CN116376759A - 一种植物乳杆菌的增殖方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物乳杆菌的增殖方法，包括筛选植物乳杆菌、活化、增殖培养的步骤，获得植物乳杆菌HYY‑DB9，并将植物杆菌HYY‑DB9应用到果酱的发酵工艺中。由于植物乳杆菌HYY‑DB9优异的安全性和益生性，且具有高产酸、高亚硝酸盐降解率以及耐酸、耐胆盐、抗生素敏感性、抑菌性的特点，能保证果酱发酵质量，减少果酱的氧化褐变，能促进原料中有效成分的释放，促进人体肠道健康。
Description
技术领域
本发明涉及微生物筛选及应用领域，具体而言，涉及一种植物乳杆菌的增殖方法及其应用。
背景技术
市面上的黑柿子果肉中含有极易氧化的单宁，故在加工果酱过程中容易产生褐变和复湿等问题，而且还会导致产品加工和发酵不稳定，色泽变化大，造成黑柿子酱口感不适、色泽不理想、营养价值低和果酱的质量不理想的情况。因此，寻找一种使得黑柿酱不易氧化、褐变，且口感更佳的方案具有极其重要的意义。
发明内容
基于此，为了解决黑柿子酱容易氧化褐变以及发酵不稳定的问题，本发明提供了一种植物乳杆菌的增殖方法及其应用，具体技术方案如下：
一种植物乳杆菌的增殖方法，所述增殖方法包括以下步骤：
筛选植物乳杆菌；
将所述植物乳杆菌接种至MRS培养基中活化，得到种子液；
将所述种子液添加至增殖培养基中，静置培养16～24h，得到增殖后的植物乳杆菌；
其中，所述植物乳杆菌的命名为Lactiplantibacillus plantarum HYY-DB9，于2022年9月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏编号为GDMCC NO.62815。
进一步地，所述植物乳杆菌HYY-DB9从发酵泡菜水中分离得到。
进一步地，所述培养基的成分按照质量比，包括以下成分：2.8％～3.0％蔗糖、2.5％～2.8％鱼胶原蛋白肽、0.2％～0.5％磷酸氢二钾、0.2％～0.3％柠檬酸三铵、0.5％～0.7％乙酸钠、0.2％～0.3％七水硫酸镁、0.002％～0.006％四水硫酸锰、0.1％～0.3％吐温80、0.018％～0.022％半胱氨酸、0.5％～1％锌、0.2％～0.25％维生素。
进一步地，所述培养基中的初始pH为5.0～5.8。
进一步地，静置培养的温度为30℃～40℃。
进一步地，所述植物乳杆菌HYY-DB9按3％～4％(v/v)的接种量接种到增殖培养基中。
另外，本申请还提供一种植物乳杆菌HYY-DB9的应用，所述应用为所述植物乳杆菌HYY-DB9在果酱的制备中的应用。
进一步地，所述果酱的制备方法如下：
S1.挑选成熟、无病虫害的水果，清洗后，加入到乙醇溶液中浸泡24h脱涩；
S2.将步骤S1的水果块洗净去皮去核，放入护色剂和抗氧化剂中进行护色处理8min-10min；
S3.将步骤S2的水果块放入破壁机打成浆，加入0.4％～0.5％(m/m)的果胶酶和0.2％～0.3％(m/m)的纤维素酶，于60℃下加热5min后，在50目中过筛浆液，过筛后的水果汁在80℃条件下加热并杀菌20min，得到水果原浆；
S4.将所述植物乳杆菌HYY-DB9进行活化和扩大培养；
S5.用碳酸钠调节步骤S3灭菌后的水果原浆的pH值至6.4，然后接入步骤S4活化后的植物乳杆菌HYY-DB9进行发酵；发酵时间为24h，得到发酵水果浆；
S6.将发酵水果浆、葡萄糖、蔗糖、明胶、果胶以及防腐剂混合均匀，得到混合液；
S7.将步骤S6所述的混合液在50℃～60℃、20Mpa的压力下均质处理，得到混合料；
S8.将步骤S7所述的混合料置于0.05Mpa～0.1Mpa真空度的真空浓缩锅内浓缩10min～20min，待酱体可溶性固形物为50％～65％(v/v)时，停止浓缩，待温度下降至70℃～75℃时，进行罐装，罐装后立即密封，121℃的蒸汽杀菌20min，冷却，得到果酱。
进一步地，所述水果为黑柿子。
进一步地，所述乙醇的质量百分比浓度为1％～3％。
上述方案中加入特定的植物乳杆菌HYY-DB9添加至果酱发酵工艺中，由于其优异的安全性和益生性，具有高产酸、高亚硝酸盐降解率以及耐酸、耐胆盐、抗生素敏感性、抑菌性的特点，能保证发酵质量，有助于减少氧化褐变，且能促进原料中有效成分的释放，促进其消化吸收率，促进人体肠道健康。
附图说明
图1为本发明实施例1中植物乳杆菌HYY-DB9的菌落形态示意图；
图2为本发明实施例2植物乳杆菌HYY-DB9的革兰氏染色结果示意图。
具体实施方式
为了使得本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合其实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用以解释本发明，并不限定本发明的保护范围。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明一实施例中的一种植物乳杆菌的增殖方法，所述增殖方法包括以下步骤：
筛选植物乳杆菌；
将所述植物乳杆菌接种至MRS培养基中活化，得到种子液；
将所述种子液添加至增殖培养基中，静置培养16～24h，得到增殖后的植物乳杆菌；
其中，所述植物乳杆菌的命名为Lactiplantibacillus plantarum HYY-DB9，于2022年9月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心)，菌种保藏编号为GDMCC NO.62815。
在其中一个实施例中，所述植物乳杆菌HYY-DB9从发酵泡菜水中分离得到。
在其中一个实施例中，所述培养基的成分按照质量比，包括以下成分：2.8％～3.0％蔗糖、2.5％～2.8％鱼胶原蛋白肽、0.2％～0.5％磷酸氢二钾、0.2％～0.3％柠檬酸三铵、0.5％～0.7％乙酸钠、0.2％～0.3％七水硫酸镁、0.002％～0.006％四水硫酸锰、0.1％～0.3％吐温80、0.018％～0.022％半胱氨酸、0.5％～1％锌、0.2％～0.25％维生素。
在其中一个实施例中，所述培养基中的初始pH为5.0～5.8。
在其中一个实施例中，静置培养的温度为30℃～40℃。
在其中一个实施例中，所述植物乳杆菌HYY-DB9以3％～4％(v/v)的接种量接种到增殖培养基中。
另外，本申请还提供一种植物乳杆菌HYY-DB9的应用，所述应用为所述植物乳杆菌HYY-DB9在果酱的制备中的应用。
在其中一个实施例中，所述果酱的制备方法如下：
S1.挑选成熟、无病虫害的水果，清洗后，加入到乙醇溶液中浸泡24h脱涩；
S2.将步骤S1的水果块洗净去皮去核，放入护色剂和抗氧化剂中进行护色处理8min～10min；
S3.将步骤S2水果块放入破壁机打成浆，加入0.4％～0.5％的(m/m)果胶酶和0.2％～0.3％(m/m)的纤维素酶，于60℃下加热5min后，在50目中过筛浆液，过筛后的水果汁在80℃下加热并杀菌20min，得到水果原浆；
S4.将所述植物乳杆菌HYY-DB9进行活化和扩大培养；
接入步骤4活化后的植物乳杆菌HYY-DB9进行发酵；发酵时间为24h，得到发酵水果浆；
S6.将发酵水果浆、葡萄糖、蔗糖、明胶、果胶以及防腐剂混合均匀，得到混合液；
S7.将步骤S6所述的混合液在50℃～60℃、20Mpa的压力下均质处理，得到混合料；
S8.将步骤S7所述的混合料置于0.05Mpa～0.1Mpa真空度的真空浓缩锅内浓缩10min～20min，待酱体可溶性固形物为50％～65％(v/v)时，停止浓缩，待温度下降至70℃～75℃时，进行罐装，罐装后立即密封，在121℃的蒸汽条件下杀菌20min，冷却，得到果酱。
在其中一个实施例中，所述水果为黑柿子。
在其中一个实施例中，所述乙醇的质量百分比浓度为1％～3％。
在其中一个实施例中，所述护色剂为异构抗坏血酸钠。
在其中一个实施例中，所述抗氧化剂为柠檬酸。
在其中一个实施例中，所述防腐剂为乙二胺四乙酸二钠。
在其中一个实施例中，所述植物乳杆菌HYY-DB9进行活化和扩大培养为：将植物乳杆菌HYY-DB9接入到培养基中，于37℃培养24h，再按照质量比1:100加入到新的培养基中，进行扩大培养。
在其中一个实施例中，所述果酱的重量份包括以下原料：55％～75％黑柿子、7％～9％水、0.4％～0.5％果胶酶、0.2％～0.3％纤维素酶、2％～4％异构抗坏血酸钠、2％～3％柠檬酸、1％～2％碳酸钠、2％～3％葡萄糖、4％～6％蔗糖，1％～2％明胶，2％～3％果胶和1％～2％乙二胺四乙酸二钠。
在其中一个实施例中，所述植物乳杆菌HYY-DB9在发酵水果浆中的添加接种量为1.0×108～6.0×108CFU/mL。
在其中一个实施例中，所述护色剂的添加占果酱总质量的2％～4％。
在其中一个实施例中，所述抗氧化剂占所述果酱总质量的2％～3％。
上述方案中加入特定的植物乳杆菌HYY-DB9添加至果酱发酵工艺中，由于植物乳杆菌HYY-DB9优异的安全性和益生性，且具有高产酸、高亚硝酸盐降解率以及耐酸、耐胆盐、抗生素敏感性、抑菌性的特点，能保证果酱发酵质量，减少果酱的氧化褐变，能促进原料中有效成分的释放，促进人体肠道健康。
下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例1：
植物乳杆菌HYY-DB9的分离与鉴定：
实验材料：采自东北农家自然发酵泡菜水，吸取40mL泡菜水放入无菌离心管中，置于食品采样箱内，放于实验室4℃冰箱保存备用。
植物乳杆菌的分离纯化：
分别取1mL泡菜水样品，用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释至10-6，然后分别取10-4、10-5、10-6 3个梯度的稀释液100μL在含有碳酸钙的平板上进行涂布，36℃～37℃密闭培养24～48h，观察并记录菌落形态。挑取平板上不同形态的菌落进行划线分离，经在温度36℃～37℃密闭培养24～48h，再次挑取平板上不同形态的单菌落进行划线分离，如此重复2至3次，直至得到形态一致的纯的单菌落，即为植物乳杆菌。
编号为HYY-DB9的菌株菌落形态如图1所示，菌落颜色多为白色或乳白色，形状为圆形，边缘整齐，表面湿润光滑。
实施例2：
对实施例1得到植物乳酸杆菌进行鉴定：
挑取平板上的纯菌落接种于10mL MRS液体培养基中，37℃培养24h。取上述含菌培养基1mL于无菌离心管中，5000r/min离心2min后弃去上层培养基，菌体沉淀重悬于无菌生理盐水并进行革兰氏染色镜检，革兰氏染色镜检为阳性的初步鉴定为乳酸菌。
编号为HYY-DB9的菌株革兰氏染色呈现阳性，菌株细胞形态如图2所示，细胞形态呈短杆，且不存在出芽生殖。
实施例3：
对高产酸量植物乳杆菌的筛选：
将实施例1植物乳杆菌活化两次并扩大培养后用无菌生理盐水洗菌两次制备成菌悬液，按照2％(v/v)的接种量接入发酵培养基中置于37℃培养箱中厌氧培养，发酵72h后取样采用酸碱滴定法测定总酸含量。结果如表1所示。
表1：实施例1的植物乳杆菌HYY-DB9和其他4株乳酸菌滴定总酸含量
实施例5：
植物乳杆菌降解亚硝酸盐的测试：
称取0.2g亚硝酸钠用超纯水定容至100mL，即配成浓度为2000μg/mL的亚硝酸钠溶液，然后用超纯水分别配置成浓度为0，50，100，150，200μg/mL的亚硝酸钠溶液，然后再分别取1mL加入9mL用超纯水配置的MRS肉汤培养基中，混匀，即配成浓度为0，5μg/m，10μg/m，15μg/m，20μg/mL的亚硝酸钠溶液。用格里斯反应比色法在538nm的波长下测定其吸光度值，绘制标准曲线；
将斜面保藏的菌株于MRS肉汤培养基中活化两次后按照2％(v/v)的接种量接种于亚硝酸钠培养基中，置于37℃恒温培养箱中厌氧培养，分别在0h，6h，12h，24h，36h，48h，60h，72h，96h，120h取样，用格里斯反应比色法测定样品中亚硝酸钠含量。具体测定方法如下：
定期取发酵液离心(10000r/min，5min，4℃)，取上清液稀释至合适的浓度后取1mL于具塞比色管中，分别加入显色剂①②③各1mL，摇匀，在暗处反应5min，用超纯水定容至10mL，混匀，在538nm下测定吸光值。根据标准曲线计算发酵液中的亚硝酸钠含量，并计算降解率。
降解率(％)＝发酵液中亚硝酸钠含量/初始培养基中亚硝酸钠含量×100％
挑选出了其中各项性能最好、最适合的一株菌株。结果如表2所示。
表2：
从表2可以看出，本申请的植物乳杆菌HYY-DB9具有较高的亚硝酸盐降解率。
实施例6：植物乳杆菌HYY-DB9和其他4株乳酸菌耐酸耐胆盐能力如下表3所示。
表3：
注：“+++”表示生长良好；“++”表示生长一般；“+”表示生长较弱；“-”表示不生长。
从表3中分析可知：本申请的植物乳杆菌具有较强的耐酸、耐胆盐能力。
实施例7：植物乳杆菌的抗生素敏感性采用滤纸片扩散法分析，得到的抗生素敏感性如下表4所示。
表4：
注：“S”表示敏感(r≥1cm)；“M”表示中度敏感(r≥0.5cm)；“R”表示耐药(r＜0.1cm)。
从表4分析可知，本申请的植物乳杆菌具有优异的耐药性，具有更广阔的使用性能。
实施例8：抑菌性
在营养琼脂培养基上水平放置牛津杯，在牛津杯中分别加入菌液，37℃培养24h，用游标卡尺测量抑菌圈直径。结果如表5所示。
表5：
从表5中的数据分析可知，本申请从泡菜中提取的植物乳杆菌，具有优异的抑菌作用，对有害菌的抑制，能保证其其应用的安全性。
实施例9：
植物乳杆菌HYY-DB9的发酵工艺如下：
为探讨不同的碳源对植物乳杆菌HYY-DB9发酵的影响，以MRS培养基为基础，采用不同浓度的乳糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、阿拉伯糖替代MRS培养基中的碳源(葡萄糖)，设置不加碳源的培养基为空白对照，MRS培养基为阴性对照。接种对数生长期的植物乳杆菌HYY-DB9，37℃培养24h，测定OD600nm，根据菌体生长情况优劣选取最佳碳源。结果，蔗糖培养植物乳杆菌HYY-DB9得到的菌体密度最大，其次为乳糖和甘露糖。因此选用质量分数为2.8％的蔗糖进行下一步研究。
为探讨不同的氮源对植物乳杆菌HYY-DB9发酵的影响，以MRS培养基为基础，采用不同浓度的牛肉膏、酵母提取物、胰蛋白胨、细菌学蛋白胨、麦芽提取物、鱼胶原蛋白肽替代MRS培养基中的氮源，设置不加氮源的培养基为空白对照，MRS培养基为阴性对照。接种对数生长期的植物乳杆菌HYY-DB9，37℃培养24h，测定OD600nm，根据菌体生长情况优劣选取最佳氮源。结果，质量分数为2.5％鱼胶原蛋白肽培养的植物乳杆菌HYY-DB9的菌体密度大于MRS，且对数期由12h缩短为8h，活菌数高于未加蛋白胨的对照组，由此说明鱼胶原蛋白肽可缩短生长周期同时提高最大活菌数。
为探讨不同的微量元素对植物乳杆菌HYY-DB9发酵的影响，以MRS培养基为基础，采用不同浓度的微量元素(包括锰、铜、镁、铁、锌)替代MRS培养基中的微量元素，设置不加微量元素的培养基为空白对照，MRS培养基为阴性对照。接种对数生长期的植物乳杆菌HYY-DB9，37℃培养24h，测定OD600nm，根据菌体生长情况优劣选取最佳微量元素种类。结果，质量分数为1％的锌对应的MRS的菌体密度最高，因此选用1％的锌进行下一步研究。
为探讨不同浓度的维生素C、维生素B、复合维生素B添加量对植物乳杆菌HYY-DB9发酵的影响，以不添加维生素的MRS培养基为对照。接种对数生长期的植物乳杆菌HYY-DB9，37℃培养24h，测定活菌数，根据菌体生长情况优劣选取最佳维生素及其浓度。结果，添加0.25％维生素B(m/m)后培养植物乳杆菌HYY-DB9得到的菌体密度最大。
从结果得出，优化后的培养基为：按照质量比，包括以下成分：2.8％蔗糖、2.5％鱼胶原蛋白肽、0.2％磷酸氢二钾、0.2％柠檬酸三铵、0.5％乙酸钠、0.2％七水硫酸镁、0.006％四水硫酸锰、0.1％吐温80、0.018％半胱氨酸、1％锌、0.25％维生素B。
本申请中通过在增殖培养基中添加鱼胶原蛋白肽，能促进植物乳杆菌生长繁殖，能有助于后续的发酵使用。
实施例10：
植物乳杆菌HYY-DB9在黑柿子果酱中的应用：
原料预处理:挑选成熟、无病虫害的黑柿，清洗后,加入到1％乙醇溶液中浸泡24h；
将黑柿子块洗净去皮去核,放入2％～4％(m/m)的异构抗坏血酸钠和2％～3％(m/m)柠檬酸中进行护色处理8min～10min；
将黑柿子块放入破壁机打成浆，加入0.4％～0.5％(v/v)的果胶酶和0.2％～0.3％(v/v)的纤维素酶，60℃下加热5min,在50目中过滤浆液，滤后的黑柿子汁在80℃下加热并杀菌20min，得到黑柿子原浆；
乳酸菌的活化和扩大培养:将乳酸菌粉剂接入到质量比为2.8％蔗糖、2.5％鱼胶原蛋白肽、0.2％磷酸氢二钾、0.2％柠檬酸三铵、0.5％乙酸钠、0.2％七水硫酸镁、0.006％四水硫酸锰、0.1％吐温80、0.018％半胱氨酸、1％锌、0.25％维生素B的培养基中，37℃培养24h，再按照质量比1:100加入到新的培养基中，进行扩大培养；
用灭菌后的碳酸钠调节发酵黑柿子汁的pH值至6.4，接入活化后的乳酸菌进行发酵，乳酸菌接种量为3.0×108CFU/mL，发酵时间为24h；
在处理好的乳酸菌发酵黑柿子原浆取55％～75％黑柿子汁，加入质量比为7％～9％水、2％～4％异构抗坏血酸钠、2％～3％柠檬酸、2％碳酸钠、2％～3％葡萄糖、4％～6％蔗糖，1％～2％明胶，2％～3％果胶和1％～2％乙二胺四乙酸二钠，混合均匀，制得混合液；
将调配好的混合液在50～60℃、20Mpa～40Mpa的压力下均质，均质2～4次；
将混合料置于0.05Mpa～0.1Mpa真空度的真空浓缩锅内浓缩10min～20min，待酱体可溶性固形物为50％～65％(v/v)时，停止浓缩；
浆液温度下降至70～75℃时罐装,罐装后立即密封；
将装罐后的果酱罐放入杀菌箱内,用121℃的蒸汽杀菌20min,然后逐渐冷却,低温储藏。
将得到的果酱进行相关测试，结果可知采用本申请的植物乳杆菌HYY～DB9进行发酵，得到的果酱具有更优异的稳定性，且同时加入抗氧化剂，具有较好的保护作用，将黑柿子用于这种护色液中加工，褐变的主体得到了很好的控制，整个加工过程中黑柿子处于稳定状态，保持了原有的色、香、味。由于在黑柿子汁中加入乳酸菌，进行了乳酸发酵，由于乳酸菌的蛋白酶活性使其在发酵过程中产生大量的氨基酸，部分糖转化为乳酸和其他有机酸，使黑柿子酱具有较高生物价值，同时也增加了维生素B的含量，能够有效促进原料中有效成分的释放,增加黑柿子果酱中的有效成分和保健功能，且提高了产品的营养价值，改善了黑柿子汁风味及口感，增多了黑柿子的深加工产品种类。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (7)
1.一种植物乳杆菌的增殖方法，其特征在于，所述增殖方法包括以下步骤：
筛选植物乳杆菌；
将所述植物乳杆菌接种至MRS培养基中活化，得到种子液；
将所述种子液添加至增殖培养基中，静置培养16～24h，得到增殖后的植物乳杆菌；
其中，所述植物乳杆菌的命名为Lactiplantibacillus plantarum HYY-DB9，于2022年9月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏编号为GDMCC NO.62815。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述植物乳杆菌HYY-DB9从发酵泡菜水中分离得到。
3.根据权利要求1所述的增殖方法，其特征在于，所述培养基的成分按照质量比，包括以下成分：2.8％～3.0％蔗糖、2.5％～2.8％鱼胶原蛋白肽、0.2％～0.5％磷酸氢二钾、0.2％～0.3％柠檬酸三铵、0.5％～0.7％乙酸钠、0.2％～0.3％七水硫酸镁、0.002％～0.006％四水硫酸锰、0.1％～0.3％吐温80、0.018％～0.022％半胱氨酸、0.5％～1％锌、0.2％～0.25％维生素。
4.一种植物乳杆菌HYY-DB9的应用，其特征在于，所述应用为所述植物乳杆菌HYY-DB9在果酱的制备中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述果酱的制备方法如下：
S1.挑选成熟、无病虫害的水果，清洗后，加入到乙醇溶液中浸泡24h脱涩；
S2.将步骤S1的水果块洗净去皮去核，放入护色剂和抗氧化剂中进行护色处理8～10min；
S3.将步骤S2中的水果块放入破壁机打成浆，加入0.4％～0.5％(m/m)的果胶酶和0.2％～0.3％的纤维素酶(m/m)，于60℃下加热5min后，在50目中过筛浆液，过筛后的水果汁在80℃下加热并杀菌20min，得到水果原浆；
S4.将所述植物乳杆菌HYY-DB9进行活化和扩大培养；
S5.将灭菌后的氢氧化钠加到步骤S3所述水果原浆，将其pH值调节至6.4，然后接入步骤S4活化后的植物乳杆菌HYY-DB9进行发酵；发酵时间为24h，得到发酵水果浆；
S6.将发酵水果浆、葡萄糖、蔗糖、明胶、果胶以及防腐剂混合均匀，得到混合液；
S7.将步骤S6所述的混合液在50℃～60℃，20Mpa；的压力下均质处理，得到混合料；
S8.将步骤S7所述的混合料置于0.05Mpa～0.1Mpa真空度的真空浓缩锅内浓缩10min～20min，待酱体可溶性固形物为50％～65％(v/v)时，停止浓缩，待温度下降至70℃～75℃时，进行罐装，罐装后立即密封，在121℃的蒸汽条件下杀菌20min，冷却，得到果酱。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述水果为黑柿子。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述乙醇的质量百分比浓度为1％～3％。
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