CN1769426B

CN1769426B - 一种戊糖乳杆菌细菌素及其专用生产菌株与应用

Info

Publication number: CN1769426B
Application number: CN2005101059855A
Authority: CN
Inventors: 李平兰; 吕燕妮; 沈清武; 周伟; 马长伟; 傅鹏
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2005-10-08
Filing date: 2005-10-08
Publication date: 2010-04-14
Anticipated expiration: 2025-10-08
Also published as: CN1769426A

Abstract

本发明公开了一种戊糖乳杆菌细菌素及其专用生产菌株与应用。本发明所提供的戊糖乳杆菌细菌素，是发酵戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)RT-6CGMCC№1356，得到细菌素。该细菌素对热、酸稳定，可被蛋白酶降解，不会在人体内残留，安全而稳定，抑菌谱广，可抑制众多食品腐败菌，具有作为食品防腐剂应用的良好前景。以戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)RT-6CGMCC №1356为发酵剂生产的发酵肉制品食用安全，感观品质好，营养丰富。

Description

一种戊糖乳杆菌细菌素及其专用生产菌株与应用

技术领域

本发明涉及生物领域中一种戊糖乳杆菌细菌素及其专用生产菌株与应用。

背景技术

细菌素是细菌通过核糖体合成机制生成的一类蛋白或肽类物质，最初被发现存在于细菌之间的拮抗作用中。近年来随着研究的深入，乳酸菌产生的细菌素被发现可作为具有抑菌活性的蛋白类物质而具有作为食品天然防腐剂应用的前景。某些乳酸菌细菌素能抑制食品中常见的腐败菌和一些病原菌。乳酸菌细菌素具有相对稳定的化学性质和强的抑菌活性，可广泛应用于食品天然防腐剂的开发。目前，我国的食品防腐剂多数为化学防腐剂，长期食用将会影响人体的健康。细菌素作为一种蛋白、肽类的物质，抑菌活性强，对热、酸等稳定性好，可被酶作用而降解，不会在人体内残留，具有较高的安全性，在食品中的应用范围广。

另外将细菌素产生菌株作为发酵剂应用于发酵肉制品的生产也是细菌素在食品中应用的实现方式之一。发酵香肠最初是由古罗马人生产的一种发酵肉制品，是将绞碎的肉与盐、糖、香辛料混合后灌进肠衣，在加工过程中经过微生物的发酵作用而制成的具有独特风味的发酵肉制品。发酵肉制品的生产方式有自然发酵和接种发酵剂两种。其中自然发酵易受杂菌感染，发酵过程启动慢，发酵周期长；而接种发酵剂是通过接种优良的肉制品发酵菌种进行工业化生产，缩短了发酵周期，提高了产品质量的稳定性和安全性，有利于工艺的控制。虽然发酵香肠品种繁多，工艺各不相同，但接种发酵已经成为目前生产使用的主要方法，而优良肉制品发酵剂菌株是接种发酵的基础，并且是保证发酵香肠独特风味的基础。发酵肉制品中经常使用的发酵剂包括细菌、酵母和霉菌等。1940年，美国人L.B.Jenson在专利中第一次描述了乳酸菌在发酵香肠中的应用，从而开始了使用纯培养的微生物发酵剂生产发酵香肠的第一步；1974年Everson等申请了植物乳杆菌的专利。目前，国外发酵肉制品的主要研究内容之一就是加强优良微生物发酵剂菌种的选育工作，通过筛选与育种，发现具有优良性状的微生物发酵剂菌种是研究的中心目标。其中产细菌素发酵剂的筛选也是研究热点之一，产细菌素发酵剂菌株在发酵香肠生产过程中可以产生细菌素，使发酵香肠不易受杂菌污染，保证了发酵过程的稳定性及产品的安全性。

发明内容

本发明的目的是提供一株产细菌素的戊糖乳杆菌。

本发明所提供的戊糖乳杆菌，是戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)RT-6，已于2005年04月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC №1356。

戊糖乳杆菌(Lactobacillus pen tosus)RT-6CGMCC№1356用MRS培养基从市售发酵肉制品中分离得到。在MRS培养基上，菌落为乳白色圆形或梭形，菌体为两端钝圆短小直杆或弯杆状，成对或成短链排列，菌体大小为0.5-0.7μm×1-3μm，为无芽孢革兰氏阳性杆菌。根据如下生理生化特征：从葡萄糖、麦芽糖、乳糖、甘露糖、鼠李糖、水杨苷、半乳糖、木糖、麦芽糖、山梨醇、蔗糖、蜜二糖、纤维二糖、果糖、葡萄糖酸盐、甘露醇、菊糖、阿拉伯糖产酸阳性，从棉子糖不产酸，从葡萄糖不产气，可生长于6.5％NaCl，可厌氧生长，V.P.试验反应阳性，H₂O₂酶试验、从精氨酸产NH₃、产H₂S试验反应阴性等指标并结合形态特征鉴定为乳杆菌属，经形态学、生理生化特征及Biolog微生物全自动分析仪鉴定为戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)。该菌株具有较高抑菌活性，对多株食品腐败菌具有抑菌作用。

本发明的第二个目的是提供一种细菌素及其生产方法。

本发明所提供的戊糖乳杆菌细菌素，是发酵戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus)RT-6CGMCC№1356得到的细菌素。

所述方法中，用于培养戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)RT-6CGMCC№1356的最佳培养基可采用改良MRS培养基，其成分为：乳糖2％、胰胨2％、豆胨2％、牛肉膏3％、蛋白胨2％、吐温800.1％、磷酸氢二钾0.2％、乙酸钠0.5％、柠檬酸铵0.2％、硫酸镁0.058％、硫酸锰0.025％，蒸馏水1000ml，pH值6.5；所述百分含量均为质量百分含量。

所述方法中的培养条件为37℃，静置培养24h。

所述方法中，得到的细菌素可按照以下步骤进行纯化：

按所述培养方法得到的发酵液经5000rmp 4℃离心10min取上清液，向该上清液中加入硫酸铵固体粉末进行盐析，边加边搅拌，至终饱和度为70％，然后于4℃冰箱中静置12h，待其完全沉淀，6000rpm 4℃离心15min，弃去上清液取沉淀，得到细菌素沉淀物；将该细菌素沉淀物复溶后进一步采用SP Sepharose Fast Flow阳离子交换树脂进行离子交换层析纯化；所述离子交换层析条件为：流速1.2ml/min，用pH5.5含0.1M NaCl的0.02M醋酸缓冲液进行洗脱，每2min接收一管，收集保留时间为78min-88min的蛋白峰为细菌素活性峰。

上述方法得到的细菌素也属于本发明的保护范围。

戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)RT-6CGMCC№1356，或与其他微生物配合使用可作为发酵肉制品的发酵剂。其他微生物主要是指木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)等。其中接入发酵香肠时戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus)RT-6CGMCC№1356的用量可为10⁶-10⁷cfu/g肉馅。以戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)RT-6CGMCC№1356为发酵剂生产的发酵肉制品食用安全，感观品质好，营养丰富。

戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)RT-6CGMCC№1356产生的细菌素对热、酸稳定，在80℃热处理15min后活性基本不变，在121℃15min仍保持较好的活性；在pH2-8范围内保持稳定，当pH值大于9时，活性逐渐降低。可被蛋白酶降解，不会在人体内残留，安全而稳定：可被胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶完全失活，可被α-淀粉酶部分失活。该细菌素抑菌谱广，可抑制众多食品腐败菌，可抑制乳杆菌属、链球菌属中的大部分菌株，还可抑制片球菌属、单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、假单胞菌、大肠杆菌、芽孢杆菌中的部分菌株。该细菌素的抑菌作用效果明显，在3-5小时内可降低敏感菌活细胞2-3个数量级。戊糖乳杆菌细菌素具有较好的热、酸稳定性及较高的安全性，具有作为食品防腐剂应用的良好前景。本发明将为新型天然食品防腐剂的开发应用及肉类加工业提供技术支持，提高肉制品产品档次，增加肉制品的技术含量及经济价值。

附图说明

图1为细菌总数的变化曲线

图2为乳酸菌的变化曲线

图3为肠杆菌的变化曲线

图4为葡萄球菌和微球菌的变化曲线

图5为酵母菌数量变化曲线

图6为发酵香肠pH的变化曲线

图7为发酵香肠水分的变化曲线

图8为发酵香肠总游离氨基酸的变化曲线

图9为发酵香肠的风味剖面分析

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1、利用戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)RT-6CGMCC№1356生产细菌素

1、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)RT-6CGMCC№1356的抑菌活性分析

抑菌活性分析方法：先将指示菌植物乳杆菌L.plantarum PL-2CGMCC№1.3919(中国普通微生物菌种保藏中心)稀释至10⁷cfu/ml，倾注15ml MRS固体培养基(其成分是：牛肉膏10g、蛋白胨10g、酵母浸膏5g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸二铵2g、乙酸钠5g、葡萄糖20g、七水硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、吐温801ml、琼脂15g、蒸馏水1000ml，pH值6.5-6.8，所述百分含量均为质量百分含量)，将牛津杯轻轻放置于平板上，将离心上清液加入牛津杯后于4℃冰箱中扩散5h以上，然后37℃培养24h观察抑菌圈的出现。按照如下方法(管碟法)测定细菌素的抑菌活性单位。细菌素抑菌活力的表示方法(效价值AU/ml)：将发酵上清液用pH6.5的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液进行二倍稀释，取样100μl进行抑菌实验，观察不到抑菌圈出现的最高稀释度定义为一个活力单位(1AU)，其倒数即是原液的细菌素效价值AU/ml。

将戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)RT-6CGMCC№1356接入改良MRS培养基，其成分为：乳糖2％、胰胨2％、大豆蛋白胨2％、牛肉膏3％、蛋白胨2％、吐温800.1％、磷酸氢二钾0.2％、乙酸钠0.5％、柠檬酸铵0.2％、硫酸镁0.058％、硫酸锰0.025％，蒸馏水1000ml，pH值6.5；所述百分含量均为质量百分含量。在37℃下静置培养24h，将得到的发酵液经12000rpm离心20min，收集上清液。进行以下(1)-(3)的实验：

(1)排除有机酸的干扰：将得到的上清液用2.5M的NaOH溶液中和至中性，振荡均匀，使pH值达到6.5-7.0，做抑菌实验，比较中和酸前后抑菌圈差异。

(2)排除离心上清液菌体残留细胞的影响：将离心上清液用微孔滤膜(尺寸Φ25，孔径0.22μm)的细菌过滤器过滤除菌后做抑菌实验，排除离心上清液中残留的菌体细胞对抑菌实验的影响。

(3)蛋白质的初步分离：将硫酸铵粉末缓缓加入30ml离心上清液中，边加边搅拌，使最终饱和度为70％，可看到有絮状沉淀出现，置于4℃冰箱中静置沉淀12h，6000rpm 4℃冷冻离心15min，将沉淀复溶于3ml pH7.0的磷酸缓冲液中，做抑菌实验，同时以饱和硫酸铵溶液和磷酸缓冲液作为对照。然后将剩余的复溶液装于8000～12000Da的透析袋中脱盐，对蒸馏水透析过夜，其中更换三次透析液，然后检测抑菌活性。

排除H₂O₂的干扰：在MRS培养基上补充0.75％(质量百分含量)的二氧化锰和0.5％(质量百分含量)黄原胶，接种戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)RT-6CGMCC №1356菌株，30℃培养7天，检查菌落周围的清晰程度(透明度)。如有透明圈产生，说明有过氧化氢产生。

上述不同处理对抑菌活性的影响结果如表1所示，表明发酵上清液经排除酸、过氧化氢、残留菌体细胞等干扰因素，并进行了初步的蛋白质分离后，仍有抑菌活性，说明此抑菌活性是由蛋白类物质引起的，从而判定戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)RT-6CGMCC№1356产生的抑菌物质是细菌素。

表1不同处理对抑菌活性的影响

2、细菌素的生产、分离及纯化

其产生细菌素的最佳培养基为改良MRS培养基，其成分为：乳糖2％、胰胨2％、大豆蛋白胨2％、牛肉膏3％、蛋白胨2％、吐温800.1％、磷酸氢二钾0.2％、乙酸钠0.5％、柠檬酸铵0.2％、硫酸镁0.058％、硫酸锰0.025％，蒸馏水1000ml，pH值6.5；所述百分含量均为质量百分含量。在37℃下静置培养24h，将得到的发酵液经5000rmp 4℃离心10min取上清液，用pH6.5的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液进行二倍稀释，取样100μl进行抑菌实验，按照如下方法测定细菌素抑菌活性效价值：先将指示菌植物乳杆菌L.plantarum PL-2CGMCC№1.3919稀释至10⁷cfu/ml，倾注15ml MRS固体培养基，将牛津杯轻轻放置于平板上，将离心上清液加入牛津杯后于4℃冰箱中扩散5h以上，然后37℃培养24h观察抑菌圈的出现。按照如下方法(管碟法)测定细菌素的抑菌活性单位。细菌素抑菌活力的表示方法(效价值AU/ml)：将发酵上清液用pH6.5的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液进行二倍稀释，取样100μl进行抑菌实验，观察不到抑菌圈出现的最高稀释度定义为一个活力单位(1AU)，其倒数即是原液的细菌素效价值AU/ml。测定结果表明戊糖乳杆菌细菌素的最大产量为640AU/ml。

将得到的发酵液经5000rmp 4℃离心10min取上清液，向该离心上清液中加入硫酸铵固体粉末进行盐析，边加边搅拌，至终饱和度为70％，然后于4℃冰箱中静置1h，待其完全沉淀，6000rpm 4℃离心15min，弃去上清液取沉淀(细菌素沉淀物)；将该细菌素沉淀物复溶后进一步采用SP Sepharose Fast Flow阳离子交换树脂进行离子交换层析纯化；所述离子交换层析条件为：流速1.2ml/min，用含0.1M NaCl的0.02M醋酸缓冲液进行洗脱，每2min接收一管，收集保留时间为78min～88min的蛋白峰为细菌素活性峰，将活性峰合并为细菌素纯品液。按照上述细菌素活力效价测定方法测得该纯品液比活力为1482.34AU/mg，是原发酵液比活力的20倍。

3、细菌素的活性

测试菌株

乳杆菌属：保加利亚乳杆菌AS 1.1480、保加利亚乳杆菌ACCC 11057、植物乳杆菌AS 1.557、植物乳杆菌AS 1.550、植物乳杆菌L-1CGMCC№1357、植物乳杆菌PL-2CGMCC№1.3919、弯曲乳杆菌IFFI 06031、布氏乳杆菌AS 1.40、短乳杆菌AS 1.12、干酪乳杆菌AS 1.62、发酵乳杆菌AS 1.122、哈氏乳杆菌CGMCC1.3923、面包乳杆菌CGMCC 1.3924、嗜酸乳杆菌IFFI 06005、嗜酸乳杆菌CGMCC№1.3915、嗜酸乳杆菌AS 1.1854(中国普通微生物菌种保藏中心)，植物乳杆菌ATCC 6538、植物乳杆菌ATCC LP1(ATCC菌种保藏中心)。

链球菌属：嗜热链球菌AS 1.1864、乳脂链球菌AS1.9(中国普通微生物菌种保藏中心)，乳酸链球菌CICC 6018(中国工业微生物菌种保藏中心)。

片球菌属：戊糖片球菌XM-2-8CGMCC№1.3912(中国普通微生物菌种保藏中心)。

李斯特氏菌属：单核细胞增生李斯特氏菌54002(中国药品生物制品检定所)。

金黄色葡萄球菌：金黄色葡萄球菌AS 1.89、金黄色葡萄球菌AS 1.128(中国普通微生物菌种保藏中心)，金黄色葡萄球菌ATCC 6538(ATCC菌种保藏中心)，金黄色葡萄球菌1885 C56005(中国兽医药品监察所)，金黄色葡萄球菌26923(中国药品生物制品检定所)。

假单胞菌：假单胞菌AS 1.512(中国普通微生物菌种保藏中心)。

沙门氏菌：沙门氏杆菌1.1552(中国普通微生物菌种保藏中心)，沙门氏杆菌C79-13鸡白痢血清型、沙门氏杆菌C500(中国兽医药品监察所)。

大肠杆菌：大肠杆菌ATCC 80739(ATCC菌种保藏中心)，大肠杆菌CMCC(B)44102(卫生部药品生物制品检定所)，大肠杆菌987p C83695 0132：987p：H21、大肠杆菌K99C83529 0141：K99、大肠杆菌K88 C83901血清型O8：K87(B)、K88ab(中国兽医药品监察所)，大肠杆菌AS 1.588、大肠杆菌AS 1.1138(中国普通微生物菌种保藏中心)。

芽孢杆菌：蜡样芽孢杆菌AS 1.126、巨大芽孢杆菌AS 1.151、枯草芽孢杆菌AS 1.308、蕈状芽孢杆菌AS 1.856(中国普通微生物菌种保藏中心)。

共测试了对43株菌的作用，采用步骤2的抑菌活性分析方法，即分别将测试菌液涂布于适宜培养平板中，分别取细菌素发酵上清液、细菌素粗提液、细菌素纯品液于牛滓杯中，观察抑菌效果。其中，细菌素粗提液是将戊糖乳杆菌(Lactobacillusp pentosus)RT-6CGMCC №1356的发酵液经5000rmp 4℃离心10min取上清液，向该离心上清液中加入硫酸铵固体粉末进行盐析，边加边搅拌，至终饱和度为70％，然后于4℃冰箱中静置1h，待其完全沉淀，6000rpm 4℃离心15min，弃去上清液取沉淀(细菌素沉淀物)；将该细菌素沉淀物复溶后得到细菌素粗体液。细菌素纯品液按照步骤2中第二自然段的方法制备。

实验结果如表2所示，表明戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)RT-6 CGMCC№135的细菌素抑菌谱广，可抑制乳杆菌属、链球菌属中的大部分菌株，还可抑制片球菌属、单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、假单胞菌、大肠杆菌、芽孢杆菌中的部分菌株。

表2 戊糖乳杆菌RT-6CGMCC №1356所产细菌素的抑菌谱

4、细菌素的理化特性

(1)对热的稳定性：将细菌素粗提液(效价1280AU/ml)分别取0.6ml于小离心管中，分别水浴热处理60℃15min，60℃30min，80℃15min，80℃30min，100℃15min，100℃30min，121℃15min，以未热处理的样品为对照，测其抑菌活性。结果表明60℃15min，60℃30min，80℃15min三个处理的活性均没有明显变化，效价值为1280AU/ml；80℃30min、100℃处理15min时其活性为640AU/ml，仍保持有50％；100℃30min处理后活性为320AU/ml；121℃15min的高温处理后仍保持有160AU/ml的活性。

(2)对酸的稳定性：分别取0.3ml的细菌素粗提液(效价320AU/ml)于试管中，用1M HCL和1M NaOH调其pH值分别为2、3、4、5、6、7、8、10、10、12，保持最终容积为1.5ml，以加双蒸水同比稀释的细菌素液为对照，然后37℃温育4h，调pH回至中性(6.5-7.5)，然后测抑菌活性。结果表明细菌素在pH 2-8范围内都保持稳定(均为320AU/ml)，当pH值大于9时，细菌素活性有所降低(280AU/ml)，在pH值为12时其活性为160AU/ml，仍存50％。

(3)对蛋白酶的敏感性：将不同蛋白酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、溶菌酶、酸性蛋白酶、α-淀粉酶)分别配成5mg/ml的溶液，分别取0.1ml于离心管中，分别加纯化后的细菌素液(效价为320AU/ml)0.4ml，使酶的终浓度为1mg/ml，其中胃蛋白酶和酸性蛋白酶pH值调至2-3，其他蛋白酶均调pH至6-7(在其最适pH值范围内)，同时以0.1ml缓冲液加入0.4ml细菌素液作为对照，37℃温育4小时，然后检测细菌素活性。结果表明胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶处理后抑菌圈均为0，溶菌酶、酸性蛋白酶处理后抑菌圈与对照相比没有明显变化，α-淀粉酶处理后抑菌圈直径缩小为12.4mm(与对照16.4mm相比)。

由此可见，戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)RT-6CGMCC №1356的细菌素对热、酸稳定，在80℃热处理15min后活性基本不变，在121℃15min仍保持较好的活性；在pH2-8范围内保持稳定，当pH值大于9时，活性逐渐降低。可被胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶完全失活，可被α-淀粉酶部分失活。

实施例2、利用戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)RT-6CGMCC№1356发酵香肠

发酵香肠原料配比：猪后腿瘦肉60％，牛肉20％，肥膘20％，葡萄糖5g/kg，蔗糖2g/kg，脱脂奶粉28g/kg，NaCl 26g/kg，硝酸盐0.2g/kg亚硝酸盐0.1g/kg，抗坏血酸钠0.5g/kg，黑胡椒6g/kg，洋葱大蒜粉36g/kg，美味柿椒粉0.4g/kg，肉豆蔻粉0.4g/kg。

发酵剂为戊糖乳杆菌(Lac tobacillus pen tosus)RT-6CGMCC№1356(接入量为10⁶-10⁷cfu/g原料)；或戊糖乳杆菌(Lactobacillu spentosus)RT-6CGMCC№1356(接入量为10⁶-10⁷cfu/g肉馅)和木糖葡萄球菌s-1(双汇集团)(接入量为10⁶-10⁷cfu/g肉馅)。以戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)RT-6CGMCC№1356；或戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)RT-6CGMCC №1356和木糖葡萄球菌s-1为发酵剂生产发酵香肠的生产工艺如下：挑取猪后腿瘦肉、牛肉+脊膘→切丁→冷冻(-20℃，24h)→斩拌，混合(加其它原料，发酵剂)→灌肠(真空)→发酵→成熟、干燥→包装。发酵条件为20℃，相对湿度95％，时间三天；成熟干燥条件为：第一阶段温度20～16℃，相对湿度95～85％，时间4天，第二阶段温度14℃，相对湿度78％，时间41天。同时以不加发酵剂的产品为空白对照(N)，以木糖葡萄球菌s-1(接入量为10⁶-10⁷cfu/g肉馅)作为发酵剂的产品为对照。

本实施例中，N表示不加发酵剂的产品，S表示以木糖葡萄球菌s-1作为发酵剂的产品，L表示以戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)RT-6CGMCC№1356为发酵剂的产品；L+S表示以戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus)RT-6CGMCC№1356和木糖葡萄球菌s-1为发酵剂的产品。

在发酵香肠灌肠后的第0，3，7，14，28和48天(终产品)分别取香肠一根，在无菌条件下取样品25g于均质袋，加入225g无菌蛋白胨液(含1％吐温80，0.85％NaCl，2.25％蛋白胨)，均质1-4分钟。然后取1mL加入到9mL 0.1％无菌蛋白胨溶液中，即成10^-2稀释度，根据需要再依次制成不同的稀释度。剩余的样品马上进行理化分析或贮藏于-20℃以备理化分析所用。

1、微生物分析

不同的菌群分别采用不同的选择性培养基进行分离和计数。细菌总数用PCA培养基(胰蛋白胨5g、酵母浸膏2.5g、葡萄糖1g、琼脂13g、水1000ml，pH6.9-7.1)计数，30℃培养72h。

乳酸菌用MRS培养基(蛋白胨10g、肉膏10g、酵母提取物5g、K₂HPO₄2g、柠檬酸二铵2g、乙酸钠5g、葡萄糖20g、吐温801ml、MgSO₄·7H₂O 0.58g、MnSO₄·4H₂O0.25g，蒸馏水1000ml，pH6.2-6.4)，加入160mg/L溴甲酚紫，为了提高其选择性再在其中补加100mL/L的放线菌酮，30℃厌氧培养48h。

微球菌和葡萄球菌用MSA培养基(牛肉浸膏1g、胨NO.3(Difco)10g、D-甘露醇10g、氯化钠75g、琼脂13g、酚红0.025g、蒸馏水1000ml，pH7.2-7.6)倒平板，30℃培养48～72h。

肠杆菌用VRBD培养基(酵母浸膏3g、蛋白胨7g、胆盐1.5g、NaCl5g、乳糖10g、中性红0.03g、结晶紫0.002g、琼脂13g、蒸馏水1000ml，pH7.3～7.5)，37℃，培养24h。酵母菌用麦芽汁琼脂培养基(补加100mg/mL的氯霉素)倒平板，28℃，培养5d。

成熟的产品(48天)还进行金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157：H7的检测。金黄色葡萄球菌的检测用3M Petrifilm微生物快速检测法进行检测。具体方法为：取1mL样品处理液，接种于3M纸片，36℃培养24h，然后60℃培养1h，贴反应纸片，37℃培养3h，计数红晕菌落。大肠杆菌O157：H7的检测按照SN/TO973-2000进行。

结果如图1～5所示，戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)RT-6CGMCC№1356在发酵香肠中的使用能加速肠杆菌的死亡，降低发酵香肠中肠杆菌的存活数量，而成熟产品中未检测出金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157：H7，说明戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)RT-6CGMCC№1356由于能够产酸和细菌素，提高了发酵香肠的卫生质量及安全性。图1至图5中，N表示不加发酵剂的产品，S表示以木糖葡萄球菌s-1作为发酵剂的产品，L表示以戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus)RT-6CGMCC№1356为发酵剂的产品；L+S表示以戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)RT-6CGMCC№1356和木糖葡萄球菌s-1为发酵剂的产品。

2、理化分析

其中pH值的测定方法为：取10g均质的样品，加入90ml中性的蒸馏水，震荡30min，过滤，滤液用pH SJ-4型pH计进行测定。水分的测定按照GB9695.15-88进行。结果如图5和图6所示，图6表明使用戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)RT-6 CGMCC №1356发酵剂能加速发酵作用的启动，使pH值迅速降低到5.3以下，对保证产品的安全性起到重要作用。图7表明戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus)RT-6CGMCC №1356作为发酵剂能加速水分的蒸发，降低产品中水分的含量，使香肠干燥均匀一致。图6和图7中，N表示不加发酵剂的产品，S表示以木糖葡萄球菌s-1作为发酵剂的产品，L表示以戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus)RT-6CGMCC№1356为发酵剂的产品；L+S表示以戊糖乳杆菌(Lactobaci1lus pentosus)RT-6CGMCC№1356和木糖葡萄球菌s-1为发酵剂的产品。

3、游离氨基酸的测定

游离氨基酸的测定用氨基酸自动分析仪(日立835-50型氨基酸自动分析仪)。称取1g样品→加入10％磺基水杨酸10ml→高速均质→离心(5,000r/min)→过滤→高速离心(20,000r/min)→上机测定。结果如表3至表5和图8所示，表明经过戊糖乳杆菌的发酵作用可以使发酵香肠的总游离氨基酸显著增加，成熟产品中总游离氨基酸是新鲜肉馅中的6～7倍。存在于新鲜肉馅中的游离氨基酸主要是苏氨酸Thr、谷氨酸Glu、甘氨酸Gly、丙氨酸Ala、缬氨酸Val、亮氨酸Leu、色氨酸Try、苯丙氨酸Phe和赖氨酸Lys九种，它们占了游离氨基酸的75～78％。而发酵香肠成熟产品中主要游离氨基酸则变为Thr、Glu、Ala、Val、Leu、Ile、Phe和Lys，占总游离氨基酸的71～74％。发酵成熟过程中异亮氨酸Ile所占比例大幅增加，甘氨酸Gly和色氨酸Try所占比例增加较少。发酵香肠释放的游离氨基酸组成比例较为均衡，因而不致会引起蛋白质的过度水解，降低产生不良风味及形成生物胺的可能性。

表3处理L中FAA的变化(mg/100g干物质)

表4处理S中FAA的变化(mg/100g干物质)

表5处理L+S中FAA变化(mg/100g干物质)

4、游离脂肪酸的测定

发酵香肠中游离脂肪酸的测定具体方法如下：

(1)香肠中脂肪的提取

称取以上处理的样品5g→置于圆底烧瓶中，加60ml三氯甲烷∶甲醇(2∶1)混合液(CM)→65℃抽提30min→过滤→回收溶剂→以氮气吹干脂肪。

(2)阴离子交换树脂的处理

称取Amberlyst-26(A-26)10g于具塞三角瓶→加入100～120ml 0.5mol/LNaOH溶液，振摇30min→倾去NaOH→用去CO₂的蒸馏水洗3次，每次振摇20min→40ml甲醇洗3次，每次振摇20min→重复处理一次→A-26保存于甲醇中。

(3)游离脂肪酸的分离及甲酯化

取100mg 4(1)中提取的脂肪于具塞三角瓶中→加入15ml丙酮-甲醇溶液(2∶1)→加入200～250mg A-26及0.2～0.5ml的C_15∶0内标甲醇溶液→120r/min振摇30min→静置倾去溶剂→丙酮-甲醇(2∶1)洗涤树脂4次→将树脂洗入干试管中(带橡胶塞和螺纹盖)→倾去丙酮-甲醇→以氮气吹干树脂→加入3ml甲酯化试剂(盐酸甲醇溶液)和2ml正己烷，盖紧试管→沸水浴60min→冷却→加入5～6％NaCO₃ 3ml→振摇至两相清晰，取己烷层上机。进行气相色谱分析，其中，气相色谱条件为：进样口温度：250℃；检测器温度：260℃；载气：氮气；载气流速：1.2ml/min；分流流速：22ml/min；分流比：20∶1；尾吹气：氢气，32ml/min；空气，430ml/min；柱升温程序：初温80℃，以每分钟20℃升到210℃，再以3℃/min升到225℃，保持12min。结果如表6至表9所示(表6至表8中FFA的单位为mg/100g干物质)：

表6处理L中FFA的变化

表7处理S中FFA的变化

表8处理L+S中FFA的变化

表9不饱和脂肪酸/饱和脂肪酸比例

表6至表9表明发酵香肠在成熟过程中甘油三酯不断被水解，游离脂肪酸不断增加，在新鲜肉馅中游离脂肪酸的含量非常低，总量约500mg/100g油，而在成熟样品中游离脂肪酸最高达到了6000mg/100g油以上，增加了10倍以上。从脂肪酸的组成来看，存在于新鲜肉馅中的游离脂肪酸主要为棕榈酸＞硬脂酸＞油酸＞亚油酸。而成熟产品中的主要游离脂肪酸则为油酸＞棕榈酸＞亚油酸＞硬脂酸。在成熟过程中硬脂酸的质量百分比出现了大幅度下降，从原来的24％下降到了9～10％。在所有的脂肪酸中油酸的绝对增加量最大，在各个处理中几乎占了总量的一半左右，是引起发酵香肠中游离脂肪酸绝对量增加最重要的脂肪酸。但从前后脂肪酸的量的比值，及脂肪酸的释放速率来看，在几种主要的脂肪酸中以亚油酸的释放速率最快，增加了30倍。从脂肪酸的碳链组成来看，C₁₈脂肪酸是发酵香肠中最丰富的脂肪酸，并随着发酵香肠的成熟C₁₈脂肪酸的比例不断增加，由最初的54％增加到了71％。从饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的比例来看，在新鲜肉馅中的游离脂肪酸主要是饱和脂肪酸。随着发酵和成熟干燥过程的进行，样品中不饱和脂肪酸的质量百分含量不断增加，在48天的成品中不饱和脂肪酸的含量达到了饱和脂肪酸的两倍以上，尤其含有两个双键的高不饱和脂肪酸亚油酸快速增加，达到了游离脂肪酸总量的16％左右，接近与饱和脂肪酸的比率。使发酵香肠中高不饱和脂肪酸：低不饱和脂肪酸：饱和脂肪酸的比率基本接近2∶5∶3。尤其在以戊糖乳杆菌为发酵剂的发酵香肠中亚油酸和亚麻酸等高不饱和脂肪酸的比率超过了20％，由于人体不能合成亚油酸和亚麻酸，必须从膳食中补充，因此被认为是重要的人体必需脂肪酸，对维持人体正常生理代谢具有重要作用。

5、质地剖面分析(TPA)

质地剖面分析结果如表10所示：

表10发酵剂对发酵香肠TPA特性的影响

说明：同一列不同的字母表示在5％水平显著。

表10表明戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)RT-6CGMCC№1356能改善发酵香肠的质构特性，明显提高香肠的硬度、咀嚼性和胶粘性，使得质地坚硬致密，能提高发酵香肠的感官品质。戊糖乳杆菌RT-6能显著改变发酵香肠的硬度值，咀嚼性和胶粘性。

6、色泽分析

对48天成熟产品进行色度值的仪器客观分析。发酵香肠色泽的分析用TC-PIA全自动测色色差计进行测定，其结果用CIE La*b*系统表示。测定时用切片机将香肠切成1cm薄片，用聚乙烯薄膜将被测面压平，除去气泡，然后进行测定。每个样品取两片，每一片测3个点，共6个重复。

表11发酵剂对香肠色泽的影响

说明：同一列不同的字母表示在5％的水平上显著

从表11色泽分析结果来看，戊糖乳杆菌发酵剂能提高产品的红度值a*值，改善发酵香肠的色泽。在试验的4个处理中，S和(L+S)的a*值要明显高于其它没有接种葡萄球菌的处理，而它们二者之间则无差别(P＜0.05)。葡萄球菌能分泌硝酸盐还原酶，硝酸盐还原酶还原硝酸盐成亚硝酸盐，亚硝酸盐再分解产生一氧化氮，一氧化氮与肌红色素作用，产生亚硝基肌红蛋白，从而促进腌渍肉色的形成。同时葡萄球菌是接触酶阳性的细菌，能在发酵香肠中产生过氧化氢酶，分解乳酸菌及其它一些G-菌产生的H₂O₂，从而保证硝酸盐和亚硝酸盐的发色作用。发酵香肠的红色深浅是影响发酵香肠感官品质的一个非常重要的指标，由此可以见得葡萄球菌能显著提高发酵香肠的感官品质。木糖葡萄球菌还可明显降低产品的黄度值，使得S和(L+S)的b*值显著低于自然发酵处理。

7、发酵香肠的感官分析

采用定量描述分析(Quantitative Descriptive Analysis，QDA)对发酵香肠进行感官评定，以自然发酵香肠为对照。首先采用三角试验挑选12名感官评定者，并且用同类产品进行3次时间为一小时的培训。然后把发酵香肠切成2mm厚的薄片，每个处理提供两片供以上感官评定者进行感官评定。评定时以自然发酵的产品为对照，其各项指标的评分标准均为5.0分。对试验组的各项指标按1～9的评分标准打分。酸味：1＝没有酸味，9＝很酸；气味浓度：1＝没有气味，9＝气味非常浓；令人愉快的气味：1＝令人不愉快(disagreeable)，9＝非常令人愉快(verypleasure)；盐味：1＝没有盐味(not salty)，9＝盐味非常重(very salty)；令人不愉快的余味：1＝没有令人不愉快的余味，9＝令人不愉快的余味很浓；总体可接受性：1＝不可接受，9＝可接受性很高。同时，在感官评定中要求评定者指出产品中有无其它异味。

感官评定结果如图9所示，表明以戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)RT-6CGMCC№1356为发酵剂可提高发酵香肠的酸味，以戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)RT-6CGMCC№1356为发酵剂和以戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)RT-6CGMCC №1356和木糖葡萄球菌s-1为发酵剂生产的两种产品的酸味都要明显高于自然发酵香肠。另外，在戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)RT-6CGMCC№1356为发酵剂的发酵香肠中气味的浓度较低，而戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)RT-6CGMCC№1356与木糖葡萄球菌s-1复合作为发酵剂的发酵香肠的气味则更迎合感官评定小组的喜好。以戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)RT-6CGMCC№1356为发酵剂和以戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)RT-6CGMCC№1356和木糖葡萄球菌s-1为发酵剂都提高了发酵香肠总体可接受性，总体可接受性是发酵香肠的质构特性、色泽、口感和风味等指标的一个综合评价，反映了评定者对此产品总体满意度，是发酵香肠整体感官品质的反映。总体可接受性的提高，说明以戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)RT-6CGMCC№1356和木糖葡萄球菌s-1为发酵剂和以戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)RT-6CGMCC№1356和木糖葡萄球菌s-1为发酵剂都可提高发酵香肠的感官品质。图9中，n.s表示不显著；**表示显著(p＜0.05)；***表示极显著(p＜0.01)。

Claims

1.戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)RT-6 CGMCC №1356。

2.一种生产戊糖乳杆菌细菌素的方法，是发酵戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus)RT-6 CGMCC №1356，得到细菌素。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述方法中，用于培养戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)RT-6 CGMCC №1356的培养基由下述成分组成：乳糖2％、胰胨2％、豆胨2％、牛肉膏3％、蛋白胨2％、吐温80 0.1％、磷酸氢二钾0.2％、乙酸钠0.5％、柠檬酸铵0.2％、硫酸镁0.058％、硫酸锰0.025％，蒸馏水1000ml，pH值6.5；所述百分含量均为质量百分含量。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述方法中的培养条件为37℃，静置培养24h。

5.根据权利要求2或3或4所述的方法，其特征在于：所述方法中，得到的细菌素按照以下方法进行纯化：将按所述培养方法得到的发酵液离心，取上清液，向该上清液中加入硫酸铵至终饱和度为70％，进行盐析；然后离心，取沉淀，得到细菌素沉淀物；将该细菌素沉淀物复溶后进一步采用SP Sepharose Fast Flow阳离子交换树脂进行离子交换层析纯化；所述离子交换层析条件为：流速1.2ml/min，用pH5.5含0.1mol/l NaCl的0.02mol/l醋酸缓冲液进行洗脱，收集保留时间为78min-88min的蛋白峰为细菌素活性峰。

6.权利要求1所述的戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)RT-6 CGMCC№1356在制备发酵肉制品中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus)RT-6 CGMCC №1356的用量为10⁶-10⁷cfu/g。