的利用情况表
3.2、16S rRNA基因片段的扩增及测序结果
用TIANamp Bacteria DNA Kit试剂盒提取菌体的基因组，并用PCR扩增16S rRNA的基因片段。扩增引物序列为16sF：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG；16sR： GGCTACCTTGTTACGACTT。PCR产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳验证后，委托上海生物工程(生工)有限公司进行序列测定。
16S rRNA序列测定结果如SEQ ID No.1所示。
根据糖类利用特性在《伯杰氏细菌手册(第八版)》中对比的结果和16S rRNA 基因片段的测序结果在NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)中进行BLAST分析，菌株鉴定为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)，所以将菌株ZJUNIT05命名为短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)，株号ZJUNIT05。将短乳杆菌(Lactobacillus brevis) ZJUNIT05保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019年8月30日，保藏号为CGMCC No.18445。
实施例2
短乳杆菌(Lactobacillus brevis)ZJUNIT05在MRS培养基中的生长曲线。
将活化好的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)ZJUNIT05菌株，以2％的接种量接种到MRS培养基中37℃静置培养。从0h开始，每隔3h取样，稀释到合适浓度后，利用紫外-可见光分光光度计，在波长为600nm的可见光下，测定OD 值，根据收集到的不同时间点的OD600值绘制菌株的生长曲线。测定结果如图1 所示。大约24h后，菌体生长进入平台期，此时菌体生长速度减缓，趋于稳定。
实施例3
短乳杆菌(Lactobacillus brevis)ZJUNIT05的药敏谱。
采用抗菌药物药敏纸片(杭州微生物试剂有限公司)测定短乳杆菌(Lactobacillus brevis)ZJUNIT05的药敏谱。将充分活化后的菌液，以2％的接种量接种到新鲜的MRS培养基中，在37℃的恒温培养箱中培养24h，移取100μl 菌体悬液均匀涂布到MRS固体培养基平板上，待平板表面基本无液体后，将3 片药物敏感纸片均匀分散放置在平板上，37℃恒温培养48h，用游标卡尺测量抑菌圈直径。用游标卡尺测量抑菌圈直径。表2显示短乳杆菌(Lactobacillus brevis) ZJUNIT05对不同类抗生素的敏感性结果。可以看出，短乳杆菌(Lactobacillus brevis)ZJUNIT05对不同的抗生素表现出了不同的敏感性，菌株在含有哌拉西林、红霉素、头孢哌酮的培养基上抑菌圈直径均大于20mm，说明乳酸菌对这几种抗生素敏感程度较高，在含有苯唑西林的培养基上无抑菌圈，在含有青霉素的培养基上抑菌圈的直径较低为8.02mm，可知苯唑西林、乳酸菌对青霉素的敏感程度较低。
表2短乳杆菌(Lactobacillus brevis)ZJUNIT05菌株抗生素敏感性结果表
实施例4
短乳杆菌(Lactobacillus brevis)ZJUNIT05耐酸和耐胆盐能力。
1、耐酸能力试验
将活化好的菌株分别置于pH为6.2(对照组)、2、3和4的MRS培养基中， 37℃下分别处理1h、2h、3h和4h时，进行平板活菌计数，37℃培养48小时后，数菌落个数。短乳杆菌(Lactobacillus brevis)ZJUNIT05的耐酸能力如图2 所示，虽然pH 2.0的酸性环境对其存活有较大影响，但在pH≥3.0的条件下处理 2h内该菌株能够保持108cfu/mL以上的活菌数；而通常胃酸pH在3.0左右，食物通过胃的时间一般为1～2h，由此可说明，短乳杆菌(Lactobacillus brevis) ZJUNIT05具备了抵抗多数条件下人体酸性环境的能力。
2、耐胆盐能力试验
以2％的接种量将种子培养基分别接种到牛胆粉浓度为0(对照)和0.3％的 MRS培养基中，在37℃下静置培养，分别在0h、4h、12h、24h进行平板活菌计数。人体小肠中胆汁的浓度范围在0.03％～0.3％，在以0.3％胆盐浓度的MRS 培养基中，37℃条件下处理4h、12h、24h后，活菌数仍可达到108cfu/mL及以上且保持相对稳定(图3)，说明其具有较强的胆盐耐受能力，这证明其可以耐受人体正常胆汁浓度，具备了在肠道中长时间存活所需的胆盐耐受能力。
序列表
<110> 浙大宁波理工学院
<120> 一种能够降解嘌呤核苷的短乳杆菌及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1469
<212> DNA
<213> 短乳杆菌(Lactobacillus brevis)
<400> 1
gcggggggct gcctatacat gcaagtcgaa cgagcttccg ttgaatgacg tgcttgcact 60
gatttcaaca atgaagcgag tggcgaactg gtgagtaaca cgtgggaaat ctgcccagaa 120
gcaggggata acacttggaa acaggtgcta ataccgtata acaacaaaat ccgcatggat 180
tttgtttgaa aggtggcttc ggctatcact tctggatgat cccgcggcgt attagttagt 240
tggtgaggta aaggcccacc aagacgatga tacgtagccg acctgagagg gtaatcggcc 300
acattgggac tgagacacgg cccaaactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccac 360
aatggacgaa agtctgatgg agcaatgccg cgtgagtgaa gaagggtttc ggctcgtaaa 420
actctgttgt taaagaagaa cacctttgag agtaactgtt caagggttga cggtatttaa 480
ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt 540
gtccggattt attgggcgta aagcgagcgc aggcggtttt ttaagtctga tgtgaaagcc 600
ttcggcttaa ccggagaagt gcatcggaaa ctgggagact tgagtgcaga agaggacagt 660
ggaactccat gtgtagcggt ggaatgcgta gatatatgga agaacaccag tggcgaaggc 720
ggctgtctag tctgtaactg acgctgaggc tcgaaagcat gggtagcgaa caggattaga 780
taccctggta gtccatgccg taaacgatga gtgctaagtg ttggagggtt tccgcccttc 840
agtgctgcag ctaacgcatt aagcactccg cctggggagt acgaccgcaa ggttgaaact 900
caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagctacg 960
cgaagaacct taccaggtct tgacatcttc tgccaatctt agagataaga cgttcccttc 1020
ggggacagaa tgacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt 1080
aagtcccgca acgagcgcaa cccttattat cagttgccag cattcagttg ggcactctgg 1140
tgagactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat catgcccctt 1200
atgacctggg ctacacacgt gctacaatgg acggtacaac gagttgcgaa gtcgtgaggc 1260
taagctaatc tcttaaagcc gttctcagtt cggattgtag gctgcaactc gcctacatga 1320
agttggaatc gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg 1380
tacacaccgc ccgtcacacc atgagagttt gtaacaccca aagccggtga gataaccttc 1440
gggagtcagc cgtctaaggg gacccagat 1469
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agagtttgat cmtggctcag 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggctaccttg ttacgactt 19
Claims (8)
1.一种能够降解嘌呤核苷的短乳杆菌，其特征在于，命名为短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)，株号ZJUNIT05，保藏号为CGMCC No.18445。
2.一种包含如权利要求1所述短乳杆菌的菌剂。
3.如权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述短乳杆菌的浓度不小107cfu/mL。
4.如权利要求3所述的菌剂，其特征在于，所述短乳杆菌的浓度不小108cfu/mL。
5.如权利要求1所述的短乳杆菌在制备预防高尿酸血症的饮用水添加物、食品添加物或饮料添加物中的应用。
6.如权利要求1所述的短乳杆菌在制备治疗和预防高尿酸血症的药物中的应用。
7.如权利要求2所述的菌剂在制备治疗和预防高尿酸血症的药物中的应用。
8.一种治疗和预防高尿酸血症的药物，其特征在于，活性成分为如权利要求1所述的短乳杆菌。
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