CN113174342A - 高效降解氨基甲酸乙酯的菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是提供一株高效降解氨基甲酸乙酯的根瘤土壤杆菌，该菌为从土壤中筛选得到的DL‑DNH02菌株，经鉴定为根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，已于2020年12月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.21309。该菌株的发酵液、发酵液上清、细胞悬浮液和细胞裂解液可用于制备氨基甲酸乙酯降解剂，均可降解氨基甲酸乙酯。本发明所筛选的DL‑DNH02菌株对氨基甲酸乙酯的降解率达到95％，对发酵食品尤其是酒类食品中氨基甲酸乙酯有很好的降解能力，可有效提升白酒、葡萄酒、清酒、黄酒和米酒等发酵食品的质量品质和安全性。

Description

高效降解氨基甲酸乙酯的菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及到一种根瘤土壤杆菌及其应用。具体的说是从土壤中分离出一株具有EC降解活性的菌株，通过16s rDNA鉴定，确定其为根瘤土壤杆菌，命名为根瘤土壤杆菌DL-DNH02(Agrobacterium tumefaciens)。
背景技术
氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate，EC)是一种具有遗传毒性和较强致癌性的代谢产物，广泛存在于酒精饮料和发酵食品(如腐乳、酱油、乳酪、食醋、泡菜等)中，对食品安全和人体健康有着严重的影响和危害。
发酵食品中的EC主要是由尿素、氨甲酰磷酸、瓜氨酸、焦碳酸二乙酯等含氨甲酰基前体物质与乙醇反应而形成。发酵食品中的EC可通过工艺优化、代谢工程、微生物降解和酶法去除。
工艺优化是通过工艺控制降低或消除发酵液中EC的前体物质而减少。
代谢工程法是通过基因敲除或基因过表达方法阻断胞内前体物质生成，或增强前体物质的吸收和利用，从而减少EC的合成。
微生物降解和酶法去除，广义地讲，是利用EC降解酶(或EC前体降解酶) 或产相应酶的微生物，直接降解发酵产品中的EC或EC前体物质，比如，脲酶可以将尿素分解为氨和CO2，可有效减少EC生成，在生产过程中利用酸性脲酶控制成品酒中EC含量是最为常用方法。由于尿素并不是唯一的形成EC的前体物质，因此该方法难以彻底根除EC的形成。
微生物降解和酶法去除，狭义地讲，是利用EC降解酶或产相应酶的微生物，直接降解发酵产品中的EC。EC水解酶能够将EC降解为乙醇、氨和二氧化碳，从而能够有效的降解EC。
由于EC形成机制多而且比较复杂，同时抑制多种形成EC的机制比较困难，难以彻底根除EC前体物质，从而难以彻底消除EC的形成，并且EC形成后由于其结构非常稳定，难以根除，因此应用微生物降解和生物酶法去除成品中已经形成的EC，是一种较为理想的去除方法。
但是，目前现有的EC降解菌资源库远远不能满足食品中EC生物降解的实际需求，目前发现的EC降解菌株还比较少，而且利用微生物实现对EC的降解，机理比较复杂，目前尚未阐释，也进一步影响了微生物来源EC降解酶的分离和应用。
因此，开展发酵食品中EC的微生物去除技术研究，筛选不同类型的EC高效降解微生物菌株是十分必要的，可为减低发酵食品中EC残留提供有效手段，为保障发酵食品安全提供技术支持。
发明内容
本发明的目的是克服现有EC降解菌剂的不足，提供一种高效降解EC的根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株DL-DNH02。
本发明的第二个目的是提供所述菌株DL-DNH02在降解氨基甲酸乙酯中的应用。
本发明的第三个目的是提供所述菌株DL-DNH02在制备氨基甲酸乙酯降解制剂中的应用。
本发明的第四个目的是提供所述菌株DL-DNH02在发酵食品中降解氨基甲酸乙酯的应用。
本发明的上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供一株高效降解氨基甲酸乙酯的根瘤土壤杆菌DL-DNH02(分类命名：Agrobacterium tumefaciens)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC No.21309。
所述菌株DL-DNH02在降解氨基甲酸乙酯中的应用。
优选的是，所述菌株DL-DNH02在降解氨基甲酸乙酯中的应用还包括在发酵食品中降解氨基甲酸乙酯。
优选的是，所述在发酵食品中降解氨基甲酸乙酯的应用包括在白酒中降解氨基甲酸乙酯。
优选的是，所述应用包含所述菌株DL-DNH02的发酵产物在降解氨基甲酸乙酯中的应用，所述发酵产物包括所述菌株的含菌发酵液、发酵液上清、菌体悬浮液、细胞裂解液(即下述无细胞抽提物)。
优选的是，所述在白酒中降解氨基甲酸乙酯的过程包括将所述菌株 DL-DNH02加入白酒中，以30℃、100rpm的条件在锥形瓶中温育5天降解白酒中的氨基甲酸乙酯。
本发明还提供一种氨基甲酸乙酯降解剂的制备方法，包括以下步骤：
S1、将活化后的菌株DL-DNH02培养液以10％接种量接种于营养肉汤培养基进行培养，在30℃、180rpm恒温振荡培养24h，获得种子液；
S2、将S1步骤所述种子液按1:10比例接种于装有发酵培养基的生产发酵罐 (装液量70％)，通气量0.6-1.0m3/min，搅拌速率180rpm，30℃培养24-48h；发酵结束后获得菌体数量≥1.0×109CFU/mL的发酵液；
S3、含菌发酵液微胶囊的制备：收集S2步骤发酵液，经冷冻真空干燥后，利用去离子水回调体积至原体积的1/20，制得所述DL-DNH02含菌发酵液，经海藻酸钠包埋后制成所述含菌发酵液微胶囊；
S4、发酵液上清微胶囊的制备：离心S3所述DL-DNH02含菌发酵液并收集DL-DNH02菌体沉淀物和发酵液上清；所述发酵液上清经冷冻真空干燥后，利用去离子水回调体积至其原体积的1/20，得到所述DL-DNH02发酵液上清，经海藻酸钠包埋后制成所述发酵液上清微胶囊；
S5、菌体悬浮液微胶囊的制备：用稀释剂稀释S4步骤所述DL-DNH02菌体沉淀物，得到浓度20OD的所述DL-DNH02菌体悬浮液，经海藻酸钠包埋后制成所述菌体悬浮液微胶囊；
S6、细胞裂解液微胶囊的制备：取S5步骤所述菌株DL-DNH02菌体悬液经过细胞破壁得到所述DL-DNH02细胞裂解液或无细胞抽提物，经海藻酸钠包埋后制成所述细胞裂解液微胶囊；
优选的是，所述含菌发酵液微胶囊、发酵液上清微胶囊、菌体悬浮液微胶囊、细胞裂解液微胶囊的制作步骤如下：
S1、取壳聚糖溶解在100mL质量分数为1.0％的醋酸溶液中，然后加入终浓度1.0％的CaCl2，搅拌溶解，得到壳聚糖氯化钙混合溶液；
S2、配制2.5％质量浓度的海藻酸钠溶液，将所述DL-DNH02含菌发酵液按 1：1体积比例溶于其中；滴加至所述壳聚糖氯化钙混合溶液中，边滴加边搅拌，滴加结束后，继续搅拌0.5h，过滤、洗涤，收集含菌发酵液微胶囊；
S3、配制2.5％质量浓度的海藻酸钠溶液，将所述DL-DNH02发酵液上清按1：1体积比例溶于其中；滴加至所述壳聚糖氯化钙混合溶液中，边滴加边搅拌，滴加结束后，继续搅拌0.5h，过滤、洗涤，收集发酵液上清微胶囊；
S4、配制2.5％质量浓度的海藻酸钠溶液，将所述DL-DNH02菌体悬液按1： 1体积比例溶于其中；滴加至所述壳聚糖氯化钙混合溶液中，边滴加边搅拌，滴加结束后，继续搅拌0.5h，过滤、洗涤，收集菌体悬浮液微胶囊；
S5、配制2.5％质量浓度的海藻酸钠溶液，将所述DL-DNH02细胞裂解液按 1：1体积比例溶于其中；滴加至所述壳聚糖氯化钙混合溶液中，边滴加边搅拌，滴加结束后，继续搅拌0.5h，过滤、洗涤，收集细胞裂解液微胶囊。
一种氨基甲酸乙酯降解剂降解发酵食品中氨基甲酸乙酯的方法，包括将所述氨基甲酸乙酯降解剂接种至发酵食品中，以30℃、100rpm的条件温育5天降解发酵食品中的氨基甲酸乙酯。
本发明具有以下有益效果：
本发明筛选获得一株EC高效降解菌株根瘤土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)DL-DNH02，该菌株可以利用EC作为唯一碳源生长，可有效降解 EC，24h对EC的降解率达到90％以上，72h降解EC 95％以上，具有良好的 EC生物降解效果。之前，研究人员将胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)应用到中国商业化的白酒中，可降解其51.6％的EC(Appl BiochemBiotechnol,2013: 1-13)。来源于L.fermentum的酸性脲酶添加到日本清酒(pH 4.4，17％(v/v)乙醇)中，反应2天后可将酒中的尿素降解到1μg/L以下，从而间接抑制EC的生成，但对已生成的EC去除效果，文章并没有报道(参考文献：Appl MicrobiolBiotechnol,1990,32(5):538-543.)。
本发明筛选获得一株EC高效降解菌株根瘤土壤杆菌DL-DNH02 (Agrobacteriumtumefaciens)，该菌株生长时以EC作为唯一碳源，可有效降解 EC，24h对EC的降解率达到90％以上，72h降解EC 95％以上，具有良好的 EC生物降解效果。该菌株可用于发酵食品中EC的去除，解决了发酵食品中有毒有害代谢产物超标问题和安全问题，支撑安全发酵食品的优质发展。
本发明进一步提供了一种使用菌株DL-DNH02生产制备得到的降解制剂，具有生产成本低、使用方便，去除效果明显，易于从发酵产品体系中移除等优点，适合酒类、酱油、醋类等液体发酵食品中EC的去除。
附图说明
图1为实施例1中根瘤土壤杆菌DL-DNH02的菌落照片；
图2为实施例1中根瘤土壤杆菌DL-DNH02以EC为唯一碳源时的筛选图片；
图3为实施例2中根瘤土壤杆菌DL-DNH02的16S rDNA序列的系统发育树。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例与说明书附图进一步说明本发明。
除非特殊说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
本发明中使用的各种培养基均采用常规方法配制，实施例中涉及的分子生物学操作如未注明具体试验条件和方法，均参照“SambrookJ等主编，科学出版社，2002，分子克隆实验指南(第三版)”；或参照产品说明书。
本发明使用的培养基的配制如下：
(1)富集培养基：蛋白胨5g、牛肉膏3g、氯化钠5g，蒸馏水1000mL，调pH 至7.0，高压灭菌20min。
(2)普通固体培养基：蛋白胨5g、牛肉膏3g、氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水补至1000mL，调pH至7.0，高压灭菌20min，然后倒平板。
(3)LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，蒸馏水补至 1L，调pH至7.0，高压灭菌20min。
(4)LB固体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，15g琼脂，蒸馏水补至1L，调pH至7.0，高压灭菌20min，然后倒平板。
实施例1
菌株DL-DNH02的分离和纯化，具体步骤如下：
(1)从陕西宝鸡柳林镇土壤中采集样品。
(2)采用富集培养法进行分离筛选，具体如下：
取土壤样品5g加入50mL LB液体培养基中，同时加入EC母液，使EC 最终质量浓度为1g/L，于30℃、200rpm条件下震荡培养，进行EC降解菌富集。培养2d后，按1:10的比例转接到第二批含2g/L EC的LB培养基中。相同条件培养2d后，再1:10的比例转接到第三批含4g/LEC的LB培养基中，继续培养2d。相同条件培养2d后，再1:10的比例转接到第四批含浓度8g/L的EC的LB培养基中，继续培养2d。连续富集培养四次后，利用分光光度计测定培养液OD值为2，最后取200μL富集培养液，均匀涂抹到以8g/L EC为唯一碳源的M9固体平板上，如图1所示，根瘤土壤杆菌DL-DNH02可在含有8g/L EC的M9固体培养基上生长，30℃倒置培养至菌落出现，然后挑取不同形态特征的单菌落一一划线到以8g/L EC为唯一碳源的M9固体平板上，如图2所示，采用平板划线法，利用含8g/L EC的M9固体培养基进行3次分离纯化，得到根瘤土壤杆菌DL-DNH02的纯培养物。
(3)采用上述方法从土壤样品中成功分离获得一株高效降解EC的菌株，编号为DL-DNH02，该菌株可以利用EC作为唯一碳源生长，24h内对EC的降解率达到90％以上，具有较好的EC降解活性。
实施例2
菌株DL-DNH02的鉴定，具体步骤如下：
(1)菌株DL-DNH02在LB固体平板中生长良好，30℃培养18-36h，形成圆形、突起、光滑、白色至灰白色、半透明菌落；镜检以现菌体呈短杆菌，革兰氏染色证明是G-菌；无芽胞，有鞭毛，以1～6根周生或侧生鞭毛运动，好氧，化能异养型。最适生长温度28～30℃，最适pH6.5～7.0。
(2)进一步利用TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit(TaKaRa16S rDNA细菌鉴定PCR试剂盒，TaKaRa，中国大连，货号RR176)进行菌株 DL-DNH02的16SrRNA鉴定。所有操作按照试剂盒说明进行。
菌体样品直接用试剂盒推荐的煮沸法处理获得PCR模板，具体如下：将纯化后的该菌种接种于LB固体培养基上，28℃培养24h，然后使用灭菌牙签挑取单菌落，然后置于装有10μL的16S-free H2O的Microtube中，于PCR仪上 99℃热变性10分钟后进行离心分离，取5μL上述液体作模板进行PCR反应。
PCR反应体系50μL：2×PCR Mix 25μL，引物Forward Primer 1μL，引物 ReversePrimer2为1μL，上述模板上清液5μL，加入H2O补齐到50μL。
PCR程序：94℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃1.5min，30个循环；72℃10min。
PCR结束后，PCR产物直接送上海生工测序，测序结果显示具有序列表中SEQ IDNo.1的核苷酸序列，将其进行Blastn分析，发现该菌与根瘤土壤杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens)的同源性最高，达到100％。
综上所述，如图3所示，经形态学特征和16S rRNA系统发育分析，鉴定该降解菌株DL-DNH02属于根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)。于2020 年12月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号：CGMCC No.21309。保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3 号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
实施例3
菌株DL-DNH02的EC降解效果，具体内容如下：
将纯化后的菌株DL-DNH02在LB液体培养基中培养至对数周期，以10％接种量接入含EC 6g/L的LB培养基中，在30℃、180rpm条件下恒温振荡培养，同时设置不接菌的LB培养基作对照，每个处理3个重复。分别在0d、1d、2d、 3d、4d时，吸取上清液2mL，过0.2μm滤膜，然后采用分光光度法测定培养上清液中EC的残留量(参考分析实验室,2004,23(4):28-30；CN103954568 A)。该方法的原理：对二甲氨基苯甲醛(PDAB)与EC在酸性条件下发生Ehrlich反应，形成柠檬黄色衍生物——对二甲胺基苯亚甲基胺基甲酸乙酯，在416nm处有最大吸收。氨基甲酸乙酯的质量浓度与柠檬黄色衍生物的吸光度呈正相关，即氨基甲酸乙酯浓度越大吸光度越大。根据吸光度的大小和标准曲线即可计算氨基甲酸乙酯的浓度。然后计算降解率。结果显示，菌株DL-DNH02对EC具有较好的降解效果，在培养24h时可降解90％的EC，在培养72h时EC降解率达到95％以上。
降解率计算公式：
Figure RE-GDA0003115056740000071
实施例4
DL-DNH02菌株发酵产物对EC的降解，具体内容如下：
1、DL-DNH02菌株活化
将菌株接种于LB液体培养基中进行活化，在30℃、180rpm条件下恒温振荡培养24h。
2、DL-DNH02菌株发酵
将活化后的菌株培养液以10％接种量接种于发酵培养基(每升发酵培养基含有蛋白胨5g、牛肉膏3g、氯化钠5g，去离子水补足1000mL，pH7.0)进行发酵，在30℃、180rpm恒温振荡培养48h，获得DL-DNH02菌株的含菌发酵液。
3、DL-DNH02发酵液EC降解实验
将步骤2中所获得的含菌发酵液，充分混匀，取900μL的DL-DNH02含菌发酵液与100μL 60mg/mL的EC溶液混匀，使得EC的最终浓度为6mg/mL；对
Figure RE-GDA0003115056740000081
照组为未接种的无菌的发酵培养基，900μL的发酵培养基与100μL 60mg/mL的 EC溶液混匀，使得EC的最终浓度也为6mg/mL；实验组和对照组在在30℃、 180rpm恒温振荡温育24h。反应结束后，也按实施例4中的分光光度法测量清液中EC的残留量(参考分析实验室,2004,23(4):28-30；CN 103954568 A)。计算降解率，其计算公式如下：
4、DL-DNH02发酵液上清EC降解实验
取10mL步骤2中所获得的含菌发酵液，12000rpm，离心10min，离心上清利用0.45μm的滤膜过滤除菌，得到DL-DNH02发酵液上清。取900μL的 DL-DNH02发酵液上清与100μL60mg/mL的EC溶液混匀，使得EC的最终浓度为6mg/mL；对照组为未接种的无菌的发酵培养基，900μL的发酵培养基与 100μL 60mg/mL的EC溶液混匀，使得EC的最终浓度也为6mg/mL；实验组和对照组在在30℃、180rpm恒温振荡温育24h。反应结束后，也按实施例4 中的分光光度法测量清液中EC的残留量(分析实验室,2004,23(4):28-30；CN 103954568A)。计算降解率，计算公式如下：
Figure RE-GDA0003115056740000082
5、DL-DNH02菌体悬液EC降解实验
取10mL步骤2中所获得的含菌发酵液，12000rpm，离心10min，弃上清；菌体利用10mL生理盐水重悬，12000rpm，离心10min，弃上清；菌体重悬于1mL生理盐水，得到DL-DNH02菌体悬液。取900μL的DL-DNH02菌体悬液与100μL 60mg/mL的EC溶液混匀，使得EC的最终浓度为6mg/mL；对照组为无菌生理盐水，900μL的生理盐水与100μL 60mg/mL的EC溶液混匀，使得 EC的最终浓度也为6mg/mL；实验组和对照组在在30℃、180rpm恒温振荡温育24h。反应结束后，也按实施例4中的分光光度法测量清液中EC的残留量(分析实验室,2004,23(4):28-30；CN 103954568 A)。计算降解率，其计算公式如下：
Figure RE-GDA0003115056740000091
6、DL-DNH02菌体细胞裂解液EC降解实验
取50mL步骤2中所获得的含菌发酵液，12000rpm，离心10min，弃上清；菌体利用50mL磷酸盐(50mM，pH7.0)缓冲液重悬，12000rpm，离心10min，弃上清；菌体重悬于5mL磷酸盐(50mM，pH7.0)缓冲液，使用超声细胞破碎仪将细胞悬液冰上破碎(每次超声5s，间隔5s，共10min)。破菌后，4℃， 12000rpm离心12min，收集上清，用0.45μm的滤膜过滤除菌，所得到滤液即为菌体细胞裂解液。取900μL的DL-DNH02菌体细胞裂解液与100μL 60mg/mL 的EC溶液混匀，使得EC的最终浓度为6mg/mL；对照组为无菌磷酸盐(50mM， pH7.0)缓冲液，900μL的磷酸盐(50mM，pH7.0)缓冲液与100μL 60mg/mL 的EC溶液混匀，使得EC的最终浓度也为6mg/mL；实验组和对照组在在30℃、 180rpm恒温振荡温育24h。反应结束后，也按实施例4中的分光光度法测量清液中EC的残留量(分析实验室,2004,23(4):28-30；CN 103954568 A)。计算降解率，公式如下：
Figure RE-GDA0003115056740000092
结果显示，在24h的作用时间内，测定的DL-DNH02含菌发酵液的EC降解率为90％，DL-DNH02发酵液上清的EC降解率为86％，DL-DNH02菌体悬浮液的EC降解率为89％，DL-DNH02细胞裂解液的EC降解率为95％。
实施例5：
一种DL-DNH02菌株EC降解制剂的制备，具体步骤如下：
S1、将菌株接种于LB液体培养基中进行活化，在28℃、180rpm恒温振荡培养24h。
S2、将活化后的菌株培养液接10％接种量接种于营养肉汤培养基(每升发酵培养基含有蛋白胨5g、牛肉膏3g、氯化钠5g，去离子水补足1000mL，pH7.0) 进行培养，在30℃、180rpm恒温振荡培养24h。获得的即为种子液。将种子液按1:10比例接种于装有发酵培养基(每升发酵培养基含有蛋白胨5g、牛肉膏3g、氯化钠5g，去离子水补足1000mL，pH7.0)的生产发酵罐(装液量70％)，通气量1.0m3/min，搅拌速率为180rpm，培养温度控制在30℃，培养时间为24h。发酵结束后菌体数量≥1×109CFU/mL。发酵完成后，无菌条件下收集培养液直接用包装瓶分装成液体剂型。
S3、收集发酵液，经冷冻真空干燥，利用去离子水回调体积至原体积的1/20；得到DL-DNH02含菌发酵液。
S4、取适量壳聚糖溶解在100mL质量分数为1.0％的醋酸溶液中，然后加入终浓度1.0％的CaCl2，搅拌溶解，得到壳聚糖氯化钙混合溶液；
S5、配制2.5％质量浓度的海藻酸钠溶液，将所制得的DL-DNH02含菌发酵液按1：1体积比例溶于其中；
S6、取10mL上述溶有DL-DNH02含菌发酵液的海藻酸钠溶液，用带8号针头的10mL注射器缓慢滴加至壳聚糖氯化钙溶液中，边滴加边搅拌，滴加结束后，继续搅拌0.5h，过滤、洗涤，收集产生的含菌发酵液微胶囊，命名为EC 降解剂1。
实施例6
一种DL-DNH02菌株EC降解制剂的制备，具体步骤如下：
S1、将菌株接种于LB液体培养基中进行活化，在28℃、180rpm恒温振荡培养24h。
S2、将活化后的菌株培养液接10％接种量接种于营养肉汤培养基(每升发酵培养基含有蛋白胨5g、牛肉膏3g、氯化钠5g，去离子水补足1000mL，pH7.0) 进行培养，在30℃、180rpm恒温振荡培养24h。获得的即为种子液。将种子液按1:10比例接种于装有发酵培养基(每升发酵培养基含有蛋白胨5g、牛肉膏3g、氯化钠5g，去离子水补足1000mL，pH7.0)的生产发酵罐(装液量70％)，通气量1.0m3/min，搅拌速率为180rpm，培养温度控制在30℃，培养时间为24h。发酵结束后菌体数量≥1×109CFU/mL。发酵完成后，无菌条件下收集培养液直接用包装瓶分装成液体剂型。
S3、收集发酵液，经冷冻真空干燥，利用去离子水回调体积至原体积的1/20；得到含菌发酵液。
S4、含菌发酵液4000g离心10min并收集DL-DNH02菌体沉淀物和发酵液上清；发酵液上清经冷冻真空干燥，利用去离子水回调体积至原体积的1/20；
S5、取适量壳聚糖溶解在100mL质量分数为1.0％的醋酸溶液中，然后加入终浓度1.0％的CaCl2，搅拌溶解，得到壳聚糖氯化钙混合溶液；
S6、配制2.5％质量浓度的海藻酸钠溶液，将所制得的DL-DNH02发酵液上清按1：1体积比例溶于其中；
S7、取10mL上述溶有DL-DNH02发酵液上清的海藻酸钠溶液，用带8号针头的10mL注射器缓慢滴加至壳聚糖氯化钙溶液中，边滴加边搅拌，滴加结束后，继续搅拌0.5h，过滤、洗涤，收集产生的发酵液上清微胶囊，命名为EC 降解剂2。
实施例7：
一种DL-DNH02菌株EC降解制剂的制备，具体步骤如下：
S1、将菌株接种于LB液体培养基中进行活化，在28℃、180rpm恒温振荡培养24h。
S2、将活化后的菌株培养液接10％接种量接种于营养肉汤培养基(每升发酵培养基含有蛋白胨5g、牛肉膏3g、氯化钠5g，去离子水补足1000mL，pH7.0) 进行培养，在30℃、180rpm恒温振荡培养24h。获得的即为种子液。将种子液按1:10比例接种于装有发酵培养基(每升发酵培养基含有蛋白胨5g、牛肉膏3g、氯化钠5g，去离子水补足1000mL，pH7.0)的生产发酵罐(装液量70％)，通气量1.0m3/min，搅拌速率为180rpm，培养温度控制在30℃，培养时间为24h。发酵结束后菌体数量≥1×109CFU/mL。发酵完成后，无菌条件下收集培养液直接用包装瓶分装成液体剂型。
S3、收集发酵液，经冷冻真空干燥，利用去离子水回调体积至原体积的1/20；得到含菌发酵液。
S4、含菌发酵液4000g离心10min并收集DL-DNH02菌体沉淀物和发酵液上清；发酵液上清经冷冻真空干燥，利用去离子水回调体积至原体积的1/20；
S5、用稀释剂PBS缓冲液稀释菌体沉淀物得到菌株DL-DNH02菌体悬液，浓度20OD；
S6、取适量壳聚糖溶解在100mL质量分数为1.0％的醋酸溶液中，然后加入终浓度1.0％的CaCl2，搅拌溶解，得到壳聚糖氯化钙混合溶液；
S7、配制2.5％质量浓度的海藻酸钠溶液，将所制得的DL-DNH02菌体悬液按1：1体积比例溶于其中；
S8、取10mL上述溶有DL-DNH02菌体悬液的海藻酸钠溶液，用带8号针头的10mL注射器缓慢滴加至壳聚糖氯化钙溶液中，边滴加边搅拌，滴加结束后，继续搅拌0.5h，过滤、洗涤，收集产生的菌体悬液微胶囊，命名为EC降解剂3。
实施例8：
一种DL-DNH02菌株EC降解制剂的制备，具体步骤如下：
S1、将菌株接种于LB液体培养基中进行活化，在28℃、180rpm恒温振荡培养24h。
S2、将活化后的菌株培养液接10％接种量接种于营养肉汤培养基(每升发酵培养基含有蛋白胨5g、牛肉膏3g、氯化钠5g，去离子水补足1000mL，pH7.0) 进行培养，在30℃、180rpm恒温振荡培养24h。获得的即为种子液。将种子液按1:10比例接种于装有发酵培养基(每升发酵培养基含有蛋白胨5g、牛肉膏3g、氯化钠5g，去离子水补足1000mL，pH7.0)的生产发酵罐(装液量70％)，通气量1.0m3/min，搅拌速率为180rpm，培养温度控制在30℃，培养时间为24h。发酵结束后菌体数量≥1×109CFU/mL。发酵完成后，无菌条件下收集培养液直接用包装瓶分装成液体剂型。
S3、收集发酵液，经冷冻真空干燥，利用去离子水回调体积至原体积的1/20；得到含菌发酵液。
S4、含菌发酵液4000g离心10min并收集DL-DNH02菌体沉淀物和发酵液上清；发酵液上清经冷冻真空干燥，利用去离子水回调体积至原体积的1/20；
S5、用稀释剂PBS缓冲液稀释菌体沉淀物得到菌株DL-DNH02菌体悬液，浓度20OD；
S6、菌株DL-DNH02菌体悬液经过细胞破壁得到DL-DNH02细胞裂解液；
S7、取适量壳聚糖溶解在100mL质量分数为1.0％的醋酸溶液中，然后加入终浓度1.0％的CaCl2，搅拌溶解，得到壳聚糖氯化钙混合溶液；
S8、配制2.5％质量浓度的海藻酸钠溶液，将所制得的DL-DNH02细胞裂解液按1：1体积比例溶于其中；
S9、取10mL上述溶有DL-DNH02细胞裂解液的海藻酸钠溶液，用带8号针头的10mL注射器缓慢滴加至壳聚糖氯化钙溶液中，边滴加边搅拌，滴加结束后，继续搅拌0.5h，过滤、洗涤，收集产生的细胞裂解液微胶囊，命名为EC 降解剂4。
实施例9：
DL-DNH02菌株对发酵食品中添加EC的降解实验，具体步骤如下：
(1)制备白酒EC反应液并降解其中的EC：白酒(45度)60mL，EC：2.6ppm， DL-DNH02菌体：10OD，在250mL锥形瓶中温育，30℃，100rpm，5天。反应后，将白酒EC反应液进行离心，4℃，10000×g离心10分钟，去除菌体，清液进行膜过滤0.45μm)后，通过气相色谱-质谱法分析EC浓度：
在400μL反应液中添加100μL 1N的HCl和600μL氯仿后，充分混合。4℃离心12000×g，10分钟，将氯仿层回收到小瓶作为GC分析样品，检测EC含量。
(2)制备红酒EC反应液并降解其中的EC：红酒(12度)60mL，EC：2.6ppm，DL-DNH02菌体：10OD，在250mL锥形瓶中温育，30℃，100rpm，5天。反应后，将红酒EC反应液进行离心，4℃，10000×g，10分钟，去除菌体，清液进行膜过滤(0.45μm)后，通过气相色谱-质谱法分析EC浓度：
在400μL反应液中添加100μL 1N的HCl和600μL氯仿后，充分混合。4℃离心12000×g，10分钟，将氯仿层回收到小瓶作为GC-MS分析样品，检测EC 含量。
(3)制备黄酒EC反应液并降解其中的EC：黄酒(15度)60mL，EC：2.6ppm， DL-DNH02菌体：10OD，在250mL锥形瓶中温育，30℃，100rpm，5天。反应后，将黄酒EC反应液进行离心，4℃，10000×g条件下离心10分钟，清液进行膜过滤(0.45μm)后，通过气相色谱-质谱法分析EC浓度：
在400μL反应液中添加100μL 1N的HCl和600μL氯仿后，充分混合。4℃ 12000×g条件下离心10分钟，将氯仿层回收到小瓶作为GC-MS分析样品，检测EC含量。
(4)制备酸奶EC反应液并降解其中的EC：酸奶60mL，EC：2.6ppm， DL-DNH02菌体：10OD，在30℃，100rpm条件下放入250mL锥形瓶中温育5天。反应后，将酸奶EC反应液进行离心，4℃，10000×g离心10分钟，清液进行膜过滤(0.45μm)后，通过气相色谱-质谱法分析EC浓度：
在400μL反应液中添加100μL 1N的HCl和600μL氯仿后，充分混合。4℃ 12000×g离心10分钟，将氯仿层回收到小瓶作为GC-MS分析样品，检测EC含量。
(5)制备醋EC反应液并降解其中的EC：陈醋60mL，EC：2.6ppm，DL-DNH02 菌体：10OD，在250mL锥形瓶中温育，30℃，100rpm，5天。反应后，将醋 EC反应液进行离心，4℃，10000×g离心10分钟，清液进行膜过滤(0.45μm)后，通过气相色谱-质谱法分析EC浓度：
在400μL反应液中添加100μL 1N的HCl和600μL氯仿充分混合。4℃ 12000×g离心10分钟，将氯仿层回收作为GC-MS分析样品，检测EC含量。
(6)制备酱油EC反应液并降解其中的EC：酱油60mL，EC：2.6ppm， DL-DNH02菌体：10OD，在250mL锥形瓶中温育，30℃，100rpm，5天。反应后，将酱油EC反应液进行离心，4℃，10000×g离心10分钟，清液进行膜过滤(0.45μm)后，通过气相色谱-质谱法分析EC浓度：
在400μL反应液中添加100μL 1N的HCl和600μL氯仿后，充分混合。4℃ 12000×g离心10分钟，将氯仿层回收到小瓶作为GC-MS分析样品，检测EC。
(7)制备豆瓣酱EC反应液并降解其中的EC：豆瓣酱50mL，去离子水10ml， EC：2.6ppm，DL-DNH02菌体：10OD，在250mL锥形瓶中温育，30℃，100 rpm，5天。反应后，将豆瓣酱EC反应液进行离心，4℃，10000×g离心10分钟，清液进行膜过滤(0.45μm)后，通过气相色谱-质谱法分析EC浓度：
在400μL反应液中添加100μL 1N的HCl和600μL氯仿后，充分混合。4℃ 12000×g离心10分钟，将氯仿层回收到小瓶作为GC-MS分析样品，检测EC含量，结果见表1。
实例9的GC-MS分析条件如下：
使用气相色谱(GC7700，Agilent)，在以下的条件下进行分析。
柱：DB-WAX(60m×0.25mm×0.25um)(Agilent J&W)
注射器：250℃
检测器：FID,250℃
烘箱：100℃(0min)→以10℃/min升温→在250℃保持5min
流速：2.0mL/min
注入量：5μL
表1反应5天后EC浓度
Figure RE-GDA0003115056740000151
如表1所示，加入DL-DNH02菌株反应5天后的最低降解率为53.8％，而最高降解率达到了69.2％，表明DL-DNH02菌株在发酵食品中对EC有良好的降解作用。
实施例10
DL-DNH02菌株EC降解制剂对发酵食品中添加EC的降解实验，具体内容如下：
(1)制备白酒EC反应液并降解其中的EC:白酒(45度)60mL，EC：2.6ppm， EC降解剂1:20mL，在250mL锥形瓶中温育，30℃，100rpm，5天。反应后，将白酒EC反应液进行离心，4℃，8000×g离心10分钟，去除EC降解制剂后进行膜过滤(0.45μm)，通过气相色谱-质谱法分析EC浓度：
在400μL反应液中添加100μL 1N的HCl和600μL氯仿后充分混合。4℃ 12000×g条件下离心10分钟，将氯仿层回收到小瓶作为GC分析样品，检测EC 含量。
(2)制备红酒EC反应液并降解其中的EC：红酒(12度)60mL，EC：2.6ppm， EC降解剂2：20mL，在250mL锥形瓶中温育，30℃，100rpm，5天。反应后，将红酒EC反应液进行离心，4℃，8000×g离心10分钟，去除EC降解制剂后进行膜过滤(0.45μm)，通过气相色谱-质谱法分析EC浓度：
在400μL反应液中添加100μL 1N HCl和600μL氯仿后，充分混合。4℃、 12000×g条件下离心10分钟，将氯仿层回收到小瓶作为GC-MS分析样品，检测EC含量。
(3)制备黄酒EC反应液并降解其中的EC：黄酒(15度)60mL，EC：2.6ppm， EC降解剂3：20mL，在250mL锥形瓶中温育，30℃，100rpm，5天。反应后，将黄酒EC反应液进行离心，4℃，10000×g离心10分钟，去除EC降解制剂后进行膜过滤(0.45μm)，通过气相色谱-质谱法分析EC浓度：
在400μL反应液中添加100μL 1N的HCl和600μL氯仿后，充分混合。4℃ 12000×g条件下离心10分钟，将氯仿层回收到小瓶作为GC-MS分析样品，检测EC含量。
(4)制备酸奶EC反应液并降解其中的EC：酸奶60mL，EC：2.6ppm，EC 降解剂4：20mL，在250mL锥形瓶中温育，30℃，100rpm，5天。反应后，将酸奶EC反应液进行离心，4℃，10000×g离心10分钟，去除EC降解制剂后进行膜过滤(0.45μm)，通过气相色谱-质谱法分析EC浓度：
在400μL反应液中添加100μL 1N的HCl和600μL氯仿后，充分混合。4℃、 12000×g条件下离心10分钟，将氯仿层回收到小瓶作为GC-MS分析样品，检测EC含量。
(5)制备醋EC反应液并降解其中的EC：陈醋60mL，EC：2.6ppm，EC降解剂1：20mL，在250mL锥形瓶中温育，30℃，100rpm，5天。反应后，将醋EC反应液进行离心，4℃，10000×g离心10分钟，去除EC降解剂后进行膜过滤(0.45μm)，通过气相色谱-质谱法分析EC浓度：
在400μL反应液中添加100μL 1N的HCl和600μL氯仿后，充分混合。4℃、 12000×g条件下离心10分钟，将氯仿层回收到小瓶作为GC-MS分析样品，检测EC含量。
(6)制备酱油EC反应液并降解其中的EC：酱油60mL，EC：2.6ppm，EC 降解剂1：20mL，在250mL锥形瓶中温育，30℃，100rpm，5天。反应后，将酱油EC反应液进行离心，4℃，10000×g离心10分钟，去除EC降解剂后进行膜过滤(0.45μm)，通过气相色谱-质谱法分析EC浓度：
在400μL反应液中添加100μL 1N的HCl和600μL氯仿后，充分混合。4℃、 12000×g条件下离心10分钟，将氯仿层回收到小瓶作为GC-MS分析样品，检测EC含量。
(7)制备豆瓣酱EC反应液并降解其中的EC：豆瓣酱50mL，去离子水10ml， EC：2.6ppm，EC降解剂2：20mL，在250mL锥形瓶中温育，30℃，100rpm， 5天。反应后，将豆瓣酱EC反应液进行离心，4℃，10000×g离心10分钟，去除EC降解剂后进行膜过滤(0.45μm)，通过气相色谱-质谱法分析EC浓度：
在400μL反应液中添加100μL 1N的HCl和600μL氯仿后，充分混合。4℃、 12000×g条件下离心10分钟，将氯仿层回收到小瓶作为GC-MS分析样品，检测EC含量。
实施例10的GC-MS分析条件如下：
使用气相色谱(GC7700，Agilent)，在以下的条件下进行分析。
柱：DB-WAX(60m×0.25mm×0.25um)(Agilent J&W)
注射器：250℃
检测器：FID,250℃
烘箱：100℃(0min)→以10℃/min升温→在250℃保持5min
流速：2.0mL/min
注入量：5μL
表2反应5天后EC浓度
Figure RE-GDA0003115056740000171
如表2所示，加入EC降解剂反应5天后的最低降解率为65.4％，而最高降解率达到了80.8％，表明DL-DNH02菌株制成的EC降解剂均在发酵食品中对 EC有很好的降解作用。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一株高效降解氨基甲酸乙酯的根瘤土壤杆菌，其特征在于，菌株DL-DNH02保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号：CGMCC No.21309。
2.一种权利要求1所述菌株DL-DNH02在降解氨基甲酸乙酯中的应用。
3.根据权利要求2所述菌株DL-DNH02在降解氨基甲酸乙酯中的应用，其特征在于，所述菌株DL-DNH02在降解氨基甲酸乙酯中的应用还包括在发酵食品中降解氨基甲酸乙酯。
4.根据权利要求3所述菌株DL-DNH02在降解氨基甲酸乙酯中的应用，其特征在于，所述在发酵食品中降解氨基甲酸乙酯的应用包括在白酒中降解氨基甲酸乙酯；所述在白酒中降解氨基甲酸乙酯的过程包括将所述菌株DL-DNH02接种至白酒中，以30℃、100rpm的条件温育5天降解白酒中的氨基甲酸乙酯。
5.根据权利要求2所述菌株DL-DNH02在降解氨基甲酸乙酯中的应用，其特征在于，所述菌株DL-DNH02在降解氨基甲酸乙酯中的应用还包括所述菌株DL-DNH02的发酵产物在降解氨基甲酸乙酯中的应用，所述发酵产物包括所述菌株DL-DNH02的含菌发酵液、发酵液上清、菌体悬浮液和细胞裂解液。
6.一种氨基甲酸乙酯降解剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将活化后的菌株DL-DNH02培养液以10％接种量接种于营养肉汤培养基进行培养，在30℃、180rpm恒温振荡培养24h，获得种子液；
S2、将S1步骤所述种子液按1:10比例接种于装有发酵培养基的生产发酵罐，通气量0.6m3/min，搅拌速率180rpm，30℃条件下培养48h；发酵结束后获得菌体数量≥1.0×109CFU/mL的发酵液；
S3、含菌发酵液微胶囊的制备：收集S2步骤所述发酵液，经冷冻真空干燥后，利用去离子水回调体积至原体积的1/20，制得所述DL-DNH02含菌发酵液，经海藻酸钠包埋后制成所述含菌发酵液微胶囊；
S4、发酵液上清微胶囊的制备：离心S3所述DL-DNH02含菌发酵液并收集DL-DNH02菌体沉淀物和DL-DNH02发酵液上清；所述DL-DNH02发酵液上清经冷冻真空干燥，利用去离子水回调体积至其原体积的1/20，得到所述DL-DNH02发酵液上清，经海藻酸钠包埋后制成所述发酵液上清微胶囊；
S5、菌体悬浮液微胶囊的制备：稀释S4步骤所述DL-DNH02菌体沉淀物，得到浓度20OD的所述DL-DNH02菌体悬浮液，经海藻酸钠包埋后制成所述菌体悬浮液微胶囊；
S6、细胞裂解液微胶囊的制备：取S5步骤所述菌株DL-DNH02菌体悬液经过细胞破壁得到所述DL-DNH02细胞裂解液，经海藻酸钠包埋后制成所述细胞裂解液微胶囊。
7.根据权利要求6所述的氨基甲酸乙酯降解剂的制备方法，其特征在于，所述含菌发酵液微胶囊、发酵液上清微胶囊、菌体悬浮液微胶囊、细胞裂解液微胶囊的制作步骤如下：
S1、取壳聚糖溶解在100mL质量分数为1.0％的醋酸溶液中，然后加入终浓度1.0％的CaCl2，搅拌溶解，得到壳聚糖氯化钙混合溶液；
S2、配制2.5％质量浓度的海藻酸钠溶液，将所述DL-DNH02含菌发酵液按1：1体积比例溶于其中；滴加至所述壳聚糖氯化钙混合溶液中，边滴加边搅拌，滴加结束后，继续搅拌0.5h，过滤、洗涤，收集含菌发酵液微胶囊；
S3、配制2.5％质量浓度的海藻酸钠溶液，将所述DL-DNH02发酵液上清按1：1体积比例溶于其中；滴加至所述壳聚糖氯化钙混合溶液中，边滴加边搅拌，滴加结束后，继续搅拌0.5h，过滤、洗涤，收集发酵液上清微胶囊；
S4、配制2.5％质量浓度的海藻酸钠溶液，将所述DL-DNH02菌体悬液按1：1体积比例溶于其中；滴加至所述壳聚糖氯化钙混合溶液中，边滴加边搅拌，滴加结束后，继续搅拌0.5h，过滤、洗涤，收集菌体悬浮液微胶囊；
S5、配制2.5％质量浓度的海藻酸钠溶液，将所述DL-DNH02细胞裂解液按1：1体积比例溶于其中；滴加至所述壳聚糖氯化钙混合溶液中，边滴加边搅拌，滴加结束后，继续搅拌0.5h，过滤、洗涤，收集细胞裂解液微胶囊。
8.一种权利要求6或7所述氨基甲酸乙酯降解剂降解发酵食品中氨基甲酸乙酯的方法，其特征在于，所述发酵食品中降解氨基甲酸乙酯的过程包括将氨基甲酸乙酯降解剂接种至发酵食品中，以30℃、100rpm的条件温育5天降解发酵食品中的氨基甲酸乙酯。
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