CN115725459B - 一种植物乳杆菌hyy-s10及其筛选方法、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物乳杆菌HYY‑S10，将从茶叶中分离培养得到的植物乳杆菌HYY‑S10具有高产酸、高胆固醇降解率以及耐酸、耐胆盐、抗生素敏感性、抑菌能力显著的优点，并将该植物乳杆菌HYY‑S10应用于茶酒的制作中，能作为助剂使用，方便工业生产的同时，还能适应于茶酒的发酵工艺中，酒精转化率高，杂质少，制作的茶酒口感协调，风味独特。
Description
技术领域
本发明涉及酿造领域，具体而言，涉及一种植物乳杆菌HYY-S10及其筛选方法、应用。
背景技术
茶酒主要分为发酵型、配制型和汽酒型。目前茶酒具有酒精度低，色泽鲜明透亮，入口软绵等特点。乳酸菌是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的统称。这类细菌在自然界中分布极为广泛，具有丰富的物种多样性，至少包含18个属，共200多种，除极少数外，其绝大部分广泛存在于人体的肠道中，是人体内必不可少且具有重要生理功能的菌群，因此，食用一定量乳杆菌有助于人体健康，而现有技术中也缺少乳酸菌在酒中稳定存在的对应的饮料。现有技术中也有通过将茶添加至不同度数的酒中，用酒浸渍茶叶中的有效成分，然后进行混配勾兑。现有技术中普通存在茶叶利用率低，营养物质丢失严重，且得到茶酒口感差，生产周期长，产品容易出现质量不稳定的问题，主要表现在颜色加重、氧化感增加、茶香变淡、失光、沉淀等方面。
发明内容
基于此，为了解决现有技术中普通存在茶叶利用率低，营养物质丢失严重，且得到茶酒口感差，生产周期长，产品容易出现质量不稳定的问题，本发明提供了一种植物乳杆菌HYY-S10及其筛选方法、应用，具体技术方案如下：
一种植物乳杆菌HYY-S10，所述植物乳杆菌HYY-S10的命名为Lactiplantibacillus plantarum HYY-S10，菌种保藏编号为GDMCC NO.62784。
本发明提供一种如权利要求1所述的植物乳杆菌HYY-S10的筛选方法,所述筛选方法包括以下步骤：
将茶叶置于MRS培养基中进行培养，然后将过滤液稀释涂布于含有碳酸钙的平板上，再选取溶钙圈的菌落，得到植物乳杆菌HYY-S10。
进一步地，所述培养的时间为24h-48h，温度为35℃-37℃，pH为5.4，密闭培养。
本发明还提供一种植物乳杆菌HYY-S10的应用，所述应用为植物乳杆菌HYY-S10在茶酒制备中的应用。
进一步地，所述茶酒的制备方法包括以下步骤：
将脱脂乳粉添加至水中，配置得到所述脱脂乳粉占总体积6％的脱脂乳粉溶液；
将脱脂乳粉溶液以及植物乳杆菌HYY-S10混合均匀，然后于-20℃的条件下预冻4h-6h，再利用冻干机进行冻干处理10min-60min，得到植物乳杆菌HYY-S10助剂；
将茶叶以及大米添加至水中，混合均匀后，加入所述植物乳杆菌HYY-S10助剂，发酵处理后，过滤，得到茶酒。
进一步地，按照体积比，脱脂乳粉溶液以及植物乳杆菌HYY-S10的比例为3-5:1-3。
进一步地，按照质量比，所述茶叶与所述大米的比例为4-6:1-5。
进一步地，所述茶叶需要经过风干晒青，然后在温度为100℃-175℃下翻炒5min-15min。
进一步地，所述发酵处理的工艺为：条件为：在28℃恒温箱中糖化48h-50h，然后适当补充无菌水，再放置20℃-40℃的条件下培养10d-20d。
进一步地，所述大米为糯米，需要提前浸泡20h-24h，然后蒸煮30min，再冷却至35℃以下，备用。
上述方案中通过将从茶叶中分离培养得到的植物乳杆菌HYY-S10具有高产酸、高胆固醇降解率以及耐酸、耐胆盐、抗生素敏感性、抑菌能力显著的优点，并将该植物乳杆菌HYY-S10应用于茶酒的制作中，能作为助剂使用，方便工业生产的同时，还能适应于茶酒的发酵工艺中，酒精转化率高，杂质少，制作的茶酒口感协调，风味独特。
附图说明
图1是本发明实施例1的植物乳杆菌HYY-S10的革兰氏染色形态图；
图2是本发明实施例1的植物乳杆菌HYY-S10的产酸曲线示意图；
图3是本发明实施例1的植物乳杆菌HYY-S10的对炎症因子的作用示意图；
图4为结肠HE染色图CK组示意图；
图5为结肠HE染色图DSS模型组示意图；
图6为结肠HE染色图SASP阳性对照组示意图；
图7为结肠HE染色图S10实验组示意图。
具体实施方式
为了使得本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合其实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用以解释本发明，并不限定本发明的保护范围。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明一实施例中的一种植物乳杆菌HYY-S10，所述植物乳杆菌HYY-S10的命名为Lactiplantibacillus plantarum HYY-S10，菌种保藏编号为GDMCC NO.62784；保藏单位为广东微生物菌种保藏中心，地址在广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；保藏时间为2022年09月09日并于2022年09月09日检测，结果是存活。
本发明提供一种如权利要求1所述的植物乳杆菌HYY-S10的筛选方法,所述筛选方法包括以下步骤：
将茶叶置于MRS培养基中进行培养，然后将过滤液稀释涂布于含有碳酸钙的平板上，再选取溶钙圈的菌落，得到植物乳杆菌HYY-S10。
在其中一个实施例中，所述培养的时间为24h-48h，温度为35℃-37℃，pH为5.4，密闭培养。
本发明还提供一种植物乳杆菌HYY-S10的应用，所述应用为植物乳杆菌HYY-S10在茶酒制备中的应用。
在其中一个实施例中，所述茶酒的制备方法包括以下步骤：
将脱脂乳粉添加至水中，配置得到所述脱脂乳粉占总体积6％的脱脂乳粉溶液；
将脱脂乳粉溶液以及植物乳杆菌HYY-S10混合均匀，然后于-20℃的条件下预冻4h-6h，再利用冻干机进行冻干处理10min-60min，得到植物乳杆菌HYY-S10助剂；
将茶叶以及大米添加至水中，混合均匀后，加入所述植物乳杆菌HYY-S10助剂，发酵处理后，过滤，得到茶酒。
在其中一个实施例中，按照体积比，脱脂乳粉溶液以及植物乳杆菌HYY-S10的比例为3-5:1-3。
在其中一个实施例中，按照质量比，所述茶叶与所述大米的比例为4-6:1-5。
在其中一个实施例中，所述茶叶需要经过风干晒青，然后在温度为100℃-175℃下翻炒5min-15min。
在其中一个实施例中，所述发酵处理的工艺为：条件为：在28℃恒温箱中糖化48h-50h，然后适当补充无菌水，再放置20℃-40℃的条件下培养10d-20d。
在其中一个实施例中，所述大米为糯米，需要提前浸泡20h-24h，然后蒸煮30min，再冷却至35℃以下，备用。
在其中一个实施例中，所述茶叶为德昂酸茶。
上述方案中通过将从茶叶中分离培养得到的植物乳杆菌HYY-S10具有高产酸、高胆固醇降解率以及耐酸、耐胆盐、抗生素敏感性、抑菌能力显著的优点，并将该植物乳杆菌HYY-S10应用于茶酒的制作中，能作为助剂使用，方便工业生产的同时，还能适应于茶酒的发酵工艺中，酒精转化率高，杂质少，制作的茶酒口感协调，风味独特。
下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例1：
将德昂酸茶培养于MRS培养基中，于35-37℃，pH＝5.4，密闭培养24h，然后取过滤液稀释涂布于含有碳酸钙的平板上，选取具有溶钙圈的菌落，得到植物乳杆菌HYY-S10。
一.将实施例1得到的植物乳酸杆菌进行生理生化特征鉴定，设置5组试验，结果如下表1所示。
表1：
注：“+”表示阳性；“-”表示阴性。
从表1中可知看出并如图1所示，植物乳杆菌HYY-S10的形态，本申请的植物乳杆菌HYY-S10具有过氧化氢酶阴性、淀粉水解阴性、VP试验阴性、MR试验阳性、明胶液化阴性、吲哚试验阴性的理化性质。
二.将植物乳杆菌HYY-S10的耐酸耐胆盐能力进行评价，具有的条件以及结果如表2所示。
表2：
注：“+++”表示生长良好；“++”表示生长一般；“+”表示生长较弱；“-”表示不生长。
从表2中分析可知：本申请的植物乳杆菌HYY-S10具有耐酸、耐胆盐、高胆固醇降解率、高产酸、对多种抗生素敏感、抑菌能力较强的益生性能。
三.将植物乳杆菌HYY-S10的抗生素敏感性采用滤纸片扩散法分析，结果如表3所示。
表3：
注：“S”表示敏感；“M”表示中度敏感；“R”表示耐药。
从表3分析可知，本申请的植物乳杆菌HYY-S10具有优异的耐药性，具有更广阔的使用性能。
四.抑菌能力，在营养琼脂培养基上水平放置牛津杯，在牛津杯中分别加入菌液,37℃培养24h,用游标卡尺测量抑菌圈直径。结果如表4所示。
表4：
从表4中分析可知，本申请从茶叶中提取的植物乳杆菌HYY-S10，具有优异的抑菌作用，对有害菌的抑制，能保证其其应用的安全性。
五.将植物乳杆菌HYY-S10按3％的接种量接种至MRS-CHOL液体培养基中，30℃培养48h后，2500rpm/min，离心10分钟，取上清液待测，以未接菌的胆固醇培养基作为对照，用南京建成生物工程研究所的总胆固醇TC含量测试盒测定菌株对胆固醇的降解能力及降解率，并挑选出了其中各项性能最好、最适合的一株菌株；结果如表5所示。
表5：
| 菌种编号 | 样品来源 | 胆固醇降解率 |
| S6 | 湿茶 | 89.72％ |
| S10 | 湿茶 | 91.00％ |
| S11 | 湿茶 | 84.24％ |
| S29 | 湿茶 | 75.91％ |
| 干30 | 干茶 | 74.79％ |
从表5可以看出，本申请优选的的植物乳杆菌HYY-S10具有优异的胆固醇降解能力。
六.取实施例1的植物乳杆菌HYY-S10以1×109CFU/mL的接种量，分别接种于150mL无碳酸钙的葡萄糖发酵培养基，36℃、120r/min条件下振荡培养。分别于0、12、24和36h取样检测用精密酸度计测pH值并绘制变化曲线，结果如图1所示。从图2中可以看出植物乳杆菌HYY-S10产酸值。
七.通过小鼠实验证明了植物乳杆菌HYY-S10具有很好的抗UC作用，并且使结肠炎症状得到改善，与NF-κBp65和Nrf2信号通路有关。如图3所示，与空白对照组和阳性对照组组比较，DSS模型组小鼠体重下降、脾重显著升高、结肠长度显著缩短、血清中炎症因子IFN-γ、IL-6、LPS、IL-1β含量显著升高、IL-10含量明显降低、结肠组织表现出明显的黏膜损伤，浸润腺上皮等病理改变。与DSS模型组比较，植物乳杆菌HYY-S10S10给药组小鼠的体重增加、脾重无明显改变、结肠长度显著升高、结肠组织病理情况得到改善、血清中炎症因子IFN-γ、IL-6、LPS、IL-1β含量表达水平显著降低、IL-10含量表达水平明显升高。
实施例2：
将实施例1制备的植物乳杆菌HYY-S10应用于茶酒的制备中，具体的茶酒的制备方法如下：
将脱脂乳粉添加至水中，配置得到所述脱脂乳粉占总体积6％的脱脂乳粉溶液；
按照体积比为3:1的脱脂乳粉溶液以及植物乳杆菌HYY-S10混合均匀，然后于-20℃的条件下预冻4h，再利用冻干机进行冻干处理30min，得到植物乳杆菌HYY-S10助剂；
将德昂酸茶经过风干晒青，然后在温度为175℃下翻炒10min，备用；将糯米提前浸泡20h，然后蒸煮30min，再冷却至35℃以下，备用；
将质量比为4:3的上述处理后的德昂酸茶以及糯米添加至水中，混合均匀后，加入所述植物乳杆菌HYY-S10助剂，在28℃恒温箱中糖化48h，然后适当补充无菌水，再放置28℃的条件下培养10d，发酵处理完成后，过滤，得到茶酒。
对实施例2得到茶酒进行感官评价，结果如下表6所示。
表6：
从表6中可以看出，将本申请的植物乳杆菌HYY-S10应用于茶酒的制备工艺中，能赋予茶酒显著的口感。对茶酒的理化性质和卫生品质进行分析。对酒精度值与总酸量、可溶性固形物、茶多酚含量、可溶性糖、游离氨基酸含量、咖啡碱、黄酮、茶黄素、茶红素、茶褐素、色度、透光度进行测定，儿茶素采用高效液相色谱法测定，并采用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)对茶酒中天然风味物质的复杂组分进行结构的定性定量分析。所述用HPLC法分析和测定茶酒儿茶素单体含量，结论认为发酵过的茶酒比对照有降低。但经植物乳杆菌HYY-S10S10发酵液处理过的茶酒，其含量提高幅度较大。所述该实验采用HPLC法测定茶酒21个游离氨基酸成分，发现茶酒所含氨基酸少于对照。经发酵处理茶酒游离氨基酸含量比对照降低幅度大。各种氨基酸组分都有较大的下降。所述茶酒中香气成分分析中，茶酒和对照香气种类及含量差异显着，茶酒香气物质以醇类为主，对照样以醇类，烷烃类和芳香族类为主，茶酒香气物质以苯乙醇最多。本申请的茶酒也具有稳定性高的优点。
另外，为了作对比，直接将茶叶倒进50度的酒中进行茶酒制造，结果显示，得到茶酒风味较差，茶叶并不能得到充分的发酵。
从图4-图7分析可知，HE染色结果显示,空白组小鼠结肠组织黏膜完整,肠绒毛排列紧密,绒毛上皮内可见完整隐窝和杯状细胞,组织形态结构正常,无明显病理变化；DSS模型组小鼠结肠组织可见稍微的炎性细胞浸润,组织结构明显受到损坏,隐窝表面不规则，隐窝大小和方向改变或缺失，杯状细胞缺失；柳氮磺吡啶(SASP)给药较为有效地改善结肠组织炎性浸润,恢复隐窝结构,减轻慢性结肠炎病理损伤；与DSS模型组相比，S10实验组也有效地改善结肠组织炎性浸润,恢复隐窝结构,减轻慢性结肠炎病理损伤。证明植物乳杆菌HYY-S10S10可显著改善结肠炎小鼠的病理状态。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (8)
1.一种植物乳杆菌Lactiplantibacillus plantarum HYY-S10，其特征在于，所述植物乳杆菌Lactiplantibacillus plantarum HYY-S10的菌种保藏编号为GDMCC NO.62784。
2.一种植物乳杆菌Lactiplantibacillus plantarum HYY-S10的应用，其特征在于，所述应用为权利要求1所述植物乳杆菌Lactiplantibacillus plantarum HYY-S10在茶酒制备中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述茶酒的制备方法包括以下步骤：
将脱脂乳粉添加至水中，配置得到所述脱脂乳粉占总体积6％的脱脂乳粉溶液；
将脱脂乳粉溶液以及植物乳杆菌HYY-S10混合均匀，然后于-20℃的条件下预冻4h-6h，再利用冻干机进行冻干处理10min-60min，得到植物乳杆菌HYY-S10助剂；
将茶叶以及大米添加至水中，混合均匀后，加入所述植物乳杆菌HYY-S10助剂，发酵处理后，过滤，得到茶酒。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，按照体积比，脱脂乳粉溶液以及植物乳杆菌HYY-S10的比例为3-5:1-3。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，按照质量比，所述茶叶与所述大米的比例为4-6:1-5。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述茶叶需要经过风干晒青，然后在温度为100℃-175℃下翻炒5min-15min。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述发酵处理的工艺为：在28℃恒温箱中糖化48h-50h，然后适当补充无菌水，再放置20℃-40℃的条件下培养10d-20d。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述大米为糯米，需要提前浸泡20h-24h，然后蒸煮30min，再冷却至35℃以下，备用。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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