CN114634893A - 发酵剂与制备芥菜食品的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种发酵剂，一种采用该发酵剂制备芥菜食品的方法以及一种芥菜食品。该发酵剂包含野生益生菌，该野生益生菌选自短乳杆菌L8、植物乳杆菌L9和酿酒酵母菌Y9中的至少一种。该方法包括以下步骤：预处理芥菜原料，得到预处理后的原料；向该预处理后的原料中添加发酵剂和腌制专用盐，进行腌制，制得腌制芥菜；对该腌制芥菜实施保鲜处理，制得芥菜食品。采用该方法，既缩短发酵时间，又使发酵后的芥菜保留更多的营养成分，克服了漂淡导致营养成分流失以及热杀菌造成长时间保存后变软发酸的技术问题；该芥菜食品不但兼具降低亚硝酸盐含量与提高产酯量的能力，而且能够在较长时间内维持品质，因此具有广阔的应用前景和不菲的市场价值。

Description

发酵剂与制备芥菜食品的方法

技术领域

本发明涉及生物发酵技术领域，具体涉及一种发酵剂，一种采用该发酵剂制备芥菜食品的方法以及一种芥菜食品。

背景技术

芥菜，主要包括雪菜、榨菜、包心芥菜、大头芥菜等，通常经盐渍发酵长达 2～3个月时间由生鲜进入成熟即可食用，在高盐(含盐量16～22％，以氯化钠计，下同)腌制环境条件下可得到长期保存。

根据《方便榨菜GH/T 1012-2007》国家行业标准、《榨菜类罐头QB/T 1402-2017》轻工行业标准，腌制成熟的芥菜半成品加工成小包装产品或即食产品，由于加工原料高盐腌制需经漂淡才能加工成低盐(含盐量≤6％)或中盐(含盐量≤10％)产品、调味榨菜罐头(含盐量≤7％)产品，导致营养成分流失，且漂淡产生大量废盐水增加环境污染压力，处理成本高；小包装或罐头产品由于贮存环境和包装条件的改变，保存困难，虽采用巴氏杀菌可延长贮藏期，但贮存2 个月后容易变软变酸，产品口感改变，品质维持期不长。

研究表明，现有的芥菜腌制加工方法存在5个方面问题：(1)传统腌制芥菜发酵时间长达2个月或以上；(2)腌制食盐用盐量高达16％以上(以氯化钠含量计)；(3)腌制后经漂淡产生大量废盐水(一般漂淡用水量为1份原料：3份水)，排放处理成本高达5～6元/吨，且食盐和水资源浪费严重；(4)经漂淡后的腌制芥菜营养成分流失；(5)小包装产品经巴氏灭菌贮藏2个月后会变软变酸，风味改变。因此，开发一种安全营养、节本增效的腌制芥菜新型加工方法，革新传统加工工艺，很有必要且意义重大。

为解决上述问题，曾有技术人员提出采用乳酸菌发酵以降低用盐量的方法，如专利申请CN202110311800.5(一种低盐、低亚硝酸盐芥菜发酵技术)，虽然腌制成熟时间可缩短至15d～30d，但加工工艺仍免不了脱盐、巴氏杀菌环节。又如，专利申请CN202010665002.8(一种通过乳酸菌发酵提高芥菜产品风味的加工方法)公开了一种通过乳酸菌发酵提高芥菜产品风味的加工方法，该方法利用乳酸菌提高芥菜发酵的效率，同时可以提高发酵物的鲜香气味。还有人研究了芥菜脱盐的工艺优化，如专利申请CN201910801706.0(一种芥菜脱盐工艺的优化方法)，虽然用第一次脱盐的水再循环使用2次，但是该方法仍需依赖于大用量水脱盐。

可见，现有技术仅仅对芥菜腌制工艺进行了些许改良，仍然没有解决存在的发酵耗时长、漂淡导致营养成分流失、热杀菌造成长时间保存(通常保存2～3 个月)后变软发酸等技术问题。

发明内容

本发明旨在提供一种制备芥菜食品的新发酵工艺，其利用特定的野生益生菌，并采用非热杀菌技术，既能够缩短发酵时间，提高发酵芥菜安全性，又能够使发酵后的芥菜保留更多的营养成分，克服了漂淡导致营养成分流失以及热杀菌造成长时间保存后变软发酸的技术问题。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案具体包括：

本发明第一方面提供了一种发酵剂，其包含野生益生菌，所述野生益生菌选自短乳杆菌L8(即LMBJ-L8-S)、植物乳杆菌L9(即LMBJ-L9-S)和酿酒酵母菌Y9(即LMBJ-Y9-S)中的至少一种；

其中，所述短乳杆菌(Lactobacillus brevis)L8的DNA序列如SEQ ID NO： 1所示，所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L9的DNA序列如SEQ ID NO： 2所示，所述酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)Y9的DNA序列如 SEQ ID NO：3所示，具体见下表1：

表1短乳杆菌L8、植物乳杆菌L9和酿酒酵母菌Y9的DNA序列(核苷酸序列)

如上所述的短乳杆菌L8、植物乳杆菌L9和酿酒酵母菌Y9是发明人使用梯度稀释涂布法从自然发酵的芥菜中分离筛选出的菌种，并且发明人使用现有技术分别对短乳杆菌L8、植物乳杆菌L9和酿酒酵母菌Y9进行了分离纯化；此外，发明人还对这些菌种进行了常规发酵性能测定与鉴定。由于以上各过程都可以通过本领域已知的相关方法实现，因此不在此赘述。

并且，所述短乳杆菌L8(Lactobacillus brevis LMBJ-L8-S)、所述植物乳杆菌 L9(Lactobacillus plantarum LMBJ-L9-S)和所述酿酒酵母菌Y9(Saccharomycescerevisiae LMBJ-Y9-S)均已于2022年3月16日被保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，武汉大学)，保藏编号依次分别为CCTCC No.M2022271，CCTCC No.M 2022270，以及CCTCC No. M 2022269。

进一步地，发明人通过试验意外发现，所述短乳杆菌L8和所述植物乳杆菌 L9具有很强的降解亚硝酸盐能力，降解率在75％以上；所述酿酒酵母菌Y9具有很强的产酯能力，高达0.38g·100mL^-1以上。

优选地，所述发酵剂包含的野生益生菌为短乳杆菌L8，或植物乳杆菌L9，或酿酒酵母菌Y9。优选地，所述野生益生菌为短乳杆菌L8与植物乳杆菌L9的组合。优选地，所述野生益生菌为短乳杆菌L8与酿酒酵母菌Y9的组合。另外优选地，所述野生益生菌为植物乳杆菌L9和酿酒酵母菌Y9的组合。

进一步优选地，所述发酵剂包含野生益生菌，所述野生益生菌为短乳杆菌 L8、植物乳杆菌L9和酿酒酵母菌Y9的组合。

并且，本发明第二方面提供了一种制备芥菜食品的方法，包括以下步骤：

S1：预处理芥菜原料，得到预处理后的芥菜；

S2：向所述预处理后的芥菜中添加发酵剂和腌制专用盐，进行腌制，制得腌制芥菜；

S3：对所述腌制芥菜实施保鲜处理，制得芥菜食品；

其中，所述芥菜原料为叶用芥菜原料或茎用芥菜原料；

其中，所述发酵剂包含野生益生菌，所述野生益生菌选自短乳杆菌L8、植物乳杆菌L9和酿酒酵母菌Y9中的至少一种；

其中，所述短乳杆菌L8的DNA序列如SEQ ID NO：1所示，所述植物乳杆菌L9的DNA序列如SEQ ID NO：2所示，所述酿酒酵母菌Y9的DNA序列如SEQ ID NO：3所示，详见上表1。

优选地，在所述的制备芥菜食品的方法中，所述野生益生菌由所述短乳杆菌 L8、所述植物乳杆菌L9和所述酿酒酵母菌Y9组成，并且，所述短乳杆菌L8、所述植物乳杆菌L9和所述酿酒酵母菌Y9的质量比选自以下任一种：

1)1：1：1；

2)1：1：2；

3)1：2：1；以及

4)2：1：1。

进一步优选地，所述短乳杆菌L8、所述植物乳杆菌L9和所述酿酒酵母菌 Y9的质量比为1：2：1。最优选地，所述短乳杆菌L8、所述植物乳杆菌L9和所述酿酒酵母菌Y9的质量比为1：1：1。

优选地，在所述的制备芥菜食品的方法中，在所述芥菜原料为叶用芥菜原料的情况下，步骤S1包括：对所述叶用芥菜原料依次实施以下步骤：清洗、沥干、微堆黄，得到预处理后的叶用芥菜；或在所述芥菜原料为茎用芥菜原料的情况下，步骤S1包括：对所述茎用芥菜原料依次实施以下步骤：清洗、沥干、亚风干，得到预处理后的茎用芥菜。

其中，值得补充说明的是，所述微堆黄是指晾凉0～3天使叶片微变黄，优选地1～2天。所述微堆黄既能够减少表面水分，利于表面伤口愈合，又能够降解部分蛋白质以增加氨基酸含量。所述亚风干是指在自然条件或(非热)机械作用下脱去一部分水分，通常是指脱去水分的10～30％(常规风干脱水60～90％)，一般于自然条件下风干0～3天，优先地1～2天，使表面干燥并使其切割的伤口愈合，避免表面有害微生物入侵，又有足够结合水使芥菜保持脆性和Q弹。

优选地，在所述的制备芥菜食品的方法中，所述发酵剂的接菌量为3～5％，所述腌制专用盐的添加量为5～10％。

其中，3～5％的“接菌量”指的是：例如，每100kg芥菜中添加3～5kg的发酵剂，并且所述发酵剂中各菌种的浓度≥1×10⁷cfu/mL。其中，5～10％的“添加量”指的是：每100kg芥菜中添加5～10kg的所述腌制专用盐(NaCl)。

优选地，在所述的制备芥菜食品的方法中，步骤S2中所述腌制的持续时间为10-25天。

优选地，在所述的制备芥菜食品的方法中，步骤S3中所述保鲜处理包括：臭氧处理所述腌制芥菜，然后添加保鲜剂。

应当指出的是，所述保鲜处理属于一种非热杀菌技术，用于将所述腌制芥菜转化为“安全、营养、健康”的芥菜食品。所述腌制芥菜实际上为腌制半成品原料，是指经步骤S2腌制得到的不少于8成熟的半成品芥菜原料。

进一步优选地，所述保鲜剂包含：

1)焦亚硫酸钠与柠檬酸；或

2)山梨酸钾与焦亚硫酸钠。

一般而言，在所述芥菜原料为叶用芥菜原料的情况下，所述保鲜剂为包含焦亚硫酸钠与柠檬酸的水溶液；而在所述芥菜原料为茎用芥菜原料的情况下，所述保鲜剂为包含山梨酸钾与焦亚硫酸钠的水溶液。当然，上述组合物1)与组合物 2)也可以互换使用。

更进一步优选地，在所述的制备芥菜食品的方法中，所述臭氧处理的持续时间为1-9分钟。

最后，本发明的第三方面还提供了一种根据第二方面所述方法制得的芥菜食品。如本发明第二方面所记载的，由于所述芥菜食品的制备过程无需现有技术中所必需的漂淡过程(一般长达20～30min)，也无需现有技术中所必需的巴氏杀菌 (一般长达17～20min)，所述芥菜食品更大程度地保留了腌制发酵成熟芥菜的营养成分和质地。

总之，本发明所提供的技术方案与现有技术相比至少具备以下有益效果：

由于本发明第二方面提供的制备芥菜食品的方法使用了第一方面提供的发酵剂，其中短乳杆菌L8+植物乳杆菌L9+酿酒酵母菌Y9的使用产生了协同效果，丰富了腌制芥菜的营养成分并保留了香味风味。所述制备芥菜食品的方法既能够缩短发酵时间，提高发酵芥菜安全性，又能够使发酵后的芥菜保留更多的营养成分，克服了漂淡导致营养成分流失以及热杀菌造成长时间保存后变软发酸的技术问题。因此，本发明第三方面提供的芥菜食品符合行业标准，其不但兼具降低亚硝酸盐含量与提高产酯量的能力，而且能够在较长时间内维持品质。

综上所述，本发明所提供的发酵剂、制备芥菜食品的方法以及芥菜食品具有广阔的应用前景和不菲的市场价值。

附图说明

图1为3种菌株(短乳杆菌L8、植物乳杆菌L9和酿酒酵母菌Y9)的菌落形态图。

图2为短乳杆菌L8的扫描电镜SEM的图像。

图3为短乳杆菌L8的透射电镜TEM的图像。

图4为植物乳杆菌L9的扫描电镜SEM的图像。

图5为植物乳杆菌L9的透射电镜TEM的图像。

图6为酿酒酵母菌Y9的扫描电镜SEM的图像。

图7为酿酒酵母菌Y9的透射电镜TEM的图像。

图8为图1中的3种菌株对应的PCR扩增凝胶电泳图。

图9示出了L8、L9和Y9的不同配比(质量比)对芥菜发酵过程中的pH 和总酸含量的影响。

图10示出了腌制专用盐的不同添加量(质量百分比)对芥菜发酵过程中的 pH和总酸含量的影响。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

应当说明的是，在本文中，采用PHS-3C型pH计直接测定pH值，参考GB/T 12456-2021(国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB 12456-2021食品中总酸的测定[S].北京：中国标准出版社，2021)测定总酸含量，参考GB/T 5009.235-2016(中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会. GB5009.235-2016食品中氨基酸态氮的测定[S].北京：中国标准出版社，2016) 测定氨基酸态氮，并且，使用南京建成生物工程研究所亚硝酸盐测试盒测定亚硝酸盐含量。

首先，发明人采用梯度稀释涂布法对自然发酵优良的腌制芥菜中的乳杆菌、酵母菌实施了初步培养，主要步骤包括：取25mL腌制芥菜汁加入225mL生理盐水中，振荡摇匀，并逐级稀释至10^-1～10^-6CFU·mL^-1。乳杆菌：分别吸取0.1mL 涂布于含2％碳酸钙的MRS固体培养基中，37℃培养48h，挑取溶钙圈大的菌落。酵母菌：分别吸取0.1mL涂布于孟加拉红培养基，28℃培养48～72h，挑取典型的酵母菌菌落。对挑取的所有菌落反复分离纯化，直至得到纯菌落，进行斜面保藏并编号备用。

并且，发明人还分别实施了发酵性能测定、微观形态学鉴定、分子生物学鉴定以及系统发育树的构建，从而完成对菌株的分离筛选，具体如下：

乳杆菌的发酵性能测定

生长曲线测定：将活化好的菌株按1％的接种量分别接入灭菌的MRS液体培养基中，37℃培养24h，从0h开始取样，以未接种的MRS液体培养基作为空白对照，每隔2h测一次OD₆₀₀，每个样品重复3次，观察各菌株的OD值随发酵时间的变化现象。

产酸性能测定：将活化好的菌株按1％的接种量分别接入灭菌的MRS液体培养基中，37℃培养24h，从0h开始取样，以未接种的MRS液体培养基作为空白对照，每隔4h测一次pH值，每个样品重复3次，观察各菌株的pH值随发酵时间的变化现象。

亚硝酸盐降解率测定：参照刘芳等(刘芳等，泡菜汁中乳酸菌优良菌株筛选及生长与发酵特性研究[J].中国调味品,2012,37(11):23-28)的方法测定亚硝酸盐降解率；并且，根据盐酸萘乙二胺法(中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会,国家食品药品监督管理总局.GB 5009.33-2016食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定[S].北京:中国标准出版社,2016)测定亚硝酸盐的含量，计算亚硝酸盐降解率：亚硝酸盐降解率＝(亚硝酸盐原含量-降解后亚硝酸盐含量)/亚硝酸盐原含量*100％。

酵母菌的发酵性能测定

产气能力检测：吸取1％酵母菌的新鲜培养物加入含有杜氏小导管的豆芽汁液体培养基中，每隔12h观察杜氏小导管产气情况，对酵母菌的产气能力进行初步判断，进一步筛选出性状良好的优良菌株。

蛋白酶活性检测：将根据产气能力筛选出的酵母菌菌株进行活化后，按照 1％的接种量均匀涂布于蛋白酶检测固体培养基中，放置于28℃培养箱培养48h，观察菌落周围是否出现透明环，出现透明环则表明该菌株具有蛋白酶活性。

产酯测定：将具有蛋白酶活性菌株按照1％的接种量加入豆芽汁培养基中，放置于28℃摇床中培养48h后，采用回流皂化方法测定培养液中的总酯含量(张鹏.四川泡菜中酵母菌的分离筛选及其应用研究[D].东北农业大学,2007)。

微观形态学鉴定

对根据发酵性能筛选出的优势乳杆菌和酵母菌实施增菌处理，吸取1mL菌液于1.5mL的离心管中，以3500r·min^-1离心3分钟，再用生理盐水进行冲洗2～3 遍并再次离心，最后用2.5％的戊二醛进行固定，于浙江大学测试中心进行扫描电镜和透射电镜成像。

分子生物学鉴定

将根据发酵性能筛选出的优势乳杆菌和酵母菌通过试剂盒实施总DNA提取，然后，以细菌引物对乳杆菌进行16SrDNA扩增，其正向引物27f的核苷酸序列SEQ ID NO：4为5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；其反向引物1492r 的核苷酸序列SEQ ID NO：5为5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3'；并且，以真菌通用引物对酵母菌进行18SrDNA扩增，其引物正向引物ITSI的核苷酸序列SEQ ID NO：6为5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'；反向引物ITS4的核苷酸序列SEQ ID NO：7为5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。

其中，PCR扩增体系为：乳杆菌：2*EasyTaq PCR Super Mix 25uL，引物各 1uL，模板DNA2 uL，ddH₂O补至50uL。酵母菌：2*EasyTaq PCR Super Mix 25 uL，引物各2.5uL，模板DNA2 uL，ddH₂O补至50uL。

其中，PCR扩增条件为：乳杆菌：94℃预变性5min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸90s，循环30次，最后72℃终末延伸20min，保温。酵母菌：94℃预变性5min，94℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸1min，循环34次，最后72℃终末延伸10min，保温。

得到的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，测序工作由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

系统发育树的构建

将对菌株测序得到的序列提交至NCBI进行BLAST(Mount D W.Using the BasicLocal Alignment Search Tool(BLAST)[J].Cold Spring Harbor Laboratory Press,2007,14: pdb.top17)比对，比对结果用MEGA 4软件中的Neighbor-Joining法构建系统发育树，以确定该菌株的分类地位。

据此，根据本发明第一方面的发酵剂包含野生益生菌，该野生益生菌选自短乳杆菌L8、植物乳杆菌L9和酿酒酵母菌Y9中的至少一种；该短乳杆菌L8的DNA序列如SEQ ID NO：1所示，该植物乳杆菌L9的DNA序列如SEQ ID NO： 2所示，该酿酒酵母菌Y9的DNA序列如SEQID NO：3所示。

具体地，上述3种菌株的宏观形态学观察结果如图1所示，它们的微观形态学电镜观察结果如图2-7所示，并且这3种菌株对应的PCR扩增凝胶电泳图如图8所示。经分析表明，L8、L9菌体均呈杆状，分子量大小约为1200bp，而 Y9菌体呈卵圆形，分子量大小约350bp。

特别地，发明人应用该发酵剂与自然发酵(CK)进行了比较，总体感官评分从高到低依次为：L8+L9+Y9＞L8+L9＞L9+Y9＞L8+Y9＞L8＞L9＞Y9＞CK，详见下表2：

表2发酵剂与自然发酵的发酵结果的比较

因此，在一个优选实施例中，该发酵剂包含的野生益生菌为短乳杆菌L8。在一个优选实施例中，该发酵剂包含的野生益生菌为植物乳杆菌L9。在一个优选实施例中，该发酵剂包含的野生益生菌为酿酒酵母菌Y9。

在一个更优选的实施例中，该野生益生菌为短乳杆菌L8与植物乳杆菌L9 的组合。在一个更优选的实施例中，该野生益生菌为短乳杆菌L8与酿酒酵母菌 Y9的组合。在一个更优选的实施例中，该野生益生菌为植物乳杆菌L9和酿酒酵母菌Y9的组合。

在一个最优选的实施例中，该发酵剂包含野生益生菌，该野生益生菌为短乳杆菌L8、植物乳杆菌L9和酿酒酵母菌Y9的组合。

根据本发明第二方面的制备芥菜食品的方法包括以下步骤：

S1：预处理芥菜原料，得到预处理后的芥菜；

S2：向该预处理后的芥菜中添加发酵剂和腌制专用盐，进行腌制，制得腌制芥菜；

S3：对该腌制芥菜实施保鲜处理，制得芥菜食品；

其中，该芥菜原料为叶用芥菜原料或茎用芥菜原料，该发酵剂如本发明第一方面所述。

特别是，实施本发明第二方面提供的上述方法，能够达到既发酵成熟又耐贮藏且免洗的效果。

在一些优选实施例中，在该制备芥菜食品的方法中，该野生益生菌由该短乳杆菌L8、该植物乳杆菌L9和该酿酒酵母菌Y9组成，并且，该短乳杆菌L8、该植物乳杆菌L9和该酿酒酵母菌Y9的质量比选自以下任一种：

1)1：1：1；

2)1：1：2；

3)1：2：1；以及

4)2：1：1。

具体地，图9示出了L8、L9和Y9的不同配比(质量比)对芥菜发酵过程中的pH和总酸含量的影响。可见，当L8、L9和Y9的质量比为1：1：1时， pH值最低，总酸含量最高，从第2天开始，pH值与总酸含量均与其他三组(1：1：2，1：2：1和2：1：1)差异达显著水平(p<0.05)。

因此，在一个最优选的实施例中，该短乳杆菌L8、该植物乳杆菌L9和该酿酒酵母菌Y9的质量比为1：1：1。

在一些优选实施例中，在该制备芥菜食品的方法中，在该芥菜原料为叶用芥菜原料的情况下，步骤S1包括：对该叶用芥菜原料依次实施以下步骤：清洗、沥干、微堆黄，得到预处理后的叶用芥菜；或在该芥菜原料为茎用芥菜原料的情况下，步骤S1包括：对该茎用芥菜原料依次实施以下步骤：清洗、沥干、亚风干，得到预处理后的茎用芥菜。

在一个优选实施例中，步骤S1包括：将叶用芥菜原料洗净后沥干；接着微堆黄0～3天，用于降解蛋白质以增加氨基酸含量，从而提高腌菜的鲜味；得到预处理后的叶用芥菜。

在一个优选实施例中，步骤S1包括：将茎用芥菜原料洗净后沥干；亚风干 0～3天，用于减少表面水分和使其表面伤口愈合，避免表面有害微生物入侵，又有足够结合水使芥菜保持脆性和Q弹；得到预处理后的茎用芥菜。

在一些优选实施例中，该发酵剂的接菌量为3～5％，该腌制专用盐的添加量为5～10％；并且，该发酵剂中各菌种的浓度均为1×10⁷cfu/mL。

其中，发酵剂用于增加优势益生菌数量、抑制有害微生物的生长，加快发酵进程，使腌菜更加营养健康。

其中，腌制专用盐的添加量也是重要工艺参数，这是因为菌株L8、L9和 Y9只有在正常的渗透压条件下，才能很好的生长，添加量过高或过低均不利于菌株的生长(详见图10)。其中，添加量＞10％或＜5％时，发酵过程中的pH均较高，而总酸含量均较低，与添加量5％和8％比较差异达显著水平(p<0.05)。

因此，如果腌制专用盐的添加量过高，则需要漂淡工艺(漂淡时间一般长达 25～40min)，以使加工产品达到低盐标准，这显然严重浪费腌制专用盐与漂淡用水，而且排放的废盐水会增加环境污染治理成本；如果腌制专用盐的添加量过低，那么腌制过程则达不到抑制有害微生物的效果，造成发酵不良，最终得到的腌菜质量差。

此外，关于发酵成熟时间(又称发酵时间/腌制的持续时间)，第二方面的制备芥菜食品的方法的实施能够使得叶用芥菜发酵时间缩短至15～20天，且使得茎用芥菜发酵时间缩短至20～25天。与此明显不同的是，采用传统发酵工艺，叶用芥菜发酵时间为45～60天，而茎用芥菜发酵时间为2～3个月。

在一些优选实施例中，在该制备芥菜食品的方法中，步骤S3中该保鲜处理包括：臭氧处理该腌制芥菜(又称腌制成熟的芥菜)，然后添加保鲜剂。

在一些更优选的实施例中，对于叶用芥菜，该保鲜处理包括：使腌制成熟的叶用芥菜通过持续通有臭氧O₃的水槽1～5分钟，再切段通过无菌清水槽1～2分钟，然后压滤沥干→拌料→称重→添加保鲜剂。其中，保鲜剂为焦亚硫酸钠 (Sodium metabisulphite，缩写为SM，下同)与柠檬酸(Citric Acid，缩写为CA，下同)的水溶液；SM的添加量小于0.45g/kg，并且CA的添加量小于3g/kg。

在另一些更优选的实施例中，对于茎用芥菜，该保鲜处理包括：使腌制成熟的茎用芥菜通过持续通有臭氧O₃的水槽3～7分钟，再切丝/切块通过无菌清水槽 1～2分钟，然后压滤沥干→拌料→称重→添加保鲜剂。其中，保鲜剂为山梨酸钾 (Potassium sorbate，缩写为PS，下同)与焦亚硫酸钠(SM)的水溶液；PS的添加量小于0.5g/kg，并且SM的添加量小于0.45g/kg。

应当说明的是，本文中，当添加量的单位为g/kg时，分子为被添加物质的质量，而分母为芥菜的质量。

此外，下文结合实施例对本发明的技术方案进行更详细说明，以方便理解，除本文中另有说明外，下文中所使用的试剂为市售的试剂，所实施的具体操作步骤为常规的操作步骤。

实施例1

选用叶用芥菜原料1000kg，洗净后沥干，接着微堆黄2天，得到预处理后的叶用芥菜；向该预处理后的叶用芥菜中添加发酵剂和腌制专用盐，进行腌制。其中，发酵剂包含短乳杆菌L8、植物乳杆菌L9和酿酒酵母菌Y9(配比为1：1： 1)，发酵剂的接菌量为3％(发酵剂中各菌种的浓度均为1×10⁷cfu/mL)，海晒腌制专用盐的添加量为8％，腌制成熟时间为15天，从而制得腌制芥菜。

实施例2

此实施例用于制备腌制芥菜，在此实施例中的步骤与实施例1相同，唯一区别是：发酵剂仅包含短乳杆菌L8与植物乳杆菌L9(配比为1：1)。

实施例3

此实施例用于制备腌制芥菜，在此实施例中的步骤与实施例1相同，唯一区别是：发酵剂仅包含酿酒酵母菌Y9。

对照例1(CK1)

选用叶用芥菜原料1000kg，洗净后沥干，然后添加海晒腌制专用盐，进行腌制(自然发酵)。其中，海晒腌制专用盐的添加量为16％，腌制成熟时间为60 天，从而制得腌制芥菜。

实施例4

选用茎用芥菜原料1000kg，洗净后沥干，接着亚风干1天，得到预处理后的茎用芥菜；向该预处理后的茎用芥菜中添加发酵剂和腌制专用盐，进行腌制。其中，发酵剂包含短乳杆菌L8、植物乳杆菌L9和酿酒酵母菌Y9(配比为1：1： 1)，发酵剂的接菌量为5％(发酵剂中各菌种的浓度均为1×10⁷cfu/mL)，海晒腌制专用盐的添加量为8％，腌制成熟时间为20天，从而制得腌制芥菜。

实施例5

此实施例用于制备芥菜食品，在此实施例中的步骤与实施例4相同，唯一区别是：发酵剂仅包含短乳杆菌L8与植物乳杆菌L9(配比为1：1)。

实施例6

此实施例用于制备芥菜食品，在此实施例中的步骤与实施例4相同，唯一区别是：发酵剂仅包含酿酒酵母菌Y9。

对照例2(CK2)

选用茎用芥菜原料1000kg，洗净后沥干，然后添加海晒腌制专用盐，进行腌制(自然发酵)。其中，海晒腌制专用盐的添加量为16％，腌制成熟时间为60 天，从而制得腌制芥菜。

对实施例1-6与对照例1-2制得的产品的关键指标进行分析和比较，结果见下表3。表3中，氨基酸态氮、总酸含量一定程度可以反映产品的发酵和营养水平，氨基酸态氮数值越大、总酸含量适中，则意味着发酵成熟的产品好；亚硝酸盐会对人类健康造成危害，故而数值越小食用就越安全。

表3实施例1-6与对照例1-2制得的产品的理化分析结果

注：表3中亚硝酸盐峰值相同字母标注表示之间没有差异，不同字母标注(小写)表示之间差异达显著水平(p＜0.05)，(大写)表示之间差异达极显著水平(p＜0.01)。

表3表明：对于叶用芥菜而言，实施例1、实施例2、实施例3对应的亚硝酸盐峰值均小于10mg/kg(酱腌菜的亚硝酸盐安全限量标准20mg/kg)，显著小于 CK1对应的亚硝酸盐峰值。对亚硝酸盐的降解效果大小依次为实施例1 (L8+L9+Y9)＞实施例2(L8+L9)＞实施例3(Y9)。具体地，降解亚硝酸盐效果：实施例1(L8+L9+Y9)显著好于实施例2(L8+L9)、极显著好于实施例3 (Y9)，这证明L8+L9+Y9对亚硝酸盐降解有显著的正向协同增效的作用，即发挥了协同作用。感官评价(商品性)综合评分大小依次为实施例1＞实施例2＞实施例3＞CK1。此外，实施例1的感官评价包括：色泽鲜黄、脆嫩，质地致密，味香浓，口感鲜佳，可见其商品性好，既避免实施例2脆性一般略酸的缺点，又具备实施例3发酵香味浓的优点，这证明L8+L9+Y9在感官评价(商品性)上同样具有正向协同增效作用，即发挥了协同作用。

同样地，对于茎用芥菜而言，对亚硝酸盐的降解效果大小依次为实施例4 (L8+L9+Y9)＞实施例5(L8+L9)＞实施例6(Y9)。具体地，降解亚硝酸盐效果：实施例4(L8+L9+Y9)显著好于实施例5(L8+L9)、极显著好于实施例6 (Y9)，这证明L8+L9+Y9对亚硝酸盐降解有显著的正向协同增效的作用，即发挥了协同作用。感官评价(商品性)综合评分大小依次为实施例4＞实施例5＞实施例6＞CK2。此外，实施例4的感官评价包括：色泽黄亮、脆嫩致密，味香浓郁，口感鲜佳，可见其商品性好，既避免实施例5微软的缺点，又具备实施例 6发酵香味浓的优点，这证明L8+L9+Y9在感官评价(商品性)上同样具有正向协同增效作用，即发挥了协同作用。

实施例7

选用实施例1制得的腌制芥菜(叶用)，使其通过持续通有臭氧O₃的水槽3 分钟，再切段通过无菌清水槽1分钟，然后压滤沥干→拌料→称重→添加保鲜剂→真空包装。其中，保鲜剂为0.3g/kg焦亚硫酸钠+1.0g/kg柠檬酸的水溶液。

实施例8

此实施例的实施步骤与实施例7相同，唯一区别是：未添加保鲜剂。

实施例9

此实施例的实施步骤与实施例7相同，唯一区别是：未使该腌制芥菜通过持续通有臭氧O₃的水槽。

对照例3(CK3)

选用实施例1制得的腌制芥菜(叶用)，切段通过无菌清水槽1分钟，然后压滤沥干→拌料→称重→真空包装。

对照例4(CK4)

选用对照例1制得的腌制芥菜(叶用)，切段后通过漂淡水槽漂洗28min，然后压滤沥干→拌料→称重→真空包装→95～98℃巴氏杀菌30min。

实施例10

选用实施例4制得的腌制芥菜(茎用)，使其通过持续通有臭氧O₃的水槽3 分钟，再切丝通过无菌清水槽1分钟，然后压滤沥干→拌料→称重→添加保鲜剂→真空包装。其中，保鲜剂为0.15g/kg山梨酸钾+0.3g/kg焦亚硫酸钠的水溶液。

实施例11

此实施例的实施步骤与实施例10相同，唯一区别是：未添加保鲜剂。

实施例12

此实施例的实施步骤与实施例10相同，唯一区别是：未使该腌制芥菜通过持续通有臭氧O₃的水槽。

对照例5(CK5)

选用实施例4制得的腌制芥菜(茎用)，切段通过无菌清水槽1分钟，然后压滤沥干→拌料→称重→真空包装。

对照例6(CK6)

选用对照例2制得的腌制芥菜(茎用)，切段后通过漂淡水槽漂洗28min，然后压滤沥干→拌料→称重→真空包装→95～98℃巴氏杀菌30min。并且，分别将实施例7-12与对照例3-6制得的产品常温贮藏70天之后，对这些产品的关键指标进行分析和比较，结果见下表4。

表4实施例7-12与对照例3-6制得的产品的综合评分

注：表4中褐变度值相同字母标注表示之间没有差异，不同字母标注(大写)表示之间差异达极显著水平(p＜0.01)。

其中，明度(L*)、黄度(b*)和褐变度意味着产品的商品性好坏，明度(L*)、黄度(b*)正向数字越大，意味产品越黄亮；褐变度数值越小，则意味着产品的褐变氧化程度越轻，产品的品质维持更佳。

表3表明：对于叶用芥菜而言，实施例7(O₃，SM+CA)、实施例8(O₃)、实施例9(SM+CA)的明度(L*)均＞40、黄度(b*)均＞20，明显地大于CK3 和CK4。具体地，明度(L*)和黄度(b*)的大小依次为实施例7＞实施例8＞实施例9＞CK4＞CK3。并且，CK3、CK4的褐变度则极显著高于实施例7(p＜ 0.01)、实施例8(p＜0.01)和实施例9(p＜0.01)。具体地，褐变度大小依次为 CK3＞CK4＞实施例9＞实施例8＞实施例7。此外，实施例7的感官评价包括：色泽黄亮、质地脆嫩、香味浓、口感鲜佳，可见其商品性好，并且实施例7综合了实施例8(O₃)的前期杀菌作用与实施例9(SM+CA)的后期品质维持作用，因此，在提高明度(L*)、黄度(b*)且遏制褐变度方面，尤其是遏制褐变度效果方面：实施例7极显著优于实施例8、实施例9，这证明(O₃)+(SM+CA) 表现出极显著的正向协同增效作用，即发挥了协同作用。

同样地，对于茎用芥菜而言，明度(L*)和黄度(b*)的大小依次为实施例 10(O₃，PS+SM)＞实施例11(O₃)＞实施例12(PS+SM)＞CK6＞CK5。并且，褐变度大小依次为CK5＞CK6＞实施例12＞实施例11＞实施例10。此外，实施例10的感官评价包括：色泽黄亮、脆嫩致密、香味浓、口感鲜佳，可见其商品性好，并且实施例10(O₃，PS+SM)综合了实施例11(O₃)的前期杀菌作用与实施例12(PS+SM)的后期品质维持作用，因此，在提高明度(L*)、黄度 (b*)且遏制褐变度方面，尤其是遏制褐变度效果方面：实施例10极显著优于实施例11、实施例12，这证明(O₃)+(PS+SM)表现出极显著的正向协同增效作用，即发挥了协同作用。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<120> 发酵剂与制备芥菜食品的方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1375

<212> DNA

<213> 短乳杆菌(Lactobacillus brevis)

<400> 1

gacgtgcttg cactgatttc aacaatgaag cgagtggcga actggtgagt aacacgtggg 60

aaatctgccc agaagcaggg gataacactt ggaaacaggt gctaataccg tataacaaca 120

aaatccgcat ggattttgtt tgaaaggtgg cttcggctat cacttctgga tgatcccgcg 180

gcgtattagt tagttggtga ggtaaaggcc caccaagacg atgatacgta gccgacctga 240

gagggtaatc ggccacattg ggactgagac acggcccaaa ctcctacggg aggcagcagt 300

agggaatctt ccacaatgga cgaaagtctg atggagcaat gccgcgtgag tgaagaaggg 360

tttcggctcg taaaactctg ttgttaaaga agaacacctt tgagagtaac tgttcaaggg 420

ttgacggtat ttaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt 480

aggtggcaag cgttgtccgg atttattggg cgtaaagcga gcgcaggcgg ttttttaagt 540

ctgatgtgaa agccttcggc ttaaccggag aagtgcatcg gaaactggga gacttgagtg 600

cagaagagga cagtggaact ccatgtgtag cggtggaatg cgtagatata tggaagaaca 660

ccagtggcga aggcggctgt ctagtctgta actgacgctg aggctcgaaa gcatgggtag 720

cgaacaggat tagataccct ggtagtccat gccgtaaacg atgagtgcta agtgttggag 780

ggtttccgcc cttcagtgct gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg gagtacgacc 840

gcaaggttga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt 900

aattcgaagc tacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cttctgccaa tcttagagat 960

aagacgttcc cttcggggac agaatgacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg 1020

tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta ttatcagttg ccagcattca 1080

gttgggcact ctggtgagac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa 1140

tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggacggta caacgagttg 1200

cgaagtcgtg aggctaagct aatctcttaa agccgttctc agttcggatt gtaggctgca 1260

actcgcctac atgaagttgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac 1320

gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccatgaga gtttgtaaca cccaa 1375

<210> 2

<211> 453

<212> DNA

<213> 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)

<400> 2

atcttgttca agactaaggt tggtaaagct tcaccagaaa tgtcatcagc aatgatcaac 60

aatggcttgc cttgttcaac gatggattgt aatagtggta agatatcttg aatgtttgaa 120

atcttcttat cagtaattaa gatatatgga ttgtcaagat ccgcttccat cttatcatta 180

tcagtaacca tgtattgtga taagtagccg cggtcgaatt gcatcccttc aacaacgtct 240

aagctagtat caacaccacg tgattcttca atcgtgataa caccgtcatg accaactttt 300

tccatggctt cggcaatcaa tttaccagtt tcttcacttg ctgaagatac agaagcgatt 360

tgcgcaatat cttcttgcgt cttaacttcg tgtgccatag cgtgtaatga gtcaaccgcc 420

gtcttagtag cttcttcaat cccacgacga atg 453

<210> 3

<211> 589

<212> DNA

<213> 酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 3

agacgggcgg catataacca ttatgccagc atccttgact tacgtcgcag tcctcagtcc 60

cagctggcag tattcccaca ggctataata cttaccgagg caagctacat tcctatggat 120

ttatcctgcc accaaaactg atgctggccc agtgaaatgc gagattcccc tacccacaag 180

gagcagaggg cacaaaacac catgtctgat caaatgccct tccctttcaa caatttcacg 240

tactttttca ctctcttttc aaagttcttt tcatctttcc atcactgtac ttgttcgcta 300

tcggtctctc gccaatattt agctttagat ggaatttacc acccacttag agctgcattc 360

ccaaacaact cgactcttcg aaggcacttt acaaagaacc gcactcctcg ccacacggga 420

ttctcaccct ctatgacgtc ctgttccaag gaacatagac aaggaacggc cccaaagttg 480

ccctctccaa attacaactc gggcaccgaa ggtaccagat ttcaaatttg agcttttgcc 540

gcttcactcg ccgttactaa ggcaatcccg gttggtttct tttcctccg 589

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aaggaggtga tccagcc 17

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tcctccgctt attgatatgc 20

Claims (10)

1.一种发酵剂，其特征在于，所述发酵剂包含野生益生菌，所述野生益生菌选自短乳杆菌L8、植物乳杆菌L9和酿酒酵母菌Y9中的至少一种；

其中，所述短乳杆菌L8的DNA序列如SEQ ID NO：1所示，所述植物乳杆菌L9的DNA序列如SEQ ID NO：2所示，所述酿酒酵母菌Y9的DNA序列如SEQ ID NO：3所示。

2.一种制备芥菜食品的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：预处理芥菜原料，得到预处理后的芥菜；

S2：向所述预处理后的芥菜中添加发酵剂和腌制专用盐，进行腌制，制得腌制芥菜；

S3：对所述腌制芥菜实施保鲜处理，制得芥菜食品；

其中，所述芥菜原料为叶用芥菜原料或茎用芥菜原料；

其中，所述发酵剂包含野生益生菌，所述野生益生菌选自短乳杆菌L8、植物乳杆菌L9和酿酒酵母菌Y9中的至少一种；

其中，所述短乳杆菌L8的DNA序列如SEQ ID NO：1所示，所述植物乳杆菌L9的DNA序列如SEQ ID NO：2所示，所述酿酒酵母菌Y9的DNA序列如SEQ ID NO：3所示。

3.根据权利要求2所述的制备芥菜食品的方法，其特征在于，所述野生益生菌由所述短乳杆菌L8、所述植物乳杆菌L9和所述酿酒酵母菌Y9组成，并且，所述短乳杆菌L8、所述植物乳杆菌L9和所述酿酒酵母菌Y9的质量比选自以下任一种：

1)1：1：1；

2)1：1：2；

3)1：2：1；以及

4)2：1：1。

4.根据权利要求2所述的制备芥菜食品的方法，其特征在于，

在所述芥菜原料为叶用芥菜原料的情况下，步骤S1包括：对所述叶用芥菜原料依次实施以下步骤：清洗、沥干、微堆黄，得到预处理后的叶用芥菜；或

在所述芥菜原料为茎用芥菜原料的情况下，步骤S1包括：对所述茎用芥菜原料依次实施以下步骤：清洗、沥干、亚风干，得到预处理后的茎用芥菜。

5.根据权利要求2所述的制备芥菜食品的方法，其特征在于，所述发酵剂的接菌量为3～5％，所述腌制专用盐的添加量为5～10％。

6.根据权利要求2所述的制备芥菜食品的方法，其特征在于，步骤S2中所述腌制的持续时间为10-25天。

7.根据权利要求2所述的制备芥菜食品的方法，其特征在于，步骤S3中所述保鲜处理包括：臭氧处理所述腌制芥菜，然后添加保鲜剂。

8.根据权利要求7所述的制备芥菜食品的方法，其特征在于，所述保鲜剂包含：

1)焦亚硫酸钠与柠檬酸；或

2)山梨酸钾与焦亚硫酸钠。

9.根据权利要求7所述的制备芥菜食品的方法，其特征在于，所述臭氧处理的持续时间为1-9分钟。

10.一种根据权利要求2-9中任一项所述方法制得的芥菜食品。

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