CN114763517B - 一株耐高温酿酒酵母及其在发酵食品中的高温发酵工艺开发 - Google Patents

一株耐高温酿酒酵母及其在发酵食品中的高温发酵工艺开发 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株耐高温酿酒酵母及其在发酵食品中的高温发酵工艺开发，属于发酵工程与生物技术领域。本发明的菌株发酵温度范围广、抗逆性优良、发酵性能好，能够满足不同酒精饮料和发酵食品的风味优良的工业生产安全菌株酿酒酵母jiangnan4#，菌株抗逆性优良，乙醇耐受性高达20％vol，1.6mol/L氯化钠渗透压条件下仍然有较好的生长状况，温度耐受性在15‑45℃范围仍有较好的生长状况，本发明中的酿酒酵母为耐高温菌株，基于该菌株开发了一种高温黄酒酿造工艺，能够满足黄酒夏季生产需求，能够满足高品质、安全性优质黄酒工业全年生产需要，所得到的黄酒有不同的风格，有很好的应用前景，同时该菌株能满足其他发酵食品的高温条件下的应用。

Description

一株耐高温酿酒酵母及其在发酵食品中的高温发酵工艺开发
技术领域
本发明涉及一株耐高温酿酒酵母及其在发酵食品中的高温发酵工艺开发，属于发酵工程与生物技术领域。
背景技术
酿酒酵母是酒精饮料和一些传统发酵食品的主要风味生成微生物，酵母利用原料中的糖生成酒精，蛋白质和脂肪经酵母和乳酸菌等微生物作用后转变为有机酸、氨基酸及酯类等。酵母性能优劣直接影响最终的生产效率与产品风味品质。同时，酿酒酵母在发酵过程中也会产生一些非喜好的代谢物质(尿素、生物胺和氨基甲酸乙酯)，这些物质含量超过限量值会对风味和品质造成消极影响，影响饮用舒适性和安全性。
温度是发酵过程中的一个关键控制因素，影响发酵过程中微生物的代谢，对最终产品的品质稳定和多样性起到重要作用。一般情况下，发酵温度降低，发酵周期延长，高级醇和脂肪酸的含量相对较低，酯类化合物含量相对较高。酿酒酵母低温适应性较强，目前低温发酵相关应用较多。发酵温度提高，发酵周期缩短，但代谢副产物量增加将影响产品风味且容易染菌，造成酸败和发酵滞留，酿酒酵母一般在高温(35℃)时生长就受到严重抑制，酿酒酵母在发酵食品中的高温发酵工艺的报道较少。黄酒发酵受环境温度和落料温度影响，夏季生产或落料温度过高时有时主发酵温度能达到35℃，由于工业生产菌株没有较好的高温耐受性，出现这种情况时会影响发酵，甚至会导致发酵失败。另外，冬季生产或者落料温度过低时会导致主发酵温度低(20℃)，影响发酵启动，也存在发酵失败的风险，因此适合低温和高温发酵的菌株对黄酒生产具有重要作用。
关于高温酿酒酵母在工业生产中的应用的相关研究和可检索到的应用于食品相关领域的酿酒酵母的研究及专利中，目前关于高温酿酒酵母的相关专利大多通过基因改造用来生产工业乙醇(参见公开号分别为CN111334442A，CN113717874A，CN107858298A，CN108368475A的中国发明专利申请文本中)，有研究通过基因组改造获得了酿酒酵母菌株35℃下乙醇产量可达到12.50％vol。白酒生产中，公开号为CN102634464B的中国发明专利中，建立了一种耐高温酿酒酵母及其分离培养方法，所获得菌株耐高温、产酯性能好，记载于公开号为CN109486691B的中国发明专利中，强抗逆性酿酒酵母及其用途用于维持高酸正常发酵。在葡萄酒生产中，公开号为CN103215196B和CN103215195B的中国发明专利报道的酿酒酵母抗逆性强，耐高糖，耐高温，耐高酒精，耐渗性好，产酒精度高，可广泛应用于中国产区各个特色红葡萄品种的优质葡萄酒的酿制，也可用于蓝莓酒、枣酒等各种特色高端果露酒及普通果酒的酿制。
尽管耐高温酿酒酵母在白酒和葡萄酒发酵中实现应用，但目前尚没有有效的方法能从根本上系统解决以上非喜好代谢物含量高和黄酒生产受季节影响的问题，尚未有在满足正常发酵的前提下，同时兼具耐高温、高酒精度、低杂醇、高酯，生物胺、尿素和氨基甲酸乙酯含量显著低与规定限量的安全性工业生产酿酒酵母野生菌株及其应用。
发明内容
针对目前发酵食品生产中尚未有耐高温，产风味较好，发酵性能优良，同时安全性高的酿酒酵母，本发明提供一株抗逆性优良、发酵性能好的耐高温的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)及其在发酵食品中的高温发酵工艺。
本发明提供了一株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)jiangnan4#，已保藏于2021年12月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:M 20211650，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
在本发明的一种实施方式中，所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)jiangnan4#采集来自绍兴地区的手工黄酒和淋饭酒母发酵液；
所述酿酒酵母的单克隆菌落形态特征为乳白色，呈卵圆形或椭圆形，中间凸起，表面光滑、湿润有光泽，菌株边缘整齐。所述菌株的形态特征符合酿酒酵母，通过ITS测序，在NCBI数据库比对分析菌株与酿酒酵母的相似度同源性大于99％，可以鉴定为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)jiangnan4#。
本发明提供了一种耐高温酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)jiangnan4#的选育策略及黄酒高温酿造方法，包括以下步骤：
(1)采用浓度梯度稀释的方法将不同发酵时间的手工黄酒发酵醪液用纱布过滤后进行梯度稀释(10-1～10-5)，分别取100μL稀释液于固体培养基平板后进行涂布使菌液均匀，然后取培养后获得的形态特征符合酿酒酵母的单克隆菌落进行划线分离进行多次纯化，直至固体培养基平板上出现单一的酵母单克隆菌落，得到不同纯种酿酒酵母分离株；
(2)将步骤(1)中的纯种酿酒酵母分离株进行小体系黄酒模拟发酵，根据发酵结束后的发酵液酒精度等理化指标、杂醇和风味数据进行初步筛选，得到初步筛选优良菌株；
(3)将步骤(2)中的初步筛选菌株进行3个平行重复小体系黄酒模拟发酵，通过发酵结束后的发酵液酒精度等理化指标、杂醇和风味数据进行复筛，得到低产杂醇、高产酯等优良性状的复筛菌株；
(4)将步骤(3)中的复筛菌株通过小体系黄酒模拟高温发酵(35℃)筛选耐高温菌株，通过发酵结束后的发酵液酒精度、总酸、氨氮和还原糖等理化指标、杂醇、生物胺、氨基甲酸乙酯、有机酸。氨基酸和风味等数据进行评价，得到jiangnan4#菌株。
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中，黄酒模拟高温工艺为主发酵温度，35℃1-3天，后酵为15℃发酵15-20天。
本发明提供了一种微生物菌剂，所述微生物菌剂中含有上述酿酒酵母jiangnan4#，或含有经冷冻干燥得到的酿酒酵母jiangnan4#干菌体，或含有经固体化技术得到的酿酒酵母jiangnan4#细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物制剂中的酵母细胞数量≥1×107CFU/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述的微生物菌剂含有所述酿酒酵母jiangnan4#菌体的活细胞、冷冻干燥得到的所述酿酒酵母jiangnan4#干菌体、固体化技术得到的所述酿酒酵母jiangnan4#细胞、所述酿酒酵母jiangnan4#的液体菌剂、所述酿酒酵母jiangnan4#的固体菌剂，或者以其他任何形式存在的所述酿酒酵母jiangnan4#菌株。
在本发明的一种实施方式中，所述的微生物菌剂为固态菌剂或液态菌剂应用方式。
本发明还提供了一种含有上述酿酒酵母jiangnan4#，或含有上述微生物菌剂，或与其他微生物复配等制备的产品。
在本发明的一种实施方式中，所述产品包括但不限于酒药、麦曲。
在本发明的一种实施方式中，所述产品包括但不限于强化酒药、强化酒曲、强化发酵剂。
本发明还提供了一种上述酿酒酵母jiangnan4#，或上述微生物菌剂，或上述产品在制备发酵制品中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述的与其他微生物复配应用方式是指所述酿酒酵母，所述包含酿酒酵母的微生物制剂与其他微生物包含酿酒酵母、非酿酒酵母，不存在食品安全性的细菌等进行配比使用，或者以其他任何形式与其他微生物进行配比使用。
在本发明的一种实施方式中，所述的强化酒药为酒药的制作过程中以所述微生物菌剂，所述与其他微生物复配或其他任何形式添加在酒药中达到酒药使用时能够强化酒药的发酵特性的目的。
在本发明的一种实施方式中，所述的强化酒曲为酒曲制作过程中以所述微生物菌剂，所述与其他微生物复配，所述强化酒药或其他任何形式添加在酒曲中达到酒曲使用时能够强化酒曲的发酵特性的目的。
在本发明的一种实施方式中，所述的强化发酵剂为发酵食品在使用发酵剂以任何方式添加该酿酒酵母菌株使用。
本发明还提供所述酿酒酵母jiangnan4#在发酵食品中的高温应用工艺。
在本发明的一种实施方式中，所述的发酵食品中的高温应用工艺包含以上述酿酒酵母的所有应用方式在发酵食品中的应用。
本发明还提供了上述酿酒酵母jiangnan4#，或上述微生物菌剂，或上述产品在制备发酵制品中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵制品为发酵食品或发酵饮品；所述发酵饮品包括但不限于发酵酒精饮料、发酵醋。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵酒精饮料包括但不限于黄酒、料酒、米酒、甜米酿、葡萄酒、果酒、酱油、发酵烟、啤酒、白酒；所述发酵醋包括果醋、食醋。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是用于黄酒高温酿造，使用所述酿酒酵母为酒母。
在本发明的一种实施方式中，所述黄酒高温酿造是将所述酿酒酵母作为酒母，按照质量分数为5％～15％的添加量添加到蒸煮或糊化的大米、黍米等酿酒原料中，经发酵、压榨过滤、煎酒、陈酿、灭菌灌装得到的黄酒。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是用于料酒酿造。
在本发明的一种实施方式中，所述料酒酿造是先利用所述酿酒酵母作为酒母先高温发酵得到黄酒，再利用黄酒制备料酒。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是用于米酒酿造，使用所述酿酒酵母为发酵剂。
在本发明的一种实施方式中，所述米酒酿造是将所述酿酒酵母与酒曲作为发酵剂进行酿造，按照质量分数为0.5％～1.5％的添加量添加到蒸煮的大米等酿酒原料中，经蒸煮、加曲(添加所述耐高温酿酒酵母)、糖化、发酵、压榨等工艺得到。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是用于甜米酿酿造，使用所述酿酒酵母为发酵剂。
在本发明的一种实施方式中，所述甜米酿酿造是将所述酿酒酵母与酒曲作为发酵剂进行酿造，按照质量分数为0.5％～1.5％的添加量添加到蒸煮的大米原料中，经蒸煮、加曲(添加所述酿酒酵母)、糖化、发酵等工艺得到。
在本发明的一种实施方式中，所述的应用是用于食醋酿造。
在本发明的一种实施方式中，所述食醋酿造，是先利用所述酿酒酵母为酒母先发酵得到黄酒，再利用黄酒作为醋酸发酵原料来酿造食醋。
在本发明的一种实施方式中，所述的应用是用于酱油酿造。
在本发明的一种实施方式中，所述食醋酿造，是先利用所述酿酒酵母配合米曲霉使用，加入豆粕等原料按照5％～10％(v/v)的接种量先发酵得到酒母，再利用酒母加入酱醪发酵来酿造酱油。
在一种实施方式中，所述的应用是用于制作卷烟。
在一种实施方式中，所述的应用是用于制作卷烟，是将所述耐高温酿酒酵母jiangnan4#或其组合物直接制备烟草香料；或将梨、葡萄、桂花和烟草提取物等为培养基原料，接种所述耐高温酿酒酵母jiangnan4#或其组合物进行发酵，制备发酵型烟草香料，然后将所得烟草香料按照卷烟叶质量的1％～5％的添加量直接添加到卷烟叶组中。
在本发明的一种实施方式中，所述的应用是用于酿造白酒。
在本发明的一种实施方式中，所述酿造白酒，是在白酒发酵入池发酵时额外添加所述酿酒酵母。
在本发明的一种实施方式中，所述酿造白酒时酿酒酵母额外添加量为1～3％(v/v)。
本发明还提供了所述酿酒酵母发酵产品经蒸馏或调配后等方式得到的产品。
本发明还提供了一种高温发酵黄酒的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)浸米；
(2)蒸饭；
(3)将上述酿酒酵母jiangnan4#菌株接种在培养基中，培养得到种子液；
(4)将步骤(2)得到的蒸熟的米饭与水混合后，得到米水混合发酵体系，向米水混合发酵体系中添加步骤(3)得到的种子液、麦曲后依次进行前发酵、后发酵后过滤，得到清酒，将得到的清酒调色煎酒后得到黄酒。
在本发明的一种实施方式中，所述前发酵的发酵条件为：在35℃条件下发酵2天。
有益效果
(1)本发明提供了一种的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)jiangnan4#，该酿酒酵母具有较好范围的乙醇和温度耐受性，20％v/v乙醇浓度下仍可以生长，在15～45℃范围内菌株仍有较好的生长状况，能够满足机械化黄酒全年生产需求。
(2)采用本发明提供的耐高温酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)jiangnan4#进行黄酒酿造时，与黄酒行业普遍使用的85#酵母菌和已申请专利菌株jiangnan1#、2#和3#相比，jiangnan4#菌株在20℃、30℃和35℃都可以正常发酵，发酵性能较好，前酵结束后酒精度可达11％vol以上，高温发酵结束后得到的黄酒中酒精度为15％vol以上，35℃作为主发酵温度最短可以缩短前酵时间至2天，同时3种不同主发酵温度条件下得到的黄酒具有不同的风格特征。
(3)采用本发明提供的耐高温酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)jiangnan4#进行不同黄酒酿造时，非喜好物质受温度影响，氨基甲酸乙酯(EC)和生物胺含量显著低于工厂目前常用菌株85#，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)jiangnan4#高温(35℃)发酵时代谢生成生物胺和氨基甲酸乙酯量较少，表明该菌株非喜好次级代谢产物产量远低于其他菌株，在其他发酵食品中也具有较好的高温发酵利用价值。
生物材料保藏
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)jiangnan4#，分类命名为Saccharomycescerevisiae jiangnan4#，已于2021年12月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:M20211650，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
附图说明
图1：本发明的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)jiangnan4#温度耐受性生长变化曲线。
图2：本发明的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)jiangnan4#不同温度黄酒发酵过程酒精度含量。
具体实施方式
以下结合附图来说明本发明的具体实施方式。实施实例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所涉及的酿酒酵母jiangnan1#、酿酒酵母jiangnan2#、酿酒酵母jiangnan3#分别记载于公开号为CN113621528A、CN113604372A和CN113684140A的中国发明专利申请文本中，下述实施例中所涉及的酿酒酵母85#记载于公开号为CN 105385613 B的中国发明专利中。
下述实施例中所涉及的麦曲为黄酒厂工业生产使用的机械块曲，由工厂提供，主要作用是作为发酵剂提供酶活和酿造微生物。
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
黄酒理化指标的检测：酒精度、氨基酸态氮和总酸的测定参照《GB/T 13662-2018黄酒》进行测定。有机酸和氨基酸含量采用高效液相色谱(HPLC)，氨基甲酸乙酯和高级醇、酯类等挥发性风味物质采用气相色谱-质谱联用(GC-MS)进行检测。还原糖含量测定采用DNS方法。尿素和菌液浓度采用分光光度法测定。
下述实施例中所涉及的培养基如下：
YPD固体培养基：10g酵母浸粉，20g蛋白胨，20g葡萄糖，加水至1000mL，2％琼脂，121℃高压灭菌20min，冷却后备用。
大米糖化液培养基：取适量优质大米原料，60℃水浴恒温浸米20～30min，常压条件下蒸煮20min得到米饭，然后分别加入1‰的糖化酶和2‰的液化酶，加入10％生麦曲，在55～65℃条件下糖化4～5h，至糖度13°Brix以上，过滤后分装121℃高压灭菌15分钟，冷却后备用。
实施例1：酿酒酵母菌株的筛选与鉴定
(1)样品制备及菌株分离
分别将采集来自绍兴地区的手工黄酒和淋饭酒母发酵液，4℃条件下储存，取混匀后的样品1mL，用无菌水进行梯度稀释(10-1～10-5)，取稀释后10-3～10-5的样品100μL，在YPD平板上进行平板涂布(3个平行)，28℃倒置静置培养48h，挑选菌落形态、颜色、外观符合酵母生理形态的菌株，进行多次划线对菌株纯化，最终对得到的纯种菌株进行鉴定、编号、保藏。
(2)菌株鉴定
菌株的形态特征符合酿酒酵母，通过ITS测序，在NCBI数据库比对分析菌株与酿酒酵母的相似度同源性大于99％，可以鉴定为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，命名为酿酒酵母jiangnan4#。
将得到的酿酒酵母于2021年12月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:M 20211650，保藏地址为：中国武汉，武汉大学。酿酒酵母jiangnan4#的ITS序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例2：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)jiangnan4#的温度耐受性
具体步骤如下：
(1)分别从甘油管中进行平板三区划线得到单克隆菌落：酿酒酵母85#、酿酒酵母jiangnan1#、酿酒酵母jiangnan2#、酿酒酵母jiangnan3#、酿酒酵母jiangnan4#；
(2)分别挑取各个酿酒酵母1个菌落，分别在YPD液体中28℃震荡培养24h，分别得到种子液；
(3)分别将得到的种子液以1‰(v/v)的比例转接至新的YPD液体中，分别于15～40℃不同梯度温度下培养48h，用分光光度计测定不同温度培养条件下不同酿酒酵母的OD600值，结果如表1及图1所示。
表1不同菌株不同温度生长情况(OD600)
结果显示，5株菌在15-40℃都能够生长，jiangnan4#在35℃条件下菌液浓度低于其他菌株，表明其代谢增殖速率低于其他菌株，这可能是该菌株能够更好的适应高温发酵的原因之一。
实施例3：黄酒发酵工艺
具体步骤如下：
(1)原料的称取
黄酒发酵的原料配比(2L体系)为：粳糯米500g；饮用水625mL；酒母50-75mL；生、熟麦曲60-75g。(2)蒸饭
生产用量的生米加水至超出液面10cm以上进行浸米，3～5天，浸米的米浆水总酸(以乳酸计)达到4.5g/L以上，将水沥干得到湿米，将湿米在蒸饭柜，121℃，蒸饭20～30min，至米饭熟而不透，饭粒内无白心，米饭有酸味带有饭香，出饭率在140％-160％。
(3)酿酒酵母种子液的制备
将斜面培养的酿酒酵母菌株接种在大米糖化液培养基中，在培养温度为30℃的条件下振荡培养24h，得到一级种子液；
以5％-10％(v/v)的接种比例将一级种子液接种至新的大米糖化液培养基，在培养温度为30℃的条件下振荡培养36-48h，得到二级种子液；
将得到的二级种子液测定酵母活菌数和出芽率，满足酵母数大于107，出芽率大于30％，作为酵母发酵剂进行黄酒酿造。
制备得到酿酒酵母种子液。
(4)落料
向灭菌的发酵容器中投入步骤(2)得到的米饭，水，得到米水混合发酵体系；向上述米水混合发酵体系中接入原料米为基准的10～15％比例体积的步骤(3)得到的酿酒酵母种子液、12～15％比例质量的麦曲，25～28℃条件下完成物料混合，进行前发酵；
后发酵：前发酵结束后，将发酵罐温度降低至10～15℃，进行后发酵，发酵时间为15～20天；
后发酵结束后，将发酵醪液进行板仓压榨、硅藻土过滤，得到的滤液经过澄清得到清酒、清酒调配加焦糖色煎酒后为黄酒。
实施例4：酿酒酵母jiangnan4#在黄酒发酵中的应用性
具体实施方式同实施例3，区别在于，调整步骤(4)的前发酵为：
35℃条件下发酵3天(高温筛选)；
35℃条件下发酵2天；30℃条件下发酵2天；20℃条件下发酵1天(高温梯度降温筛选，温度作为单一变量，保证主发酵时间相同)；
30℃条件下发酵5天(中温筛选)；
20℃条件下发酵5天(低温筛选)；
按照实例3黄酒发酵的方式分别对酿酒酵母85#，酿酒酵母jiangnan1#～4#菌株进行不同温度黄酒发酵比较，验证酿酒酵母高温发酵的可行性。发酵后酒精度作为初步评价确定高温菌株以及高温发酵工艺。结果如表2。
表2不同菌株不同温度黄酒发酵比较
注：“+”：代表菌株在该主发酵温度，后酵15℃15天的条件下的模拟黄酒发酵酒精度<14％vol；“++”：代表酒精度14-15％vol；“+++”：代表>15％vol。
结果显示，酿酒酵母菌株在黄酒酿造中普遍无法在高温(35℃)条件下进行，酿酒酵母jiangnan4#与对照菌株酿酒酵母85#以及已申请菌株酿酒酵母jiangnan1#～3#相比，酿酒酵母jiangnan4#能够在特定的高温发酵工艺下即：35℃条件下发酵2天；30℃条件下发酵2天；20℃条件下发酵1天(高温筛选)，满足黄酒发酵生产需求，具有黄酒工业生产应用的可能性。
实施例5：酿酒酵母jiangnan4#在黄酒的制备中的应用
具体步骤如下：
(1)具体实施方式同实施例3，区别在于，调整前发酵的条件分别为：
35℃条件下发酵2天；30℃条件下发酵2天；20℃条件下发酵1天(高温发酵)；
30℃条件下发酵3～5天(中温发酵)；
20℃条件下发酵5～7天(低温发酵)；
按照实施例3的方法，分别制备得到高温发酵黄酒、中温发酵黄酒、低温发酵黄酒。
(5)具体实施方式同上述步骤(1)～(4)，区别在于，调整酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)jiangnan4#为酿酒酵母85#，按照上述方法，分别制备得到高温发酵黄酒、中温发酵黄酒、低温发酵黄酒。
按照上述黄酒生产工艺对菌株进行高温发酵；中温发酵；低温发酵3种不同主发酵温度进行黄酒发酵应用，发酵结束后评价指标如表3～5、图2所示。
表3：酿酒酵母jiangnan4#与85#在不同温度下发酵后黄酒的理化指标
表4：酿酒酵母jiangnan4#和85#不同温度发酵后黄酒的杂醇和乙酸酯含量
表5：酿酒酵母jiangnan4#和85#不同温度发酵后黄酒的氨基甲酸乙酯和生物胺含量
结果显示，酿酒酵母jiangnan4#高温下发酵性能优于85#，前酵结束后黄酒的理化指标正常，发酵结束后符合黄酒国标要求，高温发酵工艺显著提升黄酒的乙酸酯和高级醇等挥发性风味物质，所生产黄酒香气浓郁，具有较强的果香，非偏好物质氨基甲酸乙酯和生物胺显著低于对照，提高了黄酒的饮用安全性。另外，有机酸和氨基酸含量差异不大，满足黄酒国标要求。同时，酿酒酵母jiangnan4#在20℃～35℃的范围内均能保持优良的发酵性能。
实施例6：耐高温酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株jiangnan4#在料酒中的应用
按照实施例5中的高温发酵工艺方式得到的黄酒，取部分黄酒酒样加入食盐10％，灭菌处理后得到耐高温酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株jiangnan4#所酿不同料酒，酒精度为15％(v/v)，杂醇总量为561.5mg/L，乙酸酯类总量为200mg/L以上，氨基甲酸乙酯含量与对照菌株相比显著降低。
实施例7：耐高温酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株jiangnan4#在米酒中的应用
以大米为主要原料按比例称取后，用清水淘洗，在常温下浸泡4h左右至充分吸水，要求浸后手捏易碎，无硬米芯为止；将浸泡后的米粒水分沥干，常压下蒸煮30min左右至米饭内无白心；米饭蒸熟后用冷开水淋冷至25-28℃左右，转按比例添加0.4％-0.8％甜酒曲搭窝进行糖化，糖化结束后补加米饭，接种5％-10％接种所述酿酒酵母扩培液，搅拌均匀，加入原米质量1-1.5倍的饮用水，在35℃条件下的发酵2天，降低温度至10-15℃范围发酵15-20天，发酵结束后，压榨、过滤得到米酒，香气浓郁，果香。花香味较浓。添加所述耐高温酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株jiangnan4#能够满足米酒酿造需求，而且米酒汇中氨基甲酸乙酯和生物胺含量低，饮用安全性高。
实施例8：耐高温酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株jiangnan4#在甜米酿的应用
以大米为主要原料按比例称取后，用清水淘洗，在常温下浸泡4h左右至充分吸水，要求浸后手捏易碎，无硬米芯为止；将浸泡后的米粒水分沥干，常压下蒸煮30min左右至米饭内无白心；米饭蒸熟后用冷开水淋饭至25-28℃左右，转移至发酵罐内，按比例添加0.4％-0.8％甜酒曲，0.5％-1.5％接种所述酿酒酵母扩培液，搅拌均匀，并在饭中央挖出凹槽，以保证一定的溶氧量；在糊化、淋冷好的米中加入原米质量1-1.5倍的饮用水，在35℃条件下的恒温发酵36-72h。所得甜米酿酒精度3-5％(v/v)，香气协调、浓郁、质地均匀，口感酸甜适口。
实施例9：耐高温酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株jiangnan4#在食醋的应用
以实例3中得到的黄酒为原料，利用醋酸进行醋酸发酵。食醋酿造采用固态发酵工艺：将黄酒、麸皮和大糠按照10:4:1的比例混匀，接种总体系3-8％醋醅后对物料进行翻醅，保持发酵温度为35-40℃，时间为1-2天。前1-8天自上而下翻醅，8-12天，从底部自下而上翻醅进行降温。发酵结束后淋醋获得生醋，灭菌后罐坛露天陈酿，不同年份的醋灌装前需高温灭菌后进行热管装。发酵结束后所得食醋中理化指标正常，氨基甲酸乙酯含量显著降低。
实施例10：耐高温酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株jiangnan4#在白酒的应用
以高粱为原料，采用2轮发酵法进行白酒固态酿造，蒸熟高粱后冷却至30℃左右，添加2-5％米曲霉、稻壳8-12％、曲10-15％、麸皮6-10％，接种扩培的1％比例的低产杂醇高产酯酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株jiangnan4#进行第一轮密闭发酵30天后蒸馏。二次发酵添加中温大曲10-15％，继续添加扩培的1％的株jiangnan4#菌液，继续发酵15天后蒸馏，2轮所得蒸馏白酒混合后得到酒精度60％(v/v)的白酒，白酒乙酸酯含量增加，主要为乙酸乙酯、乙酸异戊酯和乙酸苯乙酯，总量提高85％以上，同时，杂醇含量降低40％以上，氨基甲酸乙酯含量显著降低。
实施例11：耐高温酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株jiangnan4#在酱油的应用
本实例为耐高温酿酒酵母在酿造酱油低盐固态发酵中的应用，将发酵原料豆粕和小麦按照1:1的比例混匀后蒸熟，接种10％-15％的米曲霉，添加200％的食用水，添加食用盐至盐浓度为5％-10％，将原料混合好。耐高温酿酒酵母用食用级别的培养基(麦芽汁或者实例2中方式制备的大米糖化液)进行摇瓶培养24-48h，按照5％-10％的接种比例接种至冷却后的蒸熟的豆粕和小麦混合原料中，加200％的水，30℃振荡培养24-36h得到酒母，然后将酒母加入上述酱醪发酵体系进行固态发酵，发酵温度未35-40℃，发酵时间为15-20天。发酵结束后压榨、过滤澄清后85℃灭菌30min后灌装，所得酱油2-苯乙醇含量35mg/L，乙酸乙酯含量为较高，酱油品质提升，且氨基甲酸乙酯等危害物含量较低。
实施例12：耐高温酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株jiangnan4#在发酵烟的应用
本实施例所指的烟叶为加工处理好的烟丝样品，烟草提取物为水提物或醇提物，市售购买获得。
将所述耐高温酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株jiangnan4#或其组合物分别在培养温度为28℃±2℃的条件下，YPD培养基中振荡培养24h，得到浓度为106CFU/mL-108CFU/mL一级种子液，再分别或以1:1:1的数量比混合，再以5％-10％的比例接种至含梨汁、葡萄汁、桂花或烟草提取物的种子培养基中发酵培养基中，35℃培养48h后得到的酿酒酵母培养液，浓度为108CFU/mL-109CFU/mL，即为烟用添加香料，然后将所得烟用添加香料按照卷烟叶组质量的1％～5％的添加量直接添加到卷烟叶组中，补水至10％-20％，之后25℃-37℃培养4h-8h，最后进行烘烤后平衡水分，然后制作卷烟，或者将烟用添加香料溶于酒精75％制备香液(0.1g/mL-0.5g/mL)，按照适当比例均匀的喷洒在已经处理好的烟丝样品中后制作卷烟。所得卷烟烟气柔和、刺激性低，具有淡淡的果香、花香，宜人的甜醇香气和提取物特殊香气，可提高卷烟的抽吸品质，适合卷烟和新型烟草制品特殊香气提升和品质改善。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
江南大学（绍兴）产业技术研究院
<120> 一株耐高温酿酒酵母及其在发酵食品中的高温发酵工艺开发
<130> BAA220462A
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 814
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttgcctttga ttttatattt tgaatggatt tttttgtttt ggcaagagca tgagagcttt 60
tactgggcaa gaagacaaga gatggagagt ccagccgggc ctgcgcttaa gtgcgcggtc 120
ttgctaggct tgtaagtttc tttcttgcta ttccaaacgg tgagagattt ctgtgctttt 180
gttataggac aattaaaacc gtttcaatac aacacactgt ggagttttca tatctttgca 240
actttttctt tgggcattcg agcaatcggg gcccagaggt aacaaacaca aacaatttta 300
tttattcatt aaatttttgt caaaaacaag aattttcgta actggaaatt ttaaaatatt 360
aaaaactttc aacaacggat ctcttggttc tcgcatcgat gaagaacgca gcgaaatgcg 420
atacgtaatg tgaattgcag aattccgtga atcatcgaat ctttgaacgc acattgcgcc 480
ccttggtatt ccagggggca tgcctgtttg agcgtcattt ccttctcaaa cattctgttt 540
ggtagtgagt gatactcttt ggagttaact tgaaattgct ggccttttca ttggatgttt 600
tttttccaaa gagaggtttc tctgcgtgct tgaggtataa tgcaagtacg gtcgttttag 660
gttttaccaa ctgcggctaa tcttttttat actgagcgta ttggaacgtt atcgataaga 720
agagagcgtc taggcgaaca atgttcttaa agtttgacct caaatcaggt aggagtaccc 780
gctgaactta agcatatcaa taagccggag gaaa 814

Claims (9)

1.一株耐高温酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）jiangnan4#，已于2021年12月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:M 20211650。
2.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中含有权利要求1所述的酿酒酵母jiangnan4#，或含有经冷冻干燥得到的所述酿酒酵母jiangnan4#的干菌体，或含有经固体化技术得到的所述酿酒酵母jiangnan4#的细胞。
3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中的酵母细胞数量≥1×106 CFU/mL。
4.含有权利要求1所述的酿酒酵母jiangnan4#或权利要求2或3所述的微生物菌剂的产品。
5.如权利要求4所述的产品，其特征在于，所述产品为酒药、麦曲。
6.权利要求1所述的酿酒酵母jiangnan4#，或权利要求2或3所述的微生物菌剂，或权利要求4或5所述的产品在制备发酵制品中的应用，其特征在于，所述发酵制品为发酵酒精饮料、发酵醋。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述发酵酒精饮料为：果酒，所述发酵醋为果醋。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述发酵酒精饮料为：黄酒、料酒、米酒、甜米酿、葡萄酒、啤酒、白酒；所述发酵醋为食醋。
9.一种黄酒的高温发酵工艺制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）浸米；
（2）蒸饭；
（3）将权利要求1所述的酿酒酵母jiangnan4#菌株接种在培养基中，培养得到种子液；
（4）将步骤（2）得到的蒸熟的米饭与水混合后，得到米水混合发酵体系，向米水混合发酵体系中添加步骤（3）得到的种子液、麦曲后依次进行前发酵、后发酵后过滤，得到清酒，将得到的清酒调色煎酒后得到黄酒；所述前发酵的发酵条件为：在35℃条件下发酵2天；30℃条件下发酵2天；20℃条件下发酵1天。
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