CN104480029A - 一种低产硫化氢和氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母及其筛选方法和应用 - Google Patents

一种低产硫化氢和氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母及其筛选方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明具体涉及一种低产硫化氢和氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母及其筛选方法和应用。所述菌株分类命名为酿酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae ）CECLFN524，已于2010年11月05日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC NO. 4299。该菌株从中国新疆楼兰葡萄酒厂小无核白葡萄自然发酵过程中分离筛选得到，其筛选方法是通过WL培养基分离纯化后接入发酵液，用醋酸铅试纸显色法和硫化氢检测管法分别进行低产硫化氢菌株的初筛和复筛，并检测发酵液中硫化氢和氨基甲酸乙酯的含量，最终筛选得到低产硫化氢和氨基甲酸乙酯的葡萄酒酿酒酵母。该菌株可以应用于葡萄酒酿造工业。

Description

一种低产硫化氢和氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母及其筛选方法和应用
一、技术领域：
本发明具体涉及一种低产硫化氢和氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母及其筛选方法和应用。
二、背景技术：
硫化氢（H2S）是对葡萄酒风味有重要影响的挥发性硫化物，在葡萄酒的发酵过程中，会通过酿酒酵母的硫代谢产生痕量的H2S，它的挥发性很强，具有不愉快的气味，通常描述为臭鸡蛋味、臭鼬味、大蒜味或洋葱味(赵光鳌等译(Boulton R B et al.),葡萄酒酿造学:原理及应用,北京：中国轻工业出版社,1989,166-168)，其气味阈值为10-80μg/L(丁书美等,酿酒,2007,34（2）:90-92)。硫化氢如再进一步与醇类物质结合可形成硫醇。硫醇类物质对于葡萄酒质量的影响是双面的。一方面，某些硫醇类物质又是葡萄酒香气特性的组成部分，例如：4-巯基-4-甲基-2-戊酮（4-MMP）可以给赤霞珠干红带来黑醋栗、黄杨木和金雀花的香气，还可以给长相思干白带来典型的黑醋栗芽孢和猫尿味(Suomalainen H and Lehtonen M,Journal of the Institute of Brewing 1979, 85(3): 149-156)。另一方面，低级硫醇有毒，有害健康，破坏酒的风味，给人以不愉快的感觉(宋尔康译（Dittrich，H.H.著）,葡萄酒微生物学,北京：轻工业出版杜,1989,188-201)，虽然它们的生成水平只有每升数十至数百微克，但其感官刺激作用明显，对葡萄酒风味有破坏作用。而且其风味一旦形成，就难以用通气等一般方法简单地去除。在葡萄酒的酿造中，这种影响具有普遍性。
氨基甲酸乙酯（Ethyl Carbamate, EC, 又叫Urethane）早在1943年就被证实是一种致癌物质（Conacher H B S and Page B D, Proceedings of Euro Food Tox Ⅱ. Zürich, 1986, 237-242; Zimmerli B and Schlatter J, Mutation Research, 1991, 259: 325-350; 陆建,曹钰,食品与发酵工业, 1996, (3): 79-82），研究表明，对啮齿类动物，EC是一种多位点致癌物，可导致肺癌、淋巴癌、肝癌和皮肤癌等疾病，并且乙醇对EC的致癌性有促进作用（Sakano K et al., Free Radical Biology and Medicine, 2002, 33: 703-714; Miller Y E et al., Cancer Letters, 2003, 198: 139-144; Tomisawa M et al., Toxicology Letters, 2003, 142: 111-117; Beland F A et al., Food and Chemical Toxicology, 2005, 43: 1-19）。1971年，Lofroth和Gejvall在葡萄酒中发现了EC，1976年，Ough在酸乳酪和葡萄酒中检测到了EC（Ough C S, J Agric Food Chem, 1976, 24: 323-328; Ough, C S, J Agric Food Chem, 1976, 24: 328-331）。葡萄酒中EC的形成和葡萄汁中精氨酸和尿素浓度（U S FDA publication: Ethyl Carbamate - Preventative Action Manual. 1997; Butzke C E, Am J Enol Vitic, 1998, 49 (2): 220-224; Spano G et al., World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2006, 22: 769-773）、葡萄汁营养添加剂（如磷酸氢二铵）(Virginia D M et al., FEMS Yeast Research, 2003, 3: 269-287; Inglis D, Cool C1imate Oenology and Viticuture, Brock University, 2002)及葡萄酒的酿造工艺等有关（Ough C S et al., Am J Enol Vitic, 1991, 42 (1): 26-40; Valero E et al., Biotechnology Letters, 1999, 21: 555-559; Valero E et al., Journal of the Science of Food and Agriculture, 2003, 83: 830-835）。
对于去除葡萄酒中硫化氢的工艺处理主要有铜沉淀法和惰性气体去除法，但是这两种方法都存在一定的问题：铜沉淀法可能会造成葡萄酒中铜离子超标，因此必须将其降至国家标准允许范围内；通过惰性气体去除挥发性物质可能会同时带走其他重要的挥发性物质，从而造成葡萄酒香气物质的损失。酵母分泌的尿素是葡萄酒中EC的主要前体物质之一，葡萄酒酵母代谢精氨酸以及尿素的分泌具有菌株特异性（Ough C S et al., Am J Enol Vitic, 1991, 42 (1): 26-40; Daudt C E et al., Am J Enol Vitic, 1992, 43 (4): 318-322; An D and Ough C S, American Journal of Enology and Viticulture, 1993, 44 (1): 35-40; Torrea-Goñi D and Ancín-azpilicueta C, Journal of Bioscience and Bioengineering, 2002, 94 (1): 15-22）。研究表明，不同酵母菌对降解精氨酸产生尿素有显著差异。构建酵母工程菌也是降低尿素分泌的措施之一，但是由于所构建基因在葡萄酒环境中还不能充分表达，因此选育不分泌尿素或分泌尿素量低的酵母菌株，特别是选育精氨酸酶活力低或用分子育种手段选育精氨酸酶缺陷型酵母菌株，是降低葡萄酒中EC含量的主要措施之一。因此针对尚无自己本土酵母的中国产区而言，寻找能够酿造有中国各产区特色葡萄酒的优良酵母不仅能够提高葡萄酒的质量还对中国葡萄酒本土酵母的发展具有重要意义。
三、发明内容：
本发明为了解决上述背景技术中的不足之处，提供一种低产硫化氢和氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母及其筛选方法和应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为 ：一种低产硫化氢和氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母，其特征在于：所述的葡萄酒酵母为酿酒酵母CECLFN524(Saccharomyces cerevisiae CECLFN524)，该菌种已在 “中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO. 4299，保藏日期为2010年11月05日。
所述的酿酒酵母CECLFN524的DNA序列图谱， 26S D1-D2区序列（577bp）为：
CCCCAACCGGGGATGCTTAGTACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGAGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGCCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCCCGTCTAA；
5.8S-ITS序列（818bp）为： AAAAAAATTTATAATTTTGAAATGGATTTTTTTGTTTTGGCAAGAGCATGAGAGCTTTTACTGGGCAAGAAGACAAGAGATGGAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTGCGCGGTCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCAACTTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAACACAAACAATTTTATCTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCGTAACTGGAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGTGAGTGATACTCTTTGGAGTTAACTTGAAATTGCTGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCGTTTTAGGTTTTACCAACTGCGGCTAATCTTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGATAAGAAGAGAGCGTCTAGGCGAACAATGTTCTTAAAGTTTGACCTCACATCAGGTAGGAGTACCCGCTGAACTTAAGCATATCATAAAACCGGAGGAGAAGAAT。
一种低产硫化氢和氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母的筛选方法，其特征在于：所述的筛选方法为采摘新疆小无核白葡萄，在自然发酵过程中取发酵液，在1mL发酵液样品中加入9mL无菌水进行梯度稀释，涂布WLN固体培养基平板，在温度为28℃下培养5d，根据酿酒酵母在WLN培养基上的菌落特征：选择表面光滑奶油色，中央锥形突起，四周有暗黄色或浅绿色环，不透明，奶油状的单菌落，挑取酿酒酵母单菌落进一步在WLN培养基上划线纯化，然后在纯化后WLN培养基上挑取酿酒酵母单菌落转接入YEPD液体培养基中，在温度为28℃下培养2d后，将酿酒酵母菌株采用甘油冷冻法保藏备用，同时，用接种环将YEPD培养液在YEPD固体培养基上划线，28℃下培养3d后，提取酵母菌落DNA，对rRNA 基因的26S D1/D2区进行聚合酶链式反应（PCR）扩增，对PCR扩增产物（即rRNA 基因的26S D1/D2区）进行测序，测序结果与国家生物技术信息中心（NCBI）上的Nucleotide collection（nr/nt）数据库进行序列比对，鉴定为酿酒酵母菌株；得酿酒酵母菌株；将保藏备用的酿酒酵母菌株进行活化后接入发酵液中，分别采用醋酸铅试纸法初筛、硫化氢检测管复筛和亚甲基兰分光光度法检测发酵液中硫化氢含量，并检测发酵液中氨基甲酸乙酯的含量，筛选获得硫化氢和氨基甲酸乙酯产量低的酿酒酵母CECLFN524（该菌种已在 “中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO. 4299，保藏日期为2010年11月05日）。
酿酒酵母CECLFN524（该菌种已在 “中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO. 4299，保藏日期为2010年11月05日）用于低产硫化氢、低产氨基甲酸乙酯的优质、安全葡萄酒的生产。
酿酒酵母CECLFN524（该菌种已在 “中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO. 4299，保藏日期为2010年11月05日）用于葡萄酒酿造工业中应用，生产优质干白葡萄酒。
酿酒酵母CECLFN524（该菌种已在 “中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO. 4299，保藏日期为2010年11月05日）用于葡萄酒酿造工业中应用，生产优质干红葡萄酒。
与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下：本发明筛选得到的一株低产硫化氢和氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母菌株是从中国新疆楼兰葡萄酒厂小无核白葡萄自然发酵过程中分离筛选得到的，具有优良的酿酒特性，能够有效应用于葡萄酒酿造工业，优化葡萄酒工艺，对于提高葡萄酒的质量具有重要意义。
本发明筛选获得的酵母是从葡萄酒自然发酵过程中分离筛选得到的，具有低产硫化氢和氨基甲酸乙酯的功能，并且具有优良的酿酒特性，该菌株能够有效应用于葡萄酒酿造行业，优化葡萄酒生产工艺，对于提高葡萄酒质量具有重要意义。
四、附图说明：
图1为酿酒酵母在WLN培养基上的菌落特征；
图2为发酵装置及硫化氢检测管显色情况；
图3 为醋酸铅试纸显色情况示意图；
图4为EC校正标准曲线图；
图5 为干白葡萄酒发酵工艺流程图；
图6为干红葡萄酒发酵工艺流程图；
图7为2010年CECLFN524的新疆霞多丽葡萄酒发酵曲线；
图8为本发明菌株CECLFN524的Interdelta指纹图谱。
五、具体实施方式：
本发明一株低产硫化氢和氨基甲酸乙酯葡萄酒酿酒酵母的筛选方法为：采摘新疆小无核白葡萄，在自然发酵过程中取发酵液，在1mL发酵液样品中加入9mL无菌水进行梯度稀释，涂布WLN固体培养基平板，在温度为28℃下培养5d，根据酿酒酵母在WLN培养基上的菌落特征：选择表面光滑奶油色，中央锥形突起，四周有暗黄色或浅绿色环，不透明，奶油状的单菌落，挑取酿酒酵母单菌落进一步在WLN培养基上划线纯化，然后在纯化后WLN培养基上挑取酿酒酵母单菌落转接入YEPD液体培养基中，在温度为28℃下培养2d后，将酿酒酵母菌株采用甘油冷冻法保藏备用。同时，用接种环将YEPD培养液在YEPD固体培养基上划线，28℃下培养3d后，提取酵母菌落DNA，对rRNA 基因的26S D1/D2区进行聚合酶链式反应（PCR）扩增，对PCR扩增产物（即rRNA 基因的26S D1/D2区）进行测序，测序结果与国家生物技术信息中心（NCBI）上的Nucleotide collection（nr/nt）数据库进行序列比对，鉴定为酿酒酵母菌株，得酿酒酵母菌株。将保藏备用的酿酒酵母菌株进行活化后接入发酵液（菌株筛选时发酵液为TripleM模拟汁，实验室小容器发酵及酒厂酿酒试验验分别为不同葡萄品种的葡萄汁/葡萄醪）中，分别采用醋酸铅试纸法初筛、硫化氢检测管复筛和亚甲基兰分光光度法检测发酵液中硫化氢含量，并检测发酵液中氨基甲酸乙酯的含量，筛选获得硫化氢和氨基甲酸乙酯产量低的CECLFN524。
所述的小无核白葡萄在中国新疆楼兰葡萄酒厂采摘。
所述的甘油冷冻法的冷冻温度为-80℃，甘油的体积分数为40%，菌液与40%甘油的体积比为1:1。
所述的CECLFN524在葡萄酒酿造工业中的应用。
酿酒酵母CECLFN524（该菌种已在 “中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO. 4299，保藏日期为2010年11月05日）用于低产硫化氢、低产氨基甲酸乙酯的优质、安全葡萄酒的生产。
酿酒酵母CECLFN524（该菌种已在 “中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO. 4299，保藏日期为2010年11月05日）用于葡萄酒酿造工业中应用，生产优质干白葡萄酒。
酿酒酵母CECLFN524（该菌种已在 “中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO. 4299，保藏日期为2010年11月05日）用于葡萄酒酿造工业中应用，生产优质干红葡萄酒。
实施案例1：低产硫化氢和氨基甲酸乙酯葡萄酒酿酒酵母的筛选
1方法
1.1酵母菌的分离纯化、鉴定及保藏：无菌称量约100g新鲜成熟度良好的葡萄，放入无菌的500mL三角瓶，以无菌的研锤破碎，置于27℃培养，每隔24-72h取发酵液1mL，加入9mL无菌水中进行梯度稀释，取50µL稀释后菌液放入WLN固体培养基，以无菌刮铲涂布均匀，28℃培养5d。根据酿酒酵母在WLN培养基单菌落特征：表面光滑奶油色，中央锥形突起，四周有暗黄色或浅绿色环，不透明，奶油状。试验中WLN培养基上的酿酒酵母菌落图见图1。挑取酿酒酵母单菌落进一步在WLN培养基上划线纯化，将纯化好的菌株挑取酿酒酵母单菌落转接入YEPD液体培养基中28℃培养2d，采用甘油冷冻法（菌液:40%甘油=1:1, -80℃）保藏菌株。
1.1.1 酵母菌DNA提取
将上述的YEPD培养液在YEPD固体培养基上划线培养，于28℃下培养3d后，挑取适量菌落提取DNA。
（1）用接种环取平板上菌落2~4环于200μL裂解液中，加入3/10总体积石英砂在匀浆机振荡13min，每隔4min将离心管取出用力甩几下。（如果菌龄过大可将破壁时间延长一些）然后65℃水浴10min。
（2）加入200μL 5mol/L KAc，冰浴8min；
（3）14000rpm×5min转移上清至新的离心管中；
（4）加入3mol/L NaAc 35ul，加入异丙醇200μL混匀后冰浴8min，14000rpm×5min收集沉淀；
（5）200μL TE溶解，加入RNase 10μL，65℃水浴10min；
（6）加入200μL氯仿－异戊醇（24:1）抽提；
（7）温柔地取上清150μL，加入20μL 3mol/L NaAc及375μL无水乙醇，混匀后14000rpm×8min收集DNA；
（8）70%乙醇洗涤沉淀，吹干后TE溶解，-20℃保藏。
1.1.2 26S rDNA D1/D2区扩增及5.8S-ITS区扩增
使用引物NL1（5-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3）和NL4（5-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3）进行26S rRNA D1/D2区的扩增。PCR循环为：95 ℃预变性 5min，94 ℃变性1min，52 ℃ 退火1min，72 ℃延伸 1min20s；循环36次；72 ℃ 保温8min。PCR反应体系（50μL体系）：10×PCR buffer5μL；25 mM MgCl2 3μL；10mM dNTP 1μL；10μM引物各1μL；Taq酶1.5U，l0ng-lμg/μL模版DNA 1μL；最后加双蒸水定容至50μL。
使用引物ITS1（5¢-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3¢）/ITS4（5¢-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3¢）进行菌株的5.8S-ITS 区基因扩增（White TJ,.et al 1990）。PCR循环为95℃ 5min，95℃ 1min，52℃ 2min，72℃ 2min，循环次数35次，最后，72℃延伸10min。PCR反应体系总体积为50μL，PCR反应体系：10×PCR buffer（Taq buffer with KCL）5μL；25 mM MgCl2 6μL；10mM dNTPs 1μL；10μM引物各2.5μL；Taq酶2.0U，模版DNA 1μL；加双蒸水至50μL）。
PCR反应产物的电泳检测：取5μL PCR扩增原液点样于1%的琼脂糖凝胶（1× TAE缓冲液）电泳，溴化乙锭（EB）染色后在紫外灯照射下初步确定是否扩出所要片段。扩增成功后，进行测序。测序结果与国家生物技术信息中心（NCBI）上的Nucleotide collection（nr/nt）数据库进行序列比对，对酵母菌株是否为酿酒酵母菌株进行鉴定。
1.1.3 Interdelta序列扩增
（1）以基因组DNA为模板，使用优化的Interdelta引物进行PCR扩增；正反向引物序列如下（Legras & Karst, 2003）：
delta12 (5’-TCAACAATGGAATCCCAAC-3’)
delta21 (5’-CATCTTAACACCGTATATGA-3’)
（2）PCR反应体系为25μL，每管中加入1×PCR buffer(10mmol/L Tris-C1 pH8.4, 50mmol/L KCl)；2.5mmol/L的MgCl2；0.5μmol/L delta引物；200μmol/L dNTPs；模板DNA 30-100ng，Taq酶2.0U。ddH2O补齐；
（3）PCR循环为预变性95℃ 4min，变性95℃ 30s，复性46℃ 30s，延伸72℃ 90s，循环次数35次；最后72℃补平10min；
（4）扩增产物在2%琼脂糖凝胶上电泳2.5h，电压100V，电流80mA；在紫外成像仪上观察，照相。
Interdelta扩增图谱是菌株的分子指纹图谱。
1.2低产H2S葡萄酒酵母的筛选
1.2.1低产硫化氢酿酒酵母的初筛：Triple M模拟汁培养基过滤除菌后分装至试管，每管5mL。将活化好的菌液接种到Triple M模拟汁培养基中，把事先制备好的干燥的醋酸铅试纸插在管口，28℃，120 r/min摇床培养4d，观察其显色情况并进行分类、记录，每菌株2个重复。对照用商业酵母UCD522、UCD819，是酿酒酵母，来自The Enology Culture Collection, Department of Viticulture and Enology，UC Davis。
1.2.2低产硫化氢酿酒酵母的复筛：将初筛中得到的较低产H2S的菌进行Triple M模拟汁发酵，用硫化氢检测管法检测H2S的生成量进行复筛。对照用商业酵母UCD522、UCD819，同时从初筛时高产和中产H2S的培养类型中挑取10株作为对照。取100mL已灭菌小玻璃瓶，向其中注入90mL经过过滤除菌的Triple M 模拟汁，每瓶按5×105 cfu/mL（利用血球计数板计数对数期培养的菌株以控制接种量）接种量接入模拟葡萄汁活化酵母菌液，用2孔硅胶冒封好口，其中硫化氢检测管通过球形玻璃弯管与发酵罐内部相连，检测管在硅胶冒下方露出2-3mm，注意要和液面有较大距离，以免在摇床培养时接触模拟汁，另一孔中插入长不锈钢注射针头到发酵液面以下，发酵装置见图2。将小瓶放入摇床中28℃下120 r/min进行培养，3,5-二硝基水杨酸（DNS）法检测还原糖含量监控发酵，还原糖含量低于2 g/L终止发酵测量硫化氢检测管的显色长度，计算硫化氢生成量，每菌株3个重复；并检测发酵液中氨基甲酸乙酯的含量，参照GB/T 15038-2006检测其酒度、残糖及挥发酸。
1.3模拟酒中氨基甲酸乙酯（EC）含量的测定
EC标准溶液：母液：1.00mg/mL，将100mg的EC用丙酮溶解，以100mL容量瓶定容。标准溶液：10.0μg/mL，将1.0mL EC母液加入100mL容量瓶中，用丙酮稀释至刻度。
PC标准溶液：母液：1.00mg/mL，将100mg的PC用丙酮溶解，以100mL容量瓶定容。标准溶液：10.0μg/mL，将1mL PC母液加入100mL容量瓶中，用丙酮稀释至刻度。
PC内标溶液：800ng/mL，将8mL PC标准溶液加入100mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。
标准曲线的绘制：
①校正标准溶液的配制：用二氯甲烷EC标准溶液和PC标准溶液进行稀释，得到以下浓度的EC-PC溶液：(5ng EC + 800ng PC)/mL、(10ng EC + 800ng PC)/mL、(20ng EC + 800ng PC)/mL、(40ng EC + 800ng PC)/mL、(60ng EC + 800ng PC)/mL 、(80ng EC + 800ng PC)/mL、(100ng EC + 800ng PC)/mL和(150ng EC + 800ng PC)/mL。
②校正标准曲线的绘制：准确吸取各浓度的校正标准溶液1mL，置于250mL小烧杯中，加入9mL蒸馏水，混合均匀，再加入10g硅藻土，充分搅拌均匀后，装入玻璃色谱层析柱中，然后用二氯甲烷进行洗脱。洗脱液流经装有10g无水硫酸钠的漏斗，收集在蒸馏烧瓶中，流速控制在2mL/min。洗脱液用真空旋转蒸发仪在30℃条件下进行浓缩，浓缩至4mL左右转至KD瓶中，用少量的二氯甲烷润洗圆底烧瓶，使EC完全转入KD瓶中，在同样条件下浓缩至1mL，转至离心管中进行GC/MS定量分析。对EC-nPC的峰面积比值和EC的浓度（5ng/mL，10ng/mL，20ng/mL，40ng/mL，60ng/mL，80ng/mL，100ng/mL，150ng/mL）绘制标准曲线示意图，并计算出标准曲线回归方程。
模拟酒的萃取：准确量取葡萄酒样品10.0mL于250mL小烧杯中，加入1.0mL PC内标溶液，混合摇匀，加入硅藻土10.0g，用玻璃棒搅拌均匀，装入玻璃色谱层析柱中，然后用75ml二氯甲烷进行洗脱。洗脱液浓缩程序同上。
GC-MS条件：①色谱条件：DB-WAX毛细管色谱柱30m×0.25mm×0.25μm，进样口温度190℃，柱温程序：初温40℃，保持2min，然后以10℃/min升至180℃，保持0.5min，再以50℃/min的速度升至220℃，保持4min。载气为高纯氦气，流速1.0mL/min，不分流进样，进样量1.0μL。②质谱条件：离子源温度220℃；电子能量70eV；接口温度220℃；电子倍增电压1568V；检测离子m/z 62、74、89，定量离子m/z 62。溶剂延迟10min。
2结果与分析
2.1酵母菌株分子鉴定结果
2.1.1. 26S D1-D2区序列（577bp）： CCCCAACCGGGGATGCTTAGTACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGAGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGCCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCCCGTCTAA
与相关模式菌株 NRRL Y-12632 相似性：99.30%，鉴定为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae。
2.1.2．5.8S-ITS部分序列（818bp）： AAAAAAATTTATAATTTTGAAATGGATTTTTTTGTTTTGGCAAGAGCATGAGAGCTTTTACTGGGCAAGAAGACAAGAGATGGAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTGCGCGGTCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCAACTTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAACACAAACAATTTTATCTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCGTAACTGGAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGTGAGTGATACTCTTTGGAGTTAACTTGAAATTGCTGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCGTTTTAGGTTTTACCAACTGCGGCTAATCTTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGATAAGAAGAGAGCGTCTAGGCGAACAATGTTCTTAAAGTTTGACCTCACATCAGGTAGGAGTACCCGCTGAACTTAAGCATATCATAAAACCGGAGGAGAAGAAT
与相关模式菌株 MUCL51208 相似性：99.13%。
经分子鉴定确认为酿酒酵母，图1为其在WLN培养基上的菌落特征形态特征。
2.1.3. Interdelta图谱：
Interdelta序列扩增
以基因组DNA为模板，使用优化的Interdelta引物（delta12、delta21）（Legras & Karst, 2003）进行PCR扩增，菌株CECLFN524的Interdelta指纹图谱见图8。
2.2低产硫化氢和氨基甲酸乙酯葡萄酒酿酒酵母的筛选
（1）低产H2S酿酒酵母菌株的初筛：本研究采用的筛选方法为醋酸铅试纸法，此方法可将筛选与检测H2S生成量一次完成。将初筛采用的醋酸铅试纸按照显色程度进行分级、标号。根据附图中的图3醋酸铅显色可以分为4级，颜色最深的棕黑色记录为（+++），属于高产硫化氢的菌株；而显色结果为棕黄色则记录为（++），属于中产型；显色结果为微黄色或几乎无色则记录为（+）或（-），属于低产硫化氢的菌株。试验结果见表1，根据试验得出CECLFN524（该菌种已在 “中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO. 4299，保藏日期为2010年11月05日）的显色结果为微黄色，比对照工业酵母UCD522的硫化氢产量低，初筛结果属于低产硫化氢菌株。
（2）低产H2S酿酒酵母的复筛：将初筛中得到的较低产H2S的菌株进行Triple M模拟汁发酵，硫化氢检测管法检测H2S的生成量进行复筛。根据附图中的图2可以看出，硫化氢检测管显色明显，界限清晰，可以测量和计算H2S的生成量。本试验中为90mL发酵量生成硫化氢的量μg，试验结果见表2。
从表中可以明显得出优选菌株CECLFN524（该菌种已在 “中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO. 4299，保藏日期为2010年11月05日）的硫化氢生成量1.08μg远远低于高产和中产硫化氢对照菌株，及工业酵母UCD522的硫化氢产量，与工业酵母UCD819的硫化氢产量相近。因此根据复筛结果，菌株CECLFN524为低产硫化氢酿酒酵母菌株。
（3）模拟酒中EC含量的测定：只对上述硫化氢产量较低的菌株进行了EC含量的检测，测定结果见表3。本试验中采取固/液萃取结合GC-MS分析方法对模拟酒中EC的含量进行测定。固/液萃取（Solid/liquid extraction, SLE）方法是将硅藻土和待分析的样品混合均匀，装入玻璃色谱层析柱，然后用二氯甲烷进行洗脱的萃取方法。
模拟酒发酵时的温度为28℃，而正常干白葡萄酒的发酵温度为18-20℃。本试验中用高温进行发酵是为了促进EC的生成，从而可以更准确的测定酵母对精氨酸的转化利用能力。模拟酒中EC含量的测定值均低于15μg/L，满足工业发酵菌株的要求，至此，菌株CECLFN524（该菌种已在 “中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO. 4299，保藏日期为2010年11月05日）具有低产硫化氢和氨基甲酸乙酯的特点，符合筛选标准。
校正标准曲线绘制及回收率测定：校正标准溶液的pH为自然，二氯甲烷用量为75mL，对系列校正标准溶液进行萃取，以GC-MS定量分析得到校正标准曲线，见图4。由图可知在EC含量为0-150μg/L范围内，得回归方程为Y=1.623x+0.003，线性相关，R2=0.999，通过回归方程和线性相关系数可以确定校正标准曲线的准确程度能够应用于EC含量的测定，吸光度与EC含量成线性关系。EC加标回收实验结果见表4。从表4可以看出，采用本方法分析葡萄酒中EC含量时，回收率在82.67-88.71%之间，回收率比较高，用于葡萄酒中EC含量的常规分析结果可靠。
从上述试验中成功筛选得到低产硫化氢和氨基甲酸乙酯的优良葡萄酒酿酒酵母菌株CECLFN524（该菌种已在 “中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO. 4299，保藏日期为2010年11月05日），该菌株具有低产硫化氢和氨基甲酸乙酯的特点，模拟酒各项理化指标满足工业发酵菌株的要求；符合筛选标准。
实施案例2：优选低产H2S及EC葡萄酒酿酒酵母菌株的霞多丽葡萄汁小容器发酵试验
详细酿造工艺流程图见图5。将新鲜的白葡萄品种霞多丽（Chardonnay）葡萄压榨，按总SO2达50mg/L含量添加6%亚硫酸，葡萄汁总糖210g/L，总酸7.5g/L，发酵量500mL，每瓶按5×105cfu/mL（利用血球计数板计数对数期培养的菌株以控制接种量）接种量接入葡萄汁活化酵母菌液，控温于18℃进行发酵。由于发酵量较大不能安装硫化氢检测管装置，因此，酒样中硫化氢的检测参考GB/T 16489-1996 水质硫化物的测定，亚甲基蓝分光光度法，固/液萃取结合GC-MS分析方法测定EC。测还原糖含量小于2g/L时结束发酵，酒精发酵结束后按GB/T 15038-2006检测酒度、总糖、总酸（以酒石酸计）及挥发酸（以醋酸计），结果见表5。
干白葡萄酒中亚甲基兰分光光度法H2S含量的测定：结果见表5。
从表中可以看出，作为低产H2S对照用工业菌株UCD819的H2S生成量为65.51μg/L、高产的菌株H2SUCD522的生成量为177.05μg/L。而通过筛选得到的优选酿酒酵母菌株生成的H2S含量为33.47μg/L，远远低于低产H2S的工业菌株的H2S生成量，具有低产特性。将发酵结束的霞多丽干白葡萄酒对其中的EC含量进行检测。结果发现，在新酿制的葡萄酒中未检测到EC。由表中的理化指标可以看出，筛选出的葡萄酒野生型酿酒酵母可以进行完全发酵，达到葡萄酒国家标准GB15037-2006中对干型葡萄酒的基本指标，酒样的酒度≥11%v/v，总糖≤4.0g/L，挥发酸≤1.2g/L；满足工业发酵的要求，因此 CECLFN524可以作为最终筛选的目标酿酒酵母菌株。
实施案例3：优选低产H2S及EC葡萄酒酿酒酵母菌株的酒厂发酵试验
将筛选出的低产H2S及EC的优选菌CECLFN524在2010、2011、2012连续3年分别在宁夏御马酒厂、山西戎子及甘肃莫高等酒厂进行发酵试验（发酵工艺流程图见图5、图6），研究其酿酒特性。新鲜酿酒葡萄除梗破碎，添加亚硫酸至游离硫含量达到45mg/L，30min后添加20mg/L果胶酶，混匀后，测定葡萄汁的总酸，总糖量。采用新鲜调硫的葡萄汁进行菌株活化，将试验菌株以3%接种量接入到适量葡萄汁中，28℃恒温培养箱中培养24h后，将活化好的试验菌株以106cfu/mL的接种量加入到发酵罐中，每个待测菌株设2个平行。每日分早、中、晚三次对发酵罐进行压帽，并在压帽后取样监控发酵液的品温和比重，比重到0.990-0.996时测还原糖，还原糖含量小于2g/L时结束发酵，酒精发酵结束后按GB/T 15038-2006检测酒度、总糖、总酸、挥发酸及干浸出物。结果见表6。其中2010年宁夏产区霞多丽葡萄CECLFN524（该菌种已在 “中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO. 4299，保藏日期为2010年11月05日）发酵曲线图见图7。
表6 酒厂发酵试验结果
RC212-b(CK) 美乐 10L 247.2 7.1 13.9 2.30 9.30 0.52 37.9
通过连续3年发酵试验发现CECLFN524（该菌种已在 “中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO. 4299，保藏日期为2010年11月05日）的酿酒特性稳定，酒样的酒度≥11%v/v，总糖≤4.0g/L，挥发酸≤1.2g/L，符合GB15037-2006中与酿酒微生物相关的各项指标要求，具有优良的酿酒特性；CECLFN524所酿酒的硫化氢含量均显著低于商业对照，属于低产菌株，且未检测EC的生成，其表现得到厂家的认可，多年、多点的酿酒试验研究，确认该优选菌在葡萄酒工业酿造上极具应用推广潜力。
实施案例4：优选低产H2S及EC葡萄酒酿酒酵母菌株所酿酒样的感官品尝
抽取2010年部分酒样，由西北农林科技大学葡萄酒学院专业品尝员组成品尝小组从外观、香气、口感等方面对不同酒样进行综合感官评价，并分别进行感官特性的描述和品尝打分，结果分别见表7，表8。
从感官特性描述结果看出，CECLFN524所酿葡萄酒香气馥郁，口感平衡，具有优良葡萄酒基本品质。利用DPS分析软件，对2010霞多丽干白葡萄酒的品尝数据进行方差分析，发现菌株CECLFN524发酵的干白葡萄酒与对照菌VL1发酵的干白葡萄酒有着显著的差异。基于对供试酿酒酵母菌株CECLFN524（该菌种已在 “中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO. 4299，保藏日期为2010年11月05日）以及商业对照菌株VL1的发酵曲线、所酿造霞多丽葡萄酒的理化指标和品尝分析，酵母菌株CECLFN524（该菌种已在 “中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO. 4299，保藏日期为2010年11月05日）在霞多丽葡萄酒的酿造过程中，能顺利、平稳、彻底的发酵，能充分的表现霞多丽的典型品质，给人带来以愉悦的感觉，酿酒品质显著优于商业酵母对照，因此酿酒酵母菌株CECLFN524（该菌种已在 “中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO. 4299，保藏日期为2010年11月05日）可用于优质霞多丽干白葡萄酒的酿造。
利用DPS分析软件，对2010蛇龙珠干红葡萄酒的品尝数据进行方差分析，菌株CECLFN524（该菌种已在 “中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO. 4299，保藏日期为2010年11月05日）与商业菌株RC212之间没有显著性差异，得分高于对照，所酿葡萄酒具有优良的感官品质。通过对菌株CECLFN524（该菌种已在 “中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO. 4299，保藏日期为2010年11月05日）及商业对照酵母RC212的发酵曲线、所酿造蛇龙珠干红葡萄酒的理化指标和品尝分析，菌株CECLFN524（该菌种已在 “中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO. 4299，保藏日期为2010年11月05日）可用于进行优良干红葡萄酒的酿造。
综上所述，优选菌株CECLFN524（该菌种已在 “中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO. 4299，保藏日期为2010年11月05日）在酿造白葡萄酒和红葡萄酒过程中，都表现出良好的酿酒特性，所酿葡萄酒具有优良的感官品质，优于目前主流的优良商业酵母，其表现也得到了葡萄酒厂家的认可，因此该菌株可以应用于葡萄酒酿造工业。
SEQUENCE LISTING
<110> 西北农林科技大学
<120> 一种低产硫化氢和氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母及其筛选方法和应用
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 577
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(CECLFN524)
<400> 1
ccccaaccgg ggatgcttag tacggcgagt gaagcggcaa aagctcaaat ttgaaatctg 60
gtaccttcgg tgcccgagtt gtaatttgga gagggcaact ttggggccgt tccttgtcta 120
tgttccttgg aacaggacgt catagagggt gagaatcccg tgtggcgagg agtgcggttc 180
tttgtaaagt gccttcgaag agtcgagttg tttgggaatg cagctctaag tgggtggtaa 240
attccatcta aagctaaata ttggcgagag accgatagcg aacaagtaca gtgatggaaa 300
gatgaaaaga actttgaaaa gagagtgaaa aagtacgtga aattgttgaa agggaagggc 360
atttgatcag acatggtgtt ttgtgccctc tgctccttgt gggtagggga atctcgcatt 420
tcactgggcc agcatcagtt ttggtggcag gataaatcca taggaatgta gcttgcctcg 480
gtaagtatta tagcctgtgg gaatactgcc agctgggact gaggactgcg acgtaagtca 540
aggatgctgg cataatggtt atatgccgcc cgtctaa 577
<110> 西北农林科技大学
<120> 一种低产硫化氢和氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母及其筛选方法和应用
<130> 2014
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 577
<212> DNA
<213> 酿酒酵母CECLFN524
<400> 1
ccccaaccgg ggatgcttag tacggcgagt gaagcggcaa aagctcaaat ttgaaatctg 60
gtaccttcgg tgcccgagtt gtaatttgga gagggcaact ttggggccgt tccttgtcta 120
tgttccttgg aacaggacgt catagagggt gagaatcccg tgtggcgagg agtgcggttc 180
tttgtaaagt gccttcgaag agtcgagttg tttgggaatg cagctctaag tgggtggtaa 240
attccatcta aagctaaata ttggcgagag accgatagcg aacaagtaca gtgatggaaa 300
gatgaaaaga actttgaaaa gagagtgaaa aagtacgtga aattgttgaa agggaagggc 360
atttgatcag acatggtgtt ttgtgccctc tgctccttgt gggtagggga atctcgcatt 420
tcactgggcc agcatcagtt ttggtggcag gataaatcca taggaatgta gcttgcctcg 480
gtaagtatta tagcctgtgg gaatactgcc agctgggact gaggactgcg acgtaagtca 540
aggatgctgg cataatggtt atatgccgcc cgtctaa 577
<210> 2
<211> 818
<212> DNA
<213> 酿酒酵母CECLFN524
<400> 2
aaaaaaattt ataattttga aatggatttt tttgttttgg caagagcatg agagctttta 60
ctgggcaaga agacaagaga tggagagtcc agccgggcct gcgcttaagt gcgcggtctt 120
gctaggcttg taagtttctt tcttgctatt ccaaacggtg agagatttct gtgcttttgt 180
tataggacaa ttaaaaccgt ttcaatacaa cacactgtgg agttttcata tctttgcaac 240
tttttctttg ggcattcgag caatcggggc ccagaggtaa caaacacaaa caattttatc 300
tattcattaa atttttgtca aaaacaagaa ttttcgtaac tggaaatttt aaaatattaa 360
aaactttcaa caacggatct cttggttctc gcatcgatga agaacgcagc gaaatgcgat 420
acgtaatgtg aattgcagaa ttccgtgaat catcgaatct ttgaacgcac attgcgcccc 480
ttggtattcc agggggcatg cctgtttgag cgtcatttcc ttctcaaaca ttctgtttgg 540
tagtgagtga tactctttgg agttaacttg aaattgctgg ccttttcatt ggatgttttt 600
tttccaaaga gaggtttctc tgcgtgcttg aggtataatg caagtacggt cgttttaggt 660
tttaccaact gcggctaatc tttttttata ctgagcgtat tggaacgtta tcgataagaa 720
gagagcgtct aggcgaacaa tgttcttaaa gtttgacctc acatcaggta ggagtacccg 780
ctgaacttaa gcatatcata aaaccggagg agaagaat 818

Claims (6)

1.一种低产硫化氢和氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母，其特征在于：所述的葡萄酒酵母为酿酒酵母CECLFN524(Saccharomyces cerevisiae CECLFN524)，该菌种已在 “中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”保藏，保藏编号为CGMCC NO. 4299，保藏日期为2010年11月05日。
2.根据权利要求1所述的一种低产硫化氢和氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母，其特征在于：所述的酿酒酵母CECLFN524的DNA序列图谱， 26S D1-D2区序列（577bp）为：
CCCCAACCGGGGATGCTTAGTACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGAGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGCCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCCCGTCTAA；
5.8S-ITS序列（818bp）为： AAAAAAATTTATAATTTTGAAATGGATTTTTTTGTTTTGGCAAGAGCATGAGAGCTTTTACTGGGCAAGAAGACAAGAGATGGAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTGCGCGGTCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCAACTTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAACACAAACAATTTTATCTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCGTAACTGGAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGTGAGTGATACTCTTTGGAGTTAACTTGAAATTGCTGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCGTTTTAGGTTTTACCAACTGCGGCTAATCTTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGATAAGAAGAGAGCGTCTAGGCGAACAATGTTCTTAAAGTTTGACCTCACATCAGGTAGGAGTACCCGCTGAACTTAAGCATATCATAAAACCGGAGGAGAAGAAT。
3.根据权利要求1所述的一种低产硫化氢和氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母的筛选方法，其特征在于：所述的筛选方法为采摘新疆小无核白葡萄，在自然发酵过程中取发酵液，在1mL发酵液样品中加入9mL无菌水进行梯度稀释，涂布WLN固体培养基平板，在温度为28℃下培养5d，根据酿酒酵母在WLN培养基上的菌落特征：选择表面光滑奶油色，中央锥形突起，四周有暗黄色或浅绿色环，不透明，奶油状的单菌落，挑取酿酒酵母单菌落进一步在WLN培养基上划线纯化，然后在纯化后WLN培养基上挑取酿酒酵母单菌落转接入YEPD液体培养基中，在温度为28℃下培养2d后，将酿酒酵母菌株采用甘油冷冻法保藏备用，同时，用接种环将YEPD培养液在YEPD固体培养基上划线，28℃下培养3d后，提取酵母菌落DNA，对rRNA 基因的26S D1/D2区进行聚合酶链式反应（PCR）扩增，对PCR扩增产物（即rRNA 基因的26S D1/D2区）进行测序，测序结果与国家生物技术信息中心（NCBI）上的Nucleotide collection（nr/nt）数据库进行序列比对，鉴定为酿酒酵母菌株；得酿酒酵母菌株；将保藏备用的酿酒酵母菌株进行活化后接入发酵液中，分别采用醋酸铅试纸法初筛、硫化氢检测管复筛和亚甲基兰分光光度法检测发酵液中硫化氢含量，并检测发酵液中氨基甲酸乙酯的含量，筛选获得硫化氢和氨基甲酸乙酯产量低的酿酒酵母CECLFN524。
4.如权利要求1酿酒酵母CECLFN524用于低产硫化氢、低产氨基甲酸乙酯的优质、安全葡萄酒的生产。
5.如权利要求1酿酒酵母CECLFN524用于葡萄酒酿造工业中应用，生产优质干白葡萄酒。
6.如权利要求1酿酒酵母CECLFN524用于葡萄酒酿造工业中应用，生产优质干红葡萄酒。
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