CN109055273B - 一种青砖茶渥堆发酵菌株组合物及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种青砖茶渥堆发酵的菌株组合物，属于微生物菌株技术领域。所述青砖茶渥堆发酵的菌株组合物包括枯草芽孢杆菌和烟曲霉，其中，所述枯草芽孢杆菌保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2018288；所述烟曲霉保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2018287。本发明采用枯草芽孢杆菌和烟曲霉这两种菌株进行纯种渥堆发酵，不仅产品成分与传统开放式渥堆发酵相同，而且风味相同，与传统开放式的利用环境中的微生物自然渥堆工艺相比，时间可缩短4周左右，且不易受杂菌污染，有利于增加企业效益、提升和稳定产品质量。

Description

一种青砖茶渥堆发酵菌株组合物及应用

技术领域

本发明属于青砖茶发酵技术领域，具体涉一种青砖茶渥堆发酵菌株组合物及应用。

背景技术

青砖茶属于黑茶，是一种后发酵茶，它以晒干的老青茶为原料，经过自然发酵后压制而成。它主要产于湖北的咸宁地区，已有一百多年的生产历史。青砖茶具有消除油腻、降脂减肥、补充维生素等功能，可以消除边疆少数民族因特殊饮食习惯带来的健康威胁。在很长一段时间内，青砖茶都是“政策性商品、定点生产、统购统销”，是边疆少数民族不可或缺的生活必需品。

渥堆是形成青砖茶品质的关键工序，传统的青砖茶渥堆主要依靠经验进行控制，极大限制了茶叶品质的保证及现代发酵工艺的运用。因此，了解青砖茶渥堆过程中微生物的群落结构，从而选出并发展潜在的发酵剂，缩短渥堆发酵的时间，做到清洁化、规范化生产。

青砖茶其品质形成的关键工序是渥堆和仓储陈化，其中渥堆实质是利用空气中悬浮的微生物自然着生于茶坯上产生胞外酶而引发一系列剧烈的化学反应，叶片温度也逐渐升高，湿热作用和微生物作用交替进行，从而形成了汤色红褐、滋味醇厚、陈香四溢的青砖茶。在“渥堆”这一形成青砖茶独特风味的一个重要工序中，如何促进有益微生物发挥作用，控制不利微生物的繁殖，是保证其良好品质形成的关键。本发明利用分离得到的对青砖茶品质形成有利的高温型菌种，采用人工接种渥堆的方法，既可以缩短渥堆周期，又能避免不利于品质的杂菌干扰，从而有利于稳定和提高茶叶品质。

经检索发现，多篇研究论文中均有报道渥堆发酵青砖茶的，且以黑曲霉报道最多。目前还没有从普洱茶渥堆发酵中分离得到烟曲霉、以及将烟曲霉用于青砖茶的发酵加工中的报道，也没有报道仅利用两种菌株能在一周时间内将晒青毛茶中各主要品质成分的含量发酵至理想的渥堆茶样水平。

发明内容

本发明提供了一种青砖茶渥堆发酵的菌株组合物，所述青砖茶渥堆发酵的菌株组合物包括枯草芽孢杆菌和烟曲霉，其中，所述枯草芽孢杆菌保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2018288；所述烟曲霉保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2018287。

进一步，所述枯草芽孢杆菌和烟曲霉的混合比例为：2:1～1:3。

进一步，所述枯草芽孢杆菌的菌落特征为：菌落表面呈淡黄色，菌落表面粗糙有皱褶，边缘不整齐，表面干燥不透明无光泽，革兰氏反应呈阳性，无荚膜，单个菌体细胞呈杆状，两端钝圆，孢囊无明显膨胀。

进一步，所述烟曲霉的菌落特征为：菌落呈圆形，菌落表面呈绒毛状，中心淡青色，边缘灰白色，表面干燥不透明，菌丝有隔，分生孢子球形，分生孢子梗顶端形成膨大的球形顶囊。

本发明还提供一种青砖茶渥堆混菌发酵液，所述青砖茶渥堆混菌发酵液为枯草芽孢杆菌菌液和烟曲霉菌液的混合液，其中，所述枯草芽孢杆菌保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2018288；所述烟曲霉保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2018287。

进一步，所述枯草芽孢杆菌菌液中，枯草芽孢杆菌菌体细胞的数量在10^6-10⁷个/mL。

进一步，所述烟曲霉菌液中，烟曲霉菌丝段在10^6-10⁷个/mL。

进一步，所述枯草芽孢杆菌菌液和烟曲霉菌液的混合比例为：2:1～1:3。

本发明提供的所述青砖茶渥堆发酵的菌株组合物可以用于加快青砖茶的渥堆反应速度，且保持传统渥堆发酵的成分和风味不变。

本发明提供的所述青砖茶渥堆混菌发酵液也可以用于加快青砖茶的渥堆反应速度，且保持传统渥堆发酵的成分和风味不变。

有益效果

纤维素酶、果胶酶、蛋白酶和多酚氧化酶是参与青砖茶制作的关键酶类，是决定青砖茶品质的重要因素。在黑茶渥堆发酵过程中，揉捻叶粗老、硬脆、粘手感极差，而通过渥堆发酵中纤维素酶的作用会逐渐软化；在青砖茶的加工中，果胶酶会使果胶水解成小分子糖类物质，减少茶叶的“丝网络”，增强茶汤的醇和度，从而增加青砖茶的品质风味；蛋白酶是水解酶类的一种，可催化茶叶中的蛋白质水解形成各种氨基酸，不仅可减少一些不溶性的复合物产生，而且能改善茶叶的香气和鲜爽度，提高茶汤的质量；茶多酚的主要成分儿茶素在多酚氧化酶的作用下，氧化缩聚成茶褐素。

本发明分离纯化得到的高温优势菌株枯草芽孢杆菌X4和M1烟曲霉，各具有独特的酶学特性。由表1所示，枯草芽孢杆菌X4能够同时产生较多的纤维素酶、果胶酶和蛋白酶，但是不能产生多酚氧化酶，而霉菌菌株M1能够同时产生纤维素酶、果胶酶、蛋白酶和多酚氧化酶。

本发明中，各数据的测定方式如下：

1、酶活的测定

纤维素酶活性测定：3，5-二硝基水杨酸(DNS)定糖法。取1mL粗酶液置于对照管和样品管，对照管先加2mL DNS溶液破坏酶活性，再分别加预热的pH4.8，质量分数为1.0％的羧甲基纤维素(CMC)溶液2mL于两管中。置于40℃恒温水浴中反应30min，立即取出在样品管加入2mL DNS溶液终止反应。然后于沸水中煮沸5min，取出流水冷却，定容至25mL，于540nm波长处测定吸光值。

m₁-标准曲线查出的释放葡萄糖的质量/ug

t-酶解所用时间/min

m₂-样品质量/g

果胶酶活性测定：底物改为质量分数0.25％的预热果胶液，其他步骤同纤维素酶活性测定方法。

蛋白酶活性测定：采用福林酚(Folin)法。取1mL酶液于40℃水浴预热3min，再加入1mL已预热的酪蛋白，40℃水浴15min后迅速加入2mL三氯乙酸溶液，沉淀10min，5000r/min离心10min，对照为在加入酪蛋白前首先加2mL三氯乙酸溶液以钝化酶的活性，其余同上。取上清1mL，加入5mL Na2CO3溶液和1mL Folin试剂，40℃恒温水浴20min，取出后于660nm处比色。

C-为从标准曲线上查得的酪氨酸的质量/ug

n-为稀释倍数

V-参与反应的酶液体积/mL

t-酶解所用时间/min

M₀-样品质量/g

多酚氧化酶活性测定：分别取酶液1.5mL于空白管和样品管，加反应混合液3mL(反应混合液按体积比为10:2:3的柠檬酸磷酸缓冲液(pH5.6)、质量分数0.1％脯氨酸、质量分数2％邻苯二酚配制，空白管中邻苯二酚用缓冲液代替)。然后在37℃恒温水浴锅中保温10min，立即加入1mL 20％的三氯乙酸终止反应。于460nm波长处测定吸光值。

t-酶解所用时间/min

m-样品质量/g

E₄₆₀-吸光值

2、茶多酚含量的测定

参照《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》(GB/T 8313-2008)中的方法二，具体操作方法如下：

(1)没食子酸标准储备液(现配)

准确称取0.110g没食子酸，置于100mL容量瓶中，用重蒸水溶解并定容至刻度，摇匀后避光保存。

(2)没食子酸工作液

用移液管分别量取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL的没食子酸标准储备溶液置于100mL容量瓶中，分别用重蒸水定容至刻度并摇匀，配置成浓度分别为10，20，30，40，50μg/mL的工作液。

(3)母液的制备

准确称取0.2g(精确至0.0001g)磨碎后的茶样置于10mL离心管中，加入5mL经70℃预热过的70％甲醇，玻璃棒搅拌均匀后移入70℃水浴中浸提10min(每隔5min搅拌一次)，浸提后冷却至室温，转入离心机3500r/min下离心10min，上清液转移至10mL容量瓶中，残渣再用5mL预热过的70％甲醇提取一次，重复以上步骤。合并提取液，并用70％的甲醇定容至10mL，摇匀待用。

(4)测试液的制备

移取1mL母液置于100mL容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀待测。

(5)测定

分别移取1mL没食子酸工作液、水和测试液置于刻度试管内，每支试管内加入5mL福林酚试剂，摇匀后反应3-8min，加入4mL7.5％的Na₂CO₃溶液，摇匀后室温下放置60min。用10mm比色皿在765nm波长条件下用分光光度计测定吸光度(A)。

A-样品测试液吸光度

V-样品提取液体积，10mL

d-稀释因子(通常为1mL稀释成100mL，则稀释因子为100)

SLOPEstd-没食子酸标准曲线的斜率

m-样品干物质含量，％

m₁-样品质量，g

3、儿茶素含量的测定

采用香荚兰素比色法，具体操作方法如下：

(1)供试液的制备

准确称取2g粉碎后的茶样置于100mL磨口锥形瓶中，加入20mL的95％乙醇，在80-85℃的水浴中提取30min，结束后过滤，用95％乙醇定容至25mL。

(2)测定

吸取20uL供试液，注入盛有1mL95％乙醇的具塞试管内，摇匀后再加入5mL1％香荚兰素盐酸溶液，加塞后摇匀，放置40min后，用10mm比色皿在500nm波长条件下用分光光度计测定吸光度(A)。

L₁-样品供试液的总量(mL)

L₂-测定时的用液量(mL)

M-试样的质量(g)

W-试样的干物质含量(％)

A-试样的吸光度

4、氨基酸含量的测定

参照《茶游离氨基酸总量测定》(GB/T 8314-2002)，具体操作方法如下：

(1)谷氨酸标准曲线的绘制

准确称取100mg谷氨酸溶于水中，然后依次稀释成如下浓度：40ug/mL、80ug/mL、160ug/mL、240ug/mL、320ug/mL。分别移取1mL各浓度溶液置于25mL容量瓶中，再分别添加0.5mL缓冲液和0.5mL茚三酮显色剂，沸水中加热15min，冷却后加水定容至25mL，放置10-15min，用10mm比色皿在570nm波长条件下用分光光度计测定吸光度(A)。以A为纵坐标，氨基酸浓度为横坐标作图，即可绘制成标准曲线。

(2)试液制备及测定

准确称取3g粉碎后的茶样置于500mL锥形瓶中，添加450mL沸水并在沸水浴中浸提45min，每隔10min震荡一次，趁热减压过滤，冷却后定容至500mL。取1mL供试液置于25mL容量瓶中，再添加0.5mL缓冲液和0.5mL茚三酮显色剂，方法同上。

L₁-试液总量，mL

L₂-测定用试液量，mL

M₀-样品质量，g

C-根据吸光度从标准曲线上查得的谷氨酸毫克数

m-试样干物质含量，％

5、可溶性糖含量的测定

(1)葡萄糖标准曲线的绘制

称取无水葡萄糖分别配置成25、50、100、150、200ug/mL的葡萄糖标准溶液，分别吸取1mL不同溶度的葡萄糖溶液滴入预先添加8mL蒽酮试剂的容量瓶中，水做空白对照，沸水中加热7min，立即取出冰浴至室温，用10mm比色皿在620nm波长条件下测定吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。

(2)供试液制备及测定

准确称取1g茶样置于250mL锥形瓶中，添加80mL沸水，并置于沸水浴中浸提30min，立即过滤，沸水洗涤残渣数次并合并滤液，加水至500mL摇匀备用。取4只干燥的25mL容量瓶，每支容量瓶添加8mL蒽酮试剂，其中三只容量瓶分别滴加1mL供试液，其余一只添加1mL蒸馏水，摇匀后沸水浴中加热7min，立即取出冰浴至室温，用10mm比色皿在620nm波长条件下测定吸光度A。

C-在标准曲线上查出的糖含量(ug/mL)

V_总-提取液总体积，mL

m-样品质量，mg

w-试样干物质含量(％)

6、茶褐素含量的测定

准确称取3g磨碎茶样置于250mL锥形瓶中，加沸水125mL并置于沸水浴中浸提10min，搅拌2-3次，结束后趁热减压抽滤，迅速冷却至室温备用。

取供试液25mL和正丁醇25mL置于100mL分液漏斗中，准确震荡3min，静置分层后将下层(水层)放于50mL锥形瓶中，取2mL水层液放于25mL容量瓶中，加2mL饱和草酸溶液和6mL蒸馏水，用95％乙醇定容至刻度。以95％乙醇作对照，于波长380nm处测定光度值A。

M：试样的质量(g)

w：试样的干物质含量(％)

Ab：溶液b的吸光度

为了探明本发明的菌株的作用机理，发明人做了相应的对照实验，其中，CK组为：未接菌种的空白组，组1为只接种枯草芽孢杆菌(CCTCC M 2018288)X4的组，组2为只接种烟曲霉(CCTCC M 2018287)M1的组，组3为本发明的实施例1组，其酶活的测定如表1所示。

表1、人工渥堆发酵晒青毛茶的半成品茶样酶活含量的测定

酶活的数据结果表明，组1和组2单菌发酵时，纤维素酶、果胶酶和多酚氧化酶的酶活均明显低于混菌发酵组，可见枯草芽孢杆菌X4和烟曲霉M1之间在分泌这些酶的方面存在一定的协同增强效应，例如实施例组的多酚氧化酶产量是菌株M1单菌发酵的1.72倍，再比如枯草芽孢杆菌X4经过与菌株M1混菌发酵后，果胶酶的产量增加了0.52倍。例外的情况是混菌发酵反而不利于枯草芽孢杆菌X4产生蛋白酶，因为枯草芽孢杆菌X4与菌株M1共同发酵时茶样中蛋白酶含量均明显低于枯草芽孢杆菌X4的单菌发酵，可见菌株M1可能会抑制枯草芽孢杆菌X4分泌蛋白酶。

为研究前述人工发酵对老青茶茶叶成分转化的影响，测定了不同发酵条件下茶叶中茶多酚、儿茶素、氨基酸、可溶性糖和茶褐素的含量。茶多酚又称为茶鞣质或茶单宁，是一类存在于茶树中的多元酚的混合物，也是茶叶中多种酚类衍生物的总称。茶多酚在茶汤中呈苦涩味，有较强的刺激性；儿茶素是茶多酚类的主体成分，约占茶多酚总量的70％，是形成六大茶类色香味的主体物质之一；渥堆固态发酵过程使茶汤的收敛性和苦涩味明显降低，究其原因主要在于原料晒青毛茶中茶多酚和儿茶素的氧化缩聚成茶褐素。氨基酸是造就茶叶鲜爽口感的主要物质，也是茶叶上微生物生长、繁殖最直接的氮源。茶褐素系指一类能溶于水而不溶于乙醇、乙酸乙酯、正丁醇和氯仿的褐色色素，也是一类十分复杂的非透析性高聚化合物，一定量的茶褐素含量对青砖茶汤色红褐的独特品质的形成有着非常重要的作用。

表2人工渥堆发酵晒青毛茶的半成品茶品质成分含量的测定(单位：％)

其中，其中，CK组为：未接菌种的空白组，组1为只接种枯草芽孢杆菌(CCTCCM2018288)X4的组，组2为只接种烟曲霉(CCTCC M 2018287)M1的组，组3为本发明的实施例1组。

人工渥堆发酵结束后，茶样主要品质成分测定结果如表2所示，与不接种任何菌株的对照组CK相比，除茶褐素含量升高外，茶多酚、儿茶素、氨基酸、可溶性糖含量都不同程度地下降。总的来说，表明第一组枯草芽孢杆菌X4单独作用于老青茶时，各指标变化幅度较小，表明其对茶叶的生物转化影响较小。而高产多酚氧化酶的烟曲霉M1不仅可以明显降低茶样的茶多酚、儿茶素含量，提高茶褐素含量，而且对于茶样的氨基酸和可溶性糖含量的影响明显高于枯草芽孢杆菌X4，这表明烟曲霉M1对老青茶茶叶成分的转化有重要作用。

枯草芽孢杆菌X4和烟曲霉M1混菌发酵时，茶多酚、儿茶素、可溶性糖含量均明显低于单菌发酵；茶样氨基酸含量略高于烟曲霉M1单菌发酵的含量；尤其是茶褐素含量是菌株M1单菌发酵的1.34倍。由此可见，混菌发酵方式比单菌发酵更有利于青砖茶主要生化成分的转化，并且枯草芽孢杆菌X4可以增强菌株M1对老青茶的生物转化作用。与湖北省赵李桥茶厂渥堆茶样进行了对比，结果见表3，人工渥堆6d的茶样各主要品质指标与自然渥堆35天的茶样基本相当。综上可见，枯草芽孢杆菌X4和烟曲霉M1是青砖茶快速渥堆的核心菌群。

与湖北省赵李桥茶厂天然渥堆35d的茶样进行了对比，结果表明用枯草芽孢杆菌X4和烟曲霉M1(编号3)进行人工渥堆6d的茶样各主要品质指标与其最为接近。尤其值得注意的是枯草芽孢杆菌X4和M1共同渥堆发酵得到的茶样中茶褐素含量高于茶厂天然渥堆半成品茶样，而茶褐素是青砖茶中重要的生理活性物质，含量高有利于青砖茶品质的进一步提升。

表3自然渥堆发酵晒青毛茶的半成品茶品质成分含量的测定(单位：％)

本发明采用枯草芽孢杆菌和烟曲霉这两种菌株进行纯种渥堆发酵，与传统开放式的利用环境中的微生物自然渥堆工艺相比，时间可缩短4周左右，且不易受杂菌污染，有利于增加企业效益、提升和稳定产品质量。本发明保藏的两个微生物是青砖茶发酵中的优势微生物，不仅仅提高了发酵速度，而且高度模拟了传统青砖茶的成分和风味，为青砖茶工业化生产提供了有利条件。

发明人同时也用了其他烟曲霉和枯草芽孢杆菌混合，均无法达到快速发酵的效果，普遍发酵的非常慢，无法达到提速的效果。可能是本发明筛选的菌株对晒青毛茶和和水的混合物有很强的适应能力和协同作用，如果单一菌株也不能实现本发明，其他类似菌株更不能实现本发明的快速、稳定、高质量的发酵晒青毛茶。

附图说明：

图1：本发明保藏的枯草芽孢杆菌的菌落特征图。

图2：本发明保藏的烟曲霉的菌落特征图。

具体实施方式

下面结合具体实施例子进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域的技术人员对本发明各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所规定的范围。

采用平板分离法，在45±3℃条件下培养，从湖北省赵李桥茶厂渥堆茶样中分离纯化得到两株核心菌株，分别为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis和烟曲霉Aspergillusfumigatus，所述菌株已于2018年5月17日保藏于在中国典型培养物保藏中心，所述烟曲霉的保藏号为：CCTCC M 2018287，所述枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis的保藏号为：CCTCCM 2018288。保藏地址：湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072，电话：027-68754052。

本发明保藏的枯草芽孢杆菌(CCTCC M 2018288)的菌落特征为：菌落中等大小，表面呈淡黄色，菌落表面粗糙有皱褶，边缘不整齐，表面干燥不透明无光泽，革兰氏反应呈阳性，无荚膜，单个菌体细胞呈杆状，两端钝圆，孢囊无明显膨胀。

所述枯草芽孢杆菌属于细菌界Mycomonera，原生植物门Protophyta，裂殖菌纲Schizomycetes，真细菌目Eubacteriales，芽孢杆菌科Bacillaceae，芽孢杆菌属Bacillus。

本发明保藏的烟曲霉(CCTCC M 2018287)菌落特征为：菌落呈圆形，直径较大，菌落表面呈绒毛状，中心淡青色，边缘灰白色，表面干燥不透明，菌丝有隔，分生孢子球形，分生孢子梗顶端形成膨大的球形顶囊。

所述烟曲霉属于真菌界Mycota，真菌门Eumycophyta，半知菌亚门Deuteromycotina，丝孢菌纲Hyphomycetes，丝孢目Hyphomycetales，丛梗孢科Moniliaceae，曲霉属Aspergillus。

将本发明保藏的所述枯草芽孢杆菌和烟曲霉混合后，得到本发明所述的青砖茶渥堆发酵的菌株组合物。

本发明实施例所用的其他试剂均为分析纯。

以下结合实例对本发明进行详细说明。

实施例1

本实施例提供了一种青砖茶快速渥堆发酵的方法，可以快速发酵出青砖茶，.而且与传统青砖茶的主要品质化学成分相同，时间缩短80％。本发明的渥堆发酵方法如下：

1、制备枯草芽孢杆菌菌液：将本发明保藏的枯草芽孢杆菌(CCTCC M 2018288)置于NA培养基中培养，在45±3℃的条件下培养2～36h后，分散其菌体细胞，然后悬浮处理，至10^6-10⁷个菌体细胞/mL，得到枯草芽孢杆菌菌液。其中，所述NA培养基为：牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L的混合溶液。

2、制备烟曲霉菌液：将本发明保藏的烟曲霉(CCTCC M 2018287)置于PDA培养基中，在45±3℃的条件下培养2～36h后，使其分散成0.2-0.4cm的菌丝段，然后悬浮处理，10^6-10⁷个菌丝段/mL，得到烟曲霉菌液。其中，所述PDA培养基为：马铃薯浸出粉10g/L、葡萄糖20g/L的混合溶液。

3、渥堆混菌发酵液制备：将所述烟曲霉菌液和所述枯草芽孢杆菌菌液按照1:1的比例混合，混合后得到渥堆混菌发酵液。

4、晒青毛茶灭菌处理：将晒青毛茶和和水按5:2(W/V)比例混合后装入渥堆发酵容器中，本实施例为500ml三角瓶，将其放置在105℃的条件下密封灭菌40min。

5、渥堆发酵：将本发明制备的渥堆混菌发酵液以10％(V/W)的接种量接种，在45±3℃的条件下有氧培养6d，其中第2～5d时，加入5～10％(V/W)的无菌水，并翻动晒青毛茶茶样，6d后取出，得到青砖茶半成品。

所述青砖茶半成品经过大传统堆大堆、复制、蒸茶、压制、冷却、烘干后得到青砖茶成品。

实施例2

本实施例提供了一种青砖茶快速渥堆发酵的方法，可以快速发酵出青砖茶，.而且与传统青砖茶的主要品质化学成分相同，时间缩短80％。本发明的渥堆发酵方法如下：

1、制备枯草芽孢杆菌菌液：将本发明保藏的枯草芽孢杆菌(CCTCC M 2018288)置于NA培养基中培养，在45±3℃的条件下培养2～36h后，分散其菌体细胞，然后悬浮处理，至10^6-10⁷个菌体细胞/mL，得到枯草芽孢杆菌菌液。其中，所述NA培养基为：牛肉膏4g/L、蛋白胨15g/L、NaCl 3g/L的混合溶液。

2、制备烟曲霉菌液：将本发明保藏的烟曲霉(CCTCC M 2018287)置于PDA培养基中，在45±3℃的条件下培养2～36h后，使其分散成0.2-0.4cm的菌丝段，然后悬浮处理，至10^6-10⁷个菌丝段/mL，得到烟曲霉菌液。其中，所述PDA培养基为：马铃薯浸出粉15g/L、葡萄糖25g/L的混合溶液。

3、渥堆混菌发酵液制备：将所述烟曲霉菌液和所述枯草芽孢杆菌菌液按照1:0.5的比例混合，混合后得到渥堆混菌发酵液。

4、晒青毛茶灭菌处理：将晒青毛茶和和水按4:1(W/V)比例混合后装入渥堆发酵容器中，本实施例为500ml三角瓶，将其放置在100℃的条件下密封灭菌40min。

5、渥堆发酵：将本发明制备的渥堆混菌发酵液以5％(V/W)的接种量接种，在45±3℃的条件下有氧培养5d，其中第2～4d时，加入5～10％(V/W)的无菌水，并翻动晒青毛茶茶样，6d后取出，得到青砖茶半成品。

所述青砖茶半成品经过大传统堆大堆、复制、蒸茶、压制、冷却、烘干后得到青砖茶成品。

实施例3

本实施例提供了一种青砖茶快速渥堆发酵的方法，可以快速发酵出青砖茶，.而且与传统青砖茶的主要品质化学成分相同，时间缩短80％。本发明的渥堆发酵方法如下：

1、制备枯草芽孢杆菌菌液：将本发明保藏的枯草芽孢杆菌(CCTCC M 2018288)置于NA培养基中培养，在45±3℃的条件下培养2～36h后，分散其菌体细胞，然后悬浮处理，至10^6-10⁷个菌体细胞/mL，得到枯草芽孢杆菌菌液。其中，所述NA培养基为：牛肉膏5g/L、蛋白胨12g/L、NaCl 9g/L的混合溶液。

2、制备烟曲霉菌液：将本发明保藏的烟曲霉(CCTCC M 2018287)置于PDA培养基中，在45±3℃的条件下培养2～36h后，使其分散成0.2-0.4cm的菌丝段，然后悬浮处理，至10^6-10⁷个菌丝段/mL，得到烟曲霉菌液。其中，所述PDA培养基为：马铃薯浸出粉4g/L、葡萄糖15g/L的混合溶液。

3、渥堆混菌发酵液制备：将所述烟曲霉菌液和所述枯草芽孢杆菌菌液按照1:3的比例混合，混合后得到渥堆混菌发酵液。

4、晒青毛茶灭菌处理：将晒青毛茶和和水按2:1(W/V)比例混合后装入渥堆发酵容器中，本实施例为500ml三角瓶，将其放置在121℃的条件下密封灭菌20min。

5、渥堆发酵：将本发明制备的渥堆混菌发酵液以20％(V/W)的接种量接种，在45±3℃的条件下有氧培养7d，其中第2～6d时，加入5～10％(V/W)的无菌水，并翻动晒青毛茶茶样，6d后取出，得到青砖茶半成品。

所述青砖茶半成品经过大传统堆大堆、复制、蒸茶、压制、冷却、烘干后得到青砖茶成品。

Claims (8)

1.一种青砖茶渥堆发酵的菌株组合物，其特征在于：所述青砖茶渥堆发酵的菌株组合物由枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和烟曲霉（Aspergillus fumigatus）组成，其中，所述枯草芽孢杆菌保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2018288；所述烟曲霉保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2018287。

2.根据权利要求1所述的青砖茶渥堆发酵的菌株组合物，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌和烟曲霉的混合比例为： 2:1~1:3。

3.一种青砖茶渥堆混菌发酵液，其特征在于：所述青砖茶渥堆混菌发酵液为枯草芽孢杆菌菌液和烟曲霉菌液的混合液，其中，所述枯草芽孢杆菌保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2018288；所述烟曲霉保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2018287。

4.根据权利要求3所述的青砖茶渥堆混菌发酵液，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌菌液中，枯草芽孢杆菌菌体细胞的数量为10⁶~10⁷个/mL。

5.根据权利要求3所述的青砖茶渥堆混菌发酵液，其特征在于：所述烟曲霉菌液中，烟曲霉菌丝段为10⁶~10⁷个/mL。

6.根据权利要求3所述的青砖茶渥堆混菌发酵液，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌菌液和烟曲霉菌液的混合比例为： 2:1~1:3。

7.一种权利要求1所述的青砖茶渥堆发酵菌株组合物的应用，其特征在于：所述青砖茶渥堆发酵的菌株组合物用于加快青砖茶的渥堆反应速度；其中，所述枯草芽孢杆菌保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2018288；所述烟曲霉保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2018287。

8.一种权利要求3所述的青砖茶渥堆混菌发酵液的应用，其特征在于：所述青砖茶渥堆混菌发酵液用于加快青砖茶的渥堆反应速度；所述枯草芽孢杆菌保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2018288；所述烟曲霉保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2018287。

Images