CN116426441B - 戊糖乳杆菌p307及其应用和利用其制备细菌素的方法 - Google Patents

戊糖乳杆菌p307及其应用和利用其制备细菌素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株戊糖乳杆菌P307及其应用和利用其制备细菌素的方法，属于微生物技术领域。该戊糖乳杆菌P307是从刺参内脏发酵物中分离、纯化得到的，能够适应低盐环境，并且发酵代谢产生细菌素，其已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20221055。经研究发现，该戊糖乳杆菌P307对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有明显的抑制效果，抑菌谱较广泛，可以应用在果蔬抗氧化保鲜和水产品防腐保鲜中；其产生的细菌素具有良好的热稳定性及pH稳定性，适用范围广，并且具有显著的蛋白酶敏感性，经过胃蛋白酶等酶处理后几乎完全失去抑菌活性，避免了在体内的负面影响。

Description

戊糖乳杆菌P307及其应用和利用其制备细菌素的方法
技术领域
本发明涉及戊糖乳杆菌P307及其应用和利用其制备细菌素的方法，属于微生物技术领域。
背景技术
食品在加工、运输、储藏及销售等环节中，极易受到致病菌污染导致变质。随着人们食品安全意识的提高，天然防腐剂尤其是天然生物防腐剂的开发得到广泛关注。
天然生物防腐剂是从天然动植物及微生物中提取的具有抑制有害微生物生长且对食品具有保鲜功能的物质。乳酸菌被认为是安全的益生菌，大量研究发现，乳酸菌能发酵产生具有抑菌效果的多肽或蛋白质类细菌素，但目前只有一种乳酸菌素获得商业许可，即乳酸链球菌肽（Nisin）。现有研究也大多集中在Nisin及其与其它保鲜剂复合应用于食品保鲜，对其他乳酸菌素研究较少。
目前，已报道的细菌素大多数抗菌谱较窄，耐酸碱性较差，大大限制了其在食品工业中的应用。因此，迫切需要一种能够替代化学防腐剂的广谱、无毒、高效、性质稳定的天然生物防腐剂。
发明内容
本发明的目的在于提供一株产广谱、无毒、高效、性质稳定的细菌素的戊糖乳杆菌P307及其在作为天然生物防腐剂方面的应用，以及利用该戊糖乳杆菌P307制备细菌素的方法。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一株戊糖乳杆菌P307，所述戊糖乳杆菌P307从刺参内脏发酵物中分离、纯化得到，能够适应低盐环境，并且发酵代谢产生细菌素，该戊糖乳杆菌P307保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，保藏日期为2022年7月8日，保藏编号为CCTCC NO：M20221055，分类命名为戊糖乳杆菌P307 Lactobacillus pentosus P307。
前述的戊糖乳杆菌P307在果蔬抗氧化保鲜以及在水产品防腐保鲜中的应用。
一种利用前述的戊糖乳杆菌P307制备细菌素的方法，包括以下步骤：
（1）发酵液制备：将戊糖乳杆菌P307接种到pH=4的MRS液体培养基中，30℃密封静置培养至发酵液的pH值趋于稳定，离心，上清液用0.22μm膜过滤，滤液用NaOH溶液调pH至6.5，得滤液A；
（2）细菌素粗提：向滤液A中添加饱和度为45%的硫酸铵，120rpm搅拌16h，离心，上清液用0.22µm 膜过滤，得滤液B；
（3）细菌素脱盐：以超纯水为缓冲液，流速为5mL/min，将滤液B用Sephadex G-10柱进行脱盐，得洗脱液A；
（4）细菌素纯化：以0.5mol/L的NaCl溶液为缓冲液，流速为5mL/min，将洗脱液A用SP-Sepherose Fast Flow柱进行纯化，得洗脱液B，将洗脱液B真空冷冻干燥，得细菌素。
本发明的有益之处在于：
（1）本发明筛选得到的戊糖乳杆菌P307能够适应低盐环境，并且发酵代谢产生细菌素；
（2）本发明筛选得到的戊糖乳杆菌P307易培养、繁殖速度快，在菌种混合培养时属于优势菌种；
（3）本发明筛选得到的戊糖乳杆菌P307通过分离纯化的方式可获得较好纯度的细菌素，该纯化的细菌素的比活力达到225.4 AU/mg，是原发酵上清液比活力的9倍；
（4）本发明筛选得到的戊糖乳杆菌P307产生的细菌素具有良好的热稳定性及pH稳定性，适用范围广，并且具有显著的蛋白酶敏感性，经过胃蛋白酶等酶处理后几乎完全失去抑菌活性，避免了在体内的负面影响；
（5）本发明筛选得到的戊糖乳杆菌P307对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有明显的抑制效果，抑菌谱较广泛，具有潜在的开发与应用前景；
（6）本发明筛选得到的戊糖乳杆菌P307可有效控制新鲜苹果等水果的氧化褐变，增加鲜切苹果等水果的抗氧化和抵抗环境胁迫的能力，是鲜切苹果等水果的良好天然抗氧化保鲜剂来源；
（7）本发明筛选得到的戊糖乳杆菌P307能够有效延迟海青虾等海产品的冷藏货架期，在水产品防腐保鲜方面具有一定的应用价值。
附图说明
图1是本发明筛选所得戊糖乳杆菌P307的菌落形态图；
图2是本发明筛选所得戊糖乳杆菌P307的菌体形状图；
图3是本发明筛选所得戊糖乳杆菌P307的DNA琼脂糖凝胶电泳图；
图4是基于16S rDNA基因序列建立的乳杆菌属系统发育树；
图5是戊糖乳杆菌P307产生的细菌素的pH稳定性研究结果图；
图6是在不同培养时间下各样品的OD600nm、pH值和抑菌圈直径的测定结果图；
图7是在不同培养温度下各样品的OD600nm和抑菌圈直径的测定结果图；
图8是在不同初始pH值下各样品的OD600nm和抑菌圈直径的测定结果图；
图9是试验组和对照组鲜切苹果的失重率计算结果图；
图10是试验组和对照组鲜切苹果的褐变率计算结果图；
图11是试验组和对照组鲜切苹果的DPPH自由基清除能力计算结果图；
图12是试验组和对照组冷藏虾肉pH值测定结果图；
图13是试验组和对照组冷藏虾肉中挥发性盐基氮测定结果图；
图14是试验组和对照组冷藏虾肉中菌落总数测定结果图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作具体的介绍。
一、戊糖乳杆菌P307的分离、纯化及鉴定
MRS固体培养基的配方如下：
蛋白胨10g/L、牛肉膏粉5.0g/L、酵母浸粉4.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾2.0g/L、乙酸钠5.0g/L、柠檬酸三铵2.0g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.05g/L、琼脂15g/L，pH=6.2±0.1。
MRS液体培养基的配方如下：
蛋白胨10g/L、牛肉膏粉5.0g/L、酵母浸粉4.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾2.0g/L、乙酸钠5.0g/L、柠檬酸三铵2.0g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.05g/L，pH=6.2±0.1。
1、戊糖乳杆菌P307的分离、纯化
本发明筛选得到的戊糖乳杆菌P307是从刺参内脏发酵物中分离、纯化得到的，分离、纯化的过程具体如下：
（1）取刺参内脏发酵物，用超纯水对发酵物进行洗脱，然后将洗脱液加入到100mL质量浓度为0.85%的NaCl无菌溶液中，制成浑浊液；
（2）将得到的浑浊液进行梯度稀释，取100μL稀释10000倍的浑浊液涂布至MRS固体培养基上，共涂3个平板，之后将3个涂布浑浊液的平板置于37℃培养箱中倒置密封培养24h，培养结束后每个平板上长出大约94～130个单菌落；
（3）从每个平板上随机挑取3个完整而独立的单菌落，采用平板划线的方式接种至新的MRS固体培养基上，将制作好的9个划线平板密封，置于37℃培养箱中倒置密封培养24h，培养结束后每个平板上长出大约60～100个单菌落，随机保存30个菌落呈圆形、中间凸起、边缘整齐、微黄而不透明的单菌落。
2、戊糖乳杆菌P307的初筛
戊糖乳杆菌P307的初筛过程具体如下：
（1）分别将保存的单菌落于MRS液体培养基中传代培养2次，10000rpm离心10min，收集各发酵上清液，4℃保藏备用；
（2）以大肠杆菌为指示菌，通过琼脂扩散法筛选具有抑菌活性的菌种，操作步骤具体如下：
取10mL 活化好的指示菌，转接至1000mL冷却到50℃左右的LB固体培养基上，混匀后倒入无菌平板，制成带指示菌的固体培养基；用10mm打孔器打孔，然后分别向孔中加入100μL各单菌落的发酵上清液，37℃培养12h，用游标卡尺测量抑菌圈直径，选取抑菌圈直径大于13mm的菌种保存备用。
3、戊糖乳杆菌P307的复筛
以革兰氏阳性菌蜡样芽孢杆菌、革兰氏阴性菌大肠杆菌为指示菌进一步筛选具有广谱抗菌活性的菌株，操作步骤具体如下：
（1）选取初筛保存的菌株于MRS液体培养基中培养24h，10000rpm离心10min，收集各发酵上清液，4℃保藏备用；
（2）为了排除H2O2 和有机酸的干扰，将收集的各发酵上清液用过氧化氢酶处理，并用3mol/L的NaOH溶液将发酵上清液pH调至6.5；
（3）分别取10mL活化好的指示菌，转接至1000mL冷却到50℃左右的LB固体培养基上，混匀后倒入无菌平板，制成带指示菌的固体培养基，用10mm打孔器打孔，然后分别向孔中加入100μL各复筛菌种的发酵上清液，37℃培养12h，用游标卡尺测量抑菌圈直径，选取抑菌圈直径大于13mm的单菌落，并从中随机保存一个形态呈圆形、大小中等、中间凸起、边缘整齐、微黄而不透明的单菌落，该单菌落即为本发明最终筛选所得单菌落，相应的，该单菌落中的菌株即为本发明最终筛选所得菌株。
4、戊糖乳杆菌P307的鉴定
根据形态学、生理生化特征以及分子生物学对本发明最终筛选所得菌株进行菌种鉴定。
（1）观察菌落形态和菌体形状
将本发明最终筛选所得菌株以平板涂布的方式涂布至MRS固体培养基上，37℃培养箱中密封培养24h，培养结束后，如图1所示，平板上长出了大约150个单菌落，这些单菌落呈圆形，大小中等，中间凸起，边缘整齐，微黄而不透明。
取一环本发明最终筛选所得菌株，将其分散到MRS液体培养基中，然后放置于显微镜下，观察菌体的形状，如图2所示，菌体呈直杆状。
（2）凝胶电泳检测
将本发明最终筛选所得菌株接种至装有MRS液体培养基的三角瓶中，密封，37℃恒温静置培养24h，得到菌液。
用细菌基因组DNA提取试剂盒提取上述菌液中的细菌的DNA，然后以所提DNA为模板、以27F（序列为AGA GTT TGA TCC TGG CTCAG）为上游引物、以ITS1（序列为TCCGTAGGTGAACCTGCGG）为下游引物进行序列扩增，PCR反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min，31个循环；72℃保持5min。
扩增结束后，用1%（w/v）琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，如图3所示，扩增得到了约 1500bp的PCR片段。
结果表明：通用引物PCR扩增成功。
（3）16S rDNA鉴定
将本发明最终筛选所得菌株送至青岛睿博兴科生物技术有限公司进行16S rDNA序列测定，并将测得的该菌株的16S rDNA序列（SEQ ID No.1）在Gen Bank中进行同源序列比对检索，比对检索的结果显示：该菌株与戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）相似度达到100%。
基于16S rDNA基因序列建立的乳杆菌属系统发育树见图4。
最终，鉴定本发明最终筛选所得菌株为戊糖乳杆菌，记为戊糖乳杆菌P307Lactobacillus pentosus P307，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，保藏日期为2022年7月8日，保藏编号为CCTCC NO：M 20221055。
5、戊糖乳杆菌P307的耐盐性研究
取保存的戊糖乳杆菌P307菌株于MRS液体培养基中37℃恒温培养24h，随后取1mL活化的菌株转接涂布至MRS固体培养基中，37℃恒温培养至出现长势良好的戊糖乳杆菌P307单菌落，备用。
配制含有浓度梯度分为5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L NaCl的MRS液体培养基和固体培养基。
将戊糖乳杆菌P307分别接种到不同NaCl浓度的MRS液体培养基和固体培养基中，将接种好的培养基放入37℃恒温培养箱中培养24h，观察菌落的长势情况。
通过对戊糖乳杆菌P307的耐盐性进行研究发现，该菌株能在NaCl浓度不超过30g/L的MRS液体培养基和固体培养基上正常生长，而当NaCl浓度达到35g/L及以上时，该菌株基本无法生长。
结果显示：戊糖乳杆菌P307能适应一定的低盐环境。
二、戊糖乳杆菌P307细菌素的分离、纯化
1、发酵液制备
将戊糖乳杆菌P307接种到MRS液体培养基中，37℃静置密封培养48h，10000rpm离心10min，上清液用0.22μm膜过滤，滤液用0.5mol/L NaOH溶液调pH至6.5，得滤液A，4℃保藏备用。
2、细菌素粗提
向滤液A中分别添加不同饱和度（5%、15%、45%、75%）的硫酸铵，120rpm搅拌16h，10000rpm离心10min，上清液用0.22µm 膜过滤，得滤液B与沉淀。
分别以革兰氏阳性菌蜡样芽孢杆菌和革兰氏阴性菌鲍氏不动杆菌为指示菌，采用琼脂扩散法分别测定滤液B和沉淀复溶液的抑菌圈直径（用10mm打孔器打孔）。
表1 滤液B和沉淀复溶液的抑菌圈直径测定结果
经观察，分别用饱和度为5%、15%和45%的硫酸铵粗提滤液A时，得到的沉淀量随硫酸铵浓度的增加而增加，但沉淀对指示菌无明显的抑制作用，而滤液B对指示菌的抑制作用较为明显，经检测，滤液B的细菌素比活力分别为78.4 AU/mg、77.6 AU/mg、75.2 AU/mg。
经观察，当用饱和度为75%的硫酸铵粗提滤液A时，得到的沉淀对指示菌产生了抑制作用，这表明此时发酵上清液中的细菌素开始沉淀。
因此，45%饱和度的硫酸铵能够最大程度去除杂蛋白。
将用饱和度为45%的硫酸铵粗提得到的滤液B记为细菌素I。
3、细菌素脱盐
由于硫酸铵沉淀后得到的上清液中含有大量盐，故选用 Sephadex G-10柱对细菌素I进行脱盐，具体的：
以超纯水为缓冲液，流速为5mL/min，将细菌素I通过Sephadex G-10柱进行脱盐，洗脱液记为细菌素II。
以蜡样芽孢杆菌和鲍氏不动杆菌为指示菌，测定细菌素II的抑菌活性（用10mm打孔器打孔）。
结果显示：细菌素II对蜡样芽孢杆菌和鲍氏不动杆菌的抑菌活性分别为22.47mm和17.28mm，比活力为119.3 AU/mg，较细菌素I的抑菌活性显著提高。
结果表明：细菌素脱盐完成。
4、细菌素纯化
研究表明，乳酸菌产生的细菌素大多含有碱性氨基酸，在酸性及中性条件下带正电荷，能够被阳离子层析柱吸附。因此，将经Sephadex G-10 柱脱盐得到的细菌素II通过经20mmol/L醋酸盐缓冲液平衡的SP-Sepherose Fast Flow柱进行进一步纯化，用0.5mol/L的NaCl溶液以5mL/min流速溶液洗脱，将洗脱液真空冷冻干燥得细菌素，记为细菌素III。
以蜡样芽孢杆菌和鲍氏不动杆菌为指示菌，将洗脱液通过琼脂扩散法测定抑菌活性（用10mm打孔器打孔）。
抑菌结果显示：洗脱液对蜡样芽孢杆菌和鲍氏不动杆菌的抑菌活性分别为26.13mm和22.5mm。
经检测，发酵上清液、硫酸铵粗提上清液、Sephadex G-10柱洗脱液和SP-Sepherose Fast Flow柱洗脱液中的总蛋白以及细菌素总活力和比活力分别如下：
表2 各液中总蛋白以及细菌素总活力和比活力的测定结果
结果显示：SP-Spharose Fast Flow柱可以从上清液中分离出大部分有活性的细菌素，纯化的细菌素的比活力是原发酵上清液比活力的9倍。
三、戊糖乳杆菌P307细菌素理化性质研究
1、戊糖乳杆菌P307细菌素的热稳定性研究
戊糖乳杆菌P307发酵上清液分别在60℃、80℃、100℃、115℃、121℃下水浴处理30min后冷却至室温，以蜡样芽孢杆菌为指示菌，用琼脂扩散法进行抑菌试验（用10mm打孔器打孔），未经加热处理的发酵上清液作为对照。
表3 经不同温度处理后抑菌圈直径及残留活性的测定结果
结果显示：
（1）戊糖乳杆菌P307发酵上清液在所研究的温度下均保持活性，随着处理温度的升高，细菌素的抑菌活性有所下降；
（2）戊糖乳杆菌P307细菌素能够在巴氏杀菌处理条件下保持稳定，仍然保留90 %以上的抑菌活性；
（3）戊糖乳杆菌P307细菌素在 121℃高压灭菌30min后活性损失较大，但也依然保留77.4 %的抑菌活性。
这说明：戊糖乳杆菌P307产生的细菌素具有很好的热稳定性。
2、戊糖乳杆菌P307细菌素的pH稳定性研究
用1mol/L HCl 和1mol/L NaOH 调节戊糖乳杆菌P307发酵上清液pH值为2、4、6、8、10、12，37℃静置30min，以蜡样芽孢杆菌为指示菌，用琼脂扩散法进行抑菌试验（用10mm打孔器打孔）。
戊糖乳杆菌P307细菌素的pH稳定性研究结果见图5。
结果显示 ：戊糖乳杆菌P307细菌素在pH≤6的酸性条件下有很好的抑菌活性；当pH>6后，随着pH值的增加，抑菌活性不断减弱；pH≥10以后，抑菌活性基本消失。
这表明：戊糖乳杆菌P307细菌素对酸具有抗性，这种对酸的抗性可能适合于相关食品的制造和保存，例如：控制新鲜苹果等水果的氧化褐变，增加鲜切苹果等水果的抗氧化和抵抗环境胁迫的能力，即用作鲜切苹果等水果的天然抗氧化保鲜剂。
3、戊糖乳杆菌P307细菌素的蛋白酶敏感性研究
将戊糖乳杆菌P307发酵上清液分别用1.0mg/mL的脂肪酶（pH 7.5，10mmol/LPBS）、α-淀粉酶（pH 7.5，50mmol/L Tris-HCl）、过氧化氢酶（pH 7.5，50mmol/L PBS）、胰蛋白酶（pH 7.5，10mmol/L PBS）、蛋白酶K（pH 7.5，50mmol/L Tris-HCl）、木瓜蛋白酶（pH7.5，10mmol/L PBS）、胃蛋白酶（pH 2.0，0.1mol/L HCl）进行处理，37℃温育30min后，100℃加热5min 终止反应。以蜡样芽孢杆菌为指示菌，用琼脂扩散法进行抑菌试验（用10mm打孔器打孔），以未加入蛋白酶的发酵上清液作对照。
表4 经不同蛋白酶处理后抑菌圈直径及残留活性的测定结果
结果显示：
（1）经过脂肪酶、α-淀粉酶、过氧化氢酶处理后，戊糖乳杆菌P307的发酵上清液的抑菌活性几乎无损失；
（2）经过胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K处理后，戊糖乳杆菌P307的发酵上清液的抑菌效果明显减弱，尤其经过木瓜蛋白酶和胃蛋白酶处理后，戊糖乳杆菌P307的发酵上清液完全失去抑菌活性。
由此可见，戊糖乳杆菌P307发酵上清液中的抑菌物质具有蛋白质的性质，由于已经排除了有机酸和过氧化氢等的干扰，可确定此抑菌物质是一种细菌素。
4、戊糖乳杆菌P307细菌素的抑菌谱测定研究
选用蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌、单增李斯特菌等12株菌种为指示菌，分别制备不同指示菌的平板。
采用琼脂扩散法分别测定戊糖乳杆菌P307发酵上清液对供试指示菌的抑菌效果（用10mm打孔器打孔）。
表5 戊糖乳杆菌P307细菌素的抑菌谱测定结果
注：抑菌圈直径≥18mm ，抑菌能力为+++；抑菌圈直径13mm～18mm（不含），抑菌能力为++；抑菌圈直径10mm～13mm（不含），抑菌能力为+；无抑菌圈，抑菌能力为-。
结果显示：戊糖乳杆菌P307细菌素对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有明显的抑制效果，整体而言，戊糖乳杆菌P307细菌素对革兰氏阳性菌的抑制效果优于对革兰氏阴性菌的抑制效果。
四、戊糖乳杆菌P307产细菌素发酵条件研究
1、培养时间对戊糖乳杆菌P307产细菌素的影响
将戊糖乳杆菌P307按3%的接种量接种至MRS液体培养基中，37℃连续发酵培养60h。每隔5h取样，分别测定OD600nm、pH值，以蜡样芽孢杆菌为指示菌，用琼脂扩散法进行抑菌试验（用10mm打孔器打孔）。
在不同培养时间下，各样品的OD600nm、pH值和抑菌圈直径的测定结果见图6。
OD600nm和pH值的测定结果显示：戊糖乳杆菌P307在培养到第5h时进入对数生长期，此时发酵液pH值开始下降，培养到第40h左右进入稳定期，培养到第45h后pH值趋于稳定，最终pH值为3.5左右。可见戊糖乳杆菌P307产酸能力较强。
抑菌圈直径的测定结果显示：培养到第10h时开始产生细菌素，且在第20h时抑菌活性开始达到最高。
同时观察OD600nm和抑菌活性发展趋势发现可以发现：戊糖乳杆菌P307的生长和细菌素的产生存在正向关联关系。
2、不同培养温度对戊糖乳杆菌P307产细菌素的影响
将戊糖乳杆菌P307按3%的接种量接种于MRS液体培养基中，分别在30℃、35℃、37℃、40℃、42℃恒温培养24h，然后测定培养液的OD600nm值，并以蜡样芽孢杆菌为指示菌，用琼脂扩散法进行抑菌试验（用10mm打孔器打孔）。
在不同培养温度下，各样品的OD600nm和抑菌圈直径的测定结果见图7。
OD600nm和抑菌圈直径的测定结果显示：随着发酵温度的升高，戊糖乳杆菌品P307的生长呈下降趋势，并且细菌素产量也随之下降，说明不同温度对戊糖乳杆菌P307产细菌素的影响也不同，总体来说戊糖乳杆菌P307产细菌素的最适发酵温度为30℃。
3、初始pH值对戊糖乳杆菌P307产细菌素的影响
用NaOH溶液、HCl溶液分别调节MRS液体培养基至初始pH值为2、4、6、8、10，将戊糖乳杆菌P307以3%接种量分别接入上述不同初始pH值的MRS液体培养基中，30℃恒温培养24h，然后测定OD600nm值，并以蜡样芽孢杆菌为指示菌，用琼脂扩散法进行抑菌试验（用10mm打孔器打孔）。
在不同的初始pH值下，各样品的OD600nm和抑菌圈直径的测定结果见图8。
OD600nm和抑菌圈直径的测定结果显示：戊糖乳杆菌P307在pH值为2～10的范围内均能发酵产生细菌素，pH值为4时，对指示菌的抑菌活性最大。
同时观察OD600nm和抑菌活性发展趋势发现：戊糖乳杆菌P307产细菌素与细菌生长存在正向关联关系。
综上，戊糖乳杆菌P307产细菌素的最优发酵工艺具体如下：
将戊糖乳杆菌P307按3%的接种量接种到pH=4的MRS液体培养基中，30℃静置密封连续培养45h以上，直至发酵液的pH值趋于稳定。
五、戊糖乳杆菌P307在新鲜果蔬保鲜方面的研究
新鲜水果采摘后其防御能力减弱，若不采取一定的处理措施，容易被微生物侵染而导致腐烂。此外，采后水果因呼吸作用以及维持正常的生理活动，营养物质被大量消耗，水果的货架期也明显缩短。
生物保鲜技术无毒无害、无残留、无抗药性且易被降解，是实现果蔬产品无公害保鲜的有效途径，也是开发新型果蔬产品生物保鲜技术的发展方向之一。
1、活化戊糖乳杆菌P307
将戊糖乳杆菌P307以划线的方式接种至MRS固体培养基上，于37℃恒温培养箱中培养24h，然后挑单个菌落接种在MRS液体培养基中，每次活化培养 24h，完成活化。
2、制备戊糖乳杆菌P307发酵液
将活化后的戊糖乳杆菌P307接种在MRS液体培养基中，37℃静置密封培养48h，10000rpm离心10min，上清液用0.22μm膜过滤，得到戊糖乳杆菌P307发酵液。
3、保鲜试验处理
挑选新鲜苹果，常温下放置2h，随后用浓度为0.1%（w/v）的次氯酸钠溶液清洗消毒2min，之后使用无菌蒸馏水洗净苹果表面残留的次氯酸钠溶液，最后用吸水纸擦干苹果表面的水分。
将苹果转移至无菌操作台中，将苹果去皮去核后均等切成6片，每6片苹果切块为一个处理。
试验组：将鲜切苹果块浸泡在戊糖乳杆菌P307发酵液中。
对照组：不做任何处理。
将所有鲜切苹果样品晾干后装于塑料盒中，并用透气的PE保鲜膜封口。
4、指标测定
（1）失重率
将第 0d 处理晾干后的各组鲜切苹果切片使用电子天平分别进行称重并记录，结果记为 W1。
于各取样时间点（0d、2d、4d、6d和8d）称量每组样品的鲜切苹果重量，结果记录为W2。
鲜切苹果的失重率计算公式如下：
失重率（%）=[（W1-W2）/W1] ×100%
试验组和对照组鲜切苹果的失重率计算结果见图9。
结果显示：不同处理组鲜切苹果的失重率随贮藏时间的延长逐渐增加，均在贮藏终点达到最大值；总的来看，在整个贮藏期间，戊糖乳杆菌P307试验组的失重率显著低于对照组。
（2）褐变率
使用 0～4 分法评价鲜切苹果的褐变情况：
“0”分表示鲜切苹果表面无褐变；
“1”分表示轻微褐变（鲜切苹果表面褐变面积达到 5%左右）；
“2”分表示中度褐变（鲜切苹果表面褐变面积达到 5%～20%）；
“3”分表示中重度褐变（鲜切苹果表面褐变面积达到 20%～50%）；
“4”分表示完全褐变（鲜切苹果表面褐变面积达到 50%以上）。
褐变率（%）=[Σ（k×f）/N×D]×100%
式中：k表示褐变程度的赋值分数，f表示赋值分数对应苹果块数，N表示各组苹果块数，D表示发生完全褐变时的赋值分数。
试验组和对照组鲜切苹果的褐变率计算结果见图10。
结果显示：随贮藏时间的延长，不同处理组鲜切苹果的褐变率也随之增加，均在贮藏期终点达到最大值；总的来看，在整个贮藏期间，戊糖乳杆菌P307试验组的褐变率显著低于对照组。
（3）DPPH自由基清除能力测定
DPPH常用于抗氧化成分的抗氧化能力评价，它不特定作用于任何特定的抗氧化化合物。DPPH 的醇溶液呈紫红色，加入具不同抗氧化能力的溶液后，DPPH 的醇溶液颜色会发生变化，可根据不同的吸光值来反映样品的抗氧化能力。
取10g鲜切苹果块粉碎榨汁，收集苹果汁，于4℃、12000×g离心 15min，吸取100μL的澄清上清液加入到3.9mL甲醇DPPH溶液（0.025g/L）中，对照组使用100μL蒸馏水，常温下于黑暗中剧烈震荡30min，在波长515nm处读取吸光值，测量前用甲醇溶液调零。对照组吸光值记为AC，样品组吸光值记为AS。
DPPH自由基清除率（%）=100%×（AC-AS）/AC
试验组和对照组鲜切苹果的DPPH自由基清除能力的计算结果见图11。
结果显示：随贮藏时间延长，不同处理组鲜切苹果对DPPH自由基的清除能力逐渐下降，在贮藏终点达到最低值；在整个贮藏期间，戊糖乳杆菌P307试验组对DPPH 自由基的清除率显著高于对照组。
（4）感官评价
由7名学生组成的评定小组对鲜切苹果切片进行感官评估，对鲜切苹果切片进行可接受性评价，根据观察到的鲜切苹果切片的光泽、颜色、气味、外观和总体可接受性参数，对鲜切苹果切片做出依据感官嗜好的可接受性评价：
“1”分表示极度不喜欢，完全不能接受；
“5”分为临界值，表示既不喜欢也不讨厌；
“9”分表示极度喜欢，完全能够接受。
表6 感官评估结果
结果显示：随贮藏时间延长，评定小组成员对不同处理组鲜切苹果的感官评价均持续下降；达到贮藏终点时，对照组的感官评价平均分为4分，戊糖乳杆菌P307试验组的最终平均分为6.2分，试验组分数显著高于对照组。
上述试验表明：戊糖乳杆菌P307可有效控制鲜切苹果的氧化褐变，增加鲜切苹果的抗氧化和抵抗环境胁迫的能力，是鲜切苹果等水果的良好的天然抗氧化保鲜剂来源。
六、戊糖乳杆菌P307在水产品防腐保鲜方面的研究
在水产品低温贮藏的过程中，希瓦氏菌通常是引起水产品腐败变质的优势细菌，因此，在防腐保鲜中抑制该菌属的生长显得十分重要。
弧菌是引起海水养殖动物患病或死亡的主要致病菌，其致病性强，能够引起水产养殖中虾类的发病，造成大规模死亡，同时弧菌可使人类食物中毒，导致食用者发生腹泻、呕吐，从而危害食用者生命健康。
以海洋青虾为试验对象，采用浸渍的处理方式，在4℃的恒温箱中贮存，以pH值、挥发性盐基氮（TVB-N值）、菌落总数为指标，探究戊糖乳杆菌P307在水产品防腐保鲜方面的应用效果。
1、活化戊糖乳杆菌P307
将戊糖乳杆菌P307以划线的方式接种至MRS固体培养基上，于37℃恒温培养箱中培养24h，然后挑单个菌落接种在MRS液体培养基中，每次活化培养 24h，完成活化。
2、制备戊糖乳杆菌P307发酵液
将活化后的戊糖乳杆菌P307接种在MRS液体培养基中，37℃静置密封培养48h，10000rpm离心10min，上清液用0.22μm膜过滤，得到戊糖乳杆菌P307发酵液。
3、戊糖乳杆菌P307对海青虾常规鲜度指标的影响研究
选取大小和品相相似的鲜活海青虾，在低温下猝死，随机分为对照组和试验组，每组20只，试验组放在1L戊糖乳杆菌P307发酵液中浸泡15min，捞出沥水，分装在自封袋里，放在4℃的冰箱中贮藏，对照组以无菌水代替戊糖乳杆菌P307发酵液，每天每组取出3只，测定在冷藏过程中不同指标（pH值、挥发性盐基氮、菌落总数）的变化。
（1）pH值
冷藏虾肉pH值的变化通常反映了虾肉中蛋白质和糖类物质的分解情况，从而能够反映出虾肉的品质状态。
从3只海青虾中取虾肉5g，充分剪碎并研磨，加入煮沸后冷却的蒸馏水50mL，用玻璃棒搅拌摇匀，静置15～30min后进行过滤，测定滤液的pH值。
在不同贮藏时间下，各组冷藏虾肉的pH值的测定结果见图12。
结果显示：对照组与试验组的虾肉pH值在第0d～2d期间显著下降；在冷藏第2d之后，两组的pH值开始逐渐升高, 且从冷藏的第2d开始，试验组的虾肉pH值在冷藏期间一直小于对照组，这是因为鲜虾致死后，随着冷藏天数的延长，虾肉在腐败变质的过程中，机体含有的糖原、ATP 会首先进行物质分解和能量消耗，在这个过程中会产生许多的乳酸、磷酸等趋于酸性的物质，使虾肉的pH值发生一定的降低，当分解一段时间后，虾肉就会开始进入自溶腐败的过程，在这个过程中，虾肉作为高蛋白食材，在其自身活性酶和大量腐败微生物的作用下会将含氮物质进行分解，分解形成挥发性盐基氮、组胺以及其他碱性含氮物质，从而促使虾肉的pH值提高。
通过对比试验组和对照组可以看出：试验组能够有效抑制虾肉的pH值的变化，说明戊糖乳杆菌P307发酵液中的细菌素能够在一定程度上抑制虾肉酶的活性以及微生物（特别是腐败菌）的生命活动，具有一定的保鲜效果。
（2）挥发性盐基氮
海水鱼虾经冰温致死后，其机体中蛋白质、氨基酸等物质就会开始发生降解，从而产生挥发性盐基氮（TVB-N）。TNB-N能够表征食品的腐败程度，作为食品腐败的重要指标，根据《GB 2733-2015》中规定，海水鱼虾的TVB-N值达到30mg/100g 可以作为水产品腐败变质的标准。
按照现行的标准《GB 5009.228-2016》中海水鱼虾中挥发性盐基氮的测定方法进行测定。
在4℃贮藏过程中，虾肉的TVB-N值会发生变化。在不同贮藏时间下，各组冷藏虾肉中的TVB-N值的测定结果见图13。
通过参照《SC/T 3113-2002 》中有关鲜度指标要求，海水虾的二级鲜度和三级级鲜度的指标值最大分别为20mg/100g 和25mg/100g的规定，可以得出：
对照组在第4d左右达到二级鲜度最大值，试验组大约在第6d还未达到二级鲜度的指标上限。
通过参照《GB 2733-2015》关于鲜、冻动物性水产品中TVB-N值达到30mg/100g时不可食用的理化指标规定，可以得出：
对照组在第8d达到最大限值, 试验组大约在第6d还未达到三级鲜度的指标上限。
可见，糖乳杆菌P307发酵液中的细菌素能够有效减缓虾肉中蛋白质等含氮物质的挥发，有效保证虾肉的鲜度，从而达到延长虾肉保藏期的目的。
（3）菌落总数
微生物菌落总数的变化在一定程度上可以反映食品的腐败状况。参考《GB4789.2-2016》，食品细菌总数（CFU/g）≤105时为一级鲜度，≤5×105时为二级鲜度，当达到106时，就达到最大货架期，表明不可食用。
取出待处理的虾肉，在超净无菌工作台中准确称取虾肉1g并剪碎，加入到含9mL无菌蒸馏水的试管中，反复吹打使其充分混匀。取不同稀释梯度的稀释液1mL，置于灭菌培养皿中，与平板计数琼脂培养基混合，进行倾注培养，在30±1℃条件下培养48h，记录菌落数量，依据稀释倍数计算菌落总数，结果以菌落总数的对数表示。
在不同贮藏时间下，各组冷藏虾肉中的菌落总数的测定结果见图14。
结果显示：随冷藏时间的延长，对照组和试验组的虾肉的菌落总数均快速增多，说明微生物在虾肉冷藏期间仍然能大量生长繁殖；在4℃冷藏期间，对照组在第4d时已达到二级限度的最大限值，第6d就已经达到货架期终点，不可食用；试验组在第6d达到二级鲜度的最大限值，在第8d达到货架期终点，但试验组虾肉的细菌总数始终小于对照组的虾肉，说明戊糖乳杆菌P307发酵液中的细菌素能够很好地抑制虾肉腐败细菌的生长，起到一定的防腐保鲜的作用。
将试验组和对照组的菌落总数的变化情况以及TVB-N值的变化规律进行比较，可以发现：菌落总数和TVB-N值这两个指标的变化规律基本一致。这表明腐败微生物的大量繁殖能够将虾肉中蛋白质及其他含氮物质进行分解，是虾肉腐败变质的主要原因。
综上，通过探究戊糖乳杆菌P307在虾肉保鲜中的应用，发现在冷藏期间虾肉的pH值、菌落总数、TVB-N值都明显升高，在最小抑菌浓度下，试验组能够有效延迟海青虾虾肉的pH值变化、菌落总数、TVB-N值变化，与对照组虾肉的冷藏货架期相比明显延长2～3d，说明戊糖乳杆菌P307发酵液中的细菌素在水产品防腐保鲜方面具有一定的应用价值。此外，戊糖乳杆菌P307能适应低盐环境，可直接将其接种至海鲜原料当中，作为海鱼等食品的风味品质调节微生物。
需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (3)

1.一株戊糖乳杆菌P307，其特征在于，所述戊糖乳杆菌P307从刺参内脏发酵物中分离、纯化得到，能够适应低盐环境，并且发酵代谢产生细菌素，该戊糖乳杆菌P307保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，保藏日期为2022年7月8日，保藏编号为CCTCCNO：M 20221055，分类命名为戊糖乳杆菌P307 Lactobacillus pentosus P307。
2.权利要求1所述的戊糖乳杆菌P307在果蔬抗氧化保鲜中的应用。
3.权利要求1所述的戊糖乳杆菌P307在水产品防腐保鲜中的应用。
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