CN113637605B - 一种解淀粉芽孢杆菌及其在制备1-脱氧野尻霉素中的应用 - Google Patents

一种解淀粉芽孢杆菌及其在制备1-脱氧野尻霉素中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)HDCC00252，保藏编号为CGMCC No.22781；同时公开了通过发酵培养解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)HDCC00252生产1‑脱氧野尻霉素的方法，效价可达到在5.31g/L以上，且发酵周期短，有利于实现工业化生产。

Description

一种解淀粉芽孢杆菌及其在制备1-脱氧野尻霉素中的应用
技术领域
本发明属于工业生物技术领域，具体涉及一株能够生产1-脱氧野尻霉素的解淀粉芽孢杆菌，以及利用该菌种发酵生产1-脱氧野尻霉素的方法及应用。
背景技术
1-脱氧野尻霉素(1-Deoxynojirimycin,DNJ)是一种哌啶生物碱，化学名称为3,4,5-三羟基-2-羟甲基四氢吡啶，是一种存在于植物、微生物及蚕体中的天然糖类似物，自然界以桑树中含量最高，为强效的糖代谢酶抑制剂(比如α－葡萄糖苷酶、己糖激酶、葡萄糖醛酸酶和糖原磷酸酶等)，可显著延缓多糖的降解过程，降低餐后血糖的峰值，稳定空腹血糖。并且，还有减肥及增加胰岛敏感性、抗病毒、抗肿瘤转移等作用，在医药和保健品有广泛的应用。此外，DNJ也可用于食品领域，以桑叶为原料的食品，作为功能性降糖的产品在日本等东亚国家已经允许在市场上销售，显示出DNJ在保健食品领域的广阔前景。
目前，医药上所用的DNJ基本上都是从桑叶提取的，一方面天然产物中DNJ含量较低，另一方面，DNJ的分离纯化较为复杂，再加上提取过程中的损失，产量很低。而人工DNJ合成难度较大，成本高，不适于大规模的生产。目前，国内外报道可以产生DNJ的微生物有淡紫色链霉菌(Streptomyces lavendulae)、紫红曲霉(Monascus purpureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。其中，Yohji Ezure 等人(1985)突变获得淡紫色链霉菌DNJ产量最高，可以达到4～5g/L，但是该菌种为丝状菌，发酵过程动力消耗大，发酵周期长。CN105296565A公开了使用枯草芽孢杆菌固态发酵得到DNJ纯度较低。顾澄琛(2016)报道的紫红曲霉DNJ的发酵水平为0.0279g/L。 KR1020190041680报道的大肠杆菌DNJ的发酵水平为0.264g/L。Kenji Yamagishi等人(2016)以及CN201810125101.X报道了一株产DNJ的解淀粉芽孢杆菌，其水平约为1.1g/L。综上，现有技术所报道的可以产1-脱氧野尻霉素的微生物，其普遍存在1-脱氧野尻霉素产量低、发酵时间长等缺点。因此，筛选高产1-脱氧野尻霉素的菌株具有重要意义。
发明内容
为解决现有技术存在的不足，本发明的目的之一在于提供了一株高产1-脱氧野尻霉素的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) HDCC00252，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.22781，保藏日期为2021 年06月25日。
本发明所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) HDCC00252是以解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)HDCC00031为出发菌株，通过NTG诱变、ARTP- 紫外复合诱变筛选得到。
本发明的另一目的在于提供了所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)HDCC00252或其发酵液在制备1-脱氧野尻霉素中的应用。
本发明的再一目的在于提供了一种1-脱氧野尻霉素的制备方法，所述的方法采用权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)进行发酵制备。
具体的，所述的发酵过程包括在含有可同化的碳源和/或氮源的发酵培养基里，进行有氧发酵。
作为一种实施方式，所述的碳源选自葡萄糖、甘油、蔗糖、果糖、乳糖、麦芽糖、糊精、淀粉、甘露醇、山梨醇；优选为葡萄糖、蔗糖、乳糖或其任一组合；
作为一种实施方式，所述的氮源选自玉米浆(粉)、酵母膏、酵母浸出粉、酵母蛋白胨、大豆蛋白胨、牛骨蛋白胨、肉胨、鱼粉蛋白胨、硝酸盐、铵盐；优选为酵母浸出粉、硝酸盐、铵盐或其任意几种的组合。
作为一种实施方式，所述的发酵培养基还包括无机盐，优选为硫酸盐、磷酸盐、亚铁盐，更优选为硫酸铵、磷酸氢二钾、硫酸亚铁铵。
作为一种实施方式，所述的发酵培养基含有葡萄糖0.1～2％，蔗糖0.5～4％，乳糖0.5～10％，酵母浸出粉2～5％，硫酸铵0～4％，硝酸钠0～3％，硫酸亚铁铵0.1～0.8％，磷酸氢二钾0.2～0.6％。
作为一种实施方式，所述发酵温度为28-40℃，所述培养基pH 为5.0-9.0；培养时间为12-100小时。
作为一种实施方式，所述解淀粉芽孢杆菌是通过种子液接种至所述发酵培养基中进行发酵培养的；
其中，所述种子液是将解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)HDCC00252在种子培养基里进行种子培养得到的。
所述种子培养的条件为：种子培养的温度为28-40℃，所述培养基pH为5.0-9.0；培养时间为4-24小时；
所述的种子培养基含葡萄糖0.2～4％，酵母浸出粉0.2～1％，氯化钠0.2～2％，蛋白胨0.2～4％。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) HDCC00252生产能力高，其产1-脱氧野尻霉素的能力比现有技术中其他菌种有了大幅度的提高，1-脱氧野尻霉素的效价可达到在5.31g/L。且发酵周期短，有利于实现工业化生产。
附图说明
图1为出发菌株发酵液的HPLC图谱；
图2为出发菌株发酵液的LCMS图谱；
图3为出发菌株菌落形态图；
图4为出发菌株镜检图。
具体实施方式
下述实施例中采用的材料、试剂等如无特殊说明，皆为普通市售品，皆可于市场购得。
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明，应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例1出发菌株来源
从浙江桐乡市西牛桥村桑树根系土壤样品中分离到了产DNJ的原始菌种。
采集浙江桐乡市西牛桥村不同地点桑树根际3～10cm深层土壤样品20g，装入无菌样品袋，编号并记录取样地点、日期。所有土样分别过60目筛网，每个土样各取1g加入到带有玻璃珠的无菌生理盐水中，充分振荡后于80℃水浴40min，静置10min后取上清液进行梯度稀释，取10-2～10-6梯度稀释液0.1mL分别接种涂布到营养琼脂培养基上，37℃倒置培养2～5天，每天观察。挑选白色产襥的菌落，经两轮划线传代纯化后作为待选菌株，取待选菌株斜面，用不锈钢铲刮取少量菌苔，接种到液体初筛培养基中并搅散，置于37℃摇床上220rpm振荡培养5天，获得初筛发酵液。取发酵液1ml，10000rpm 高速离心10min，去除菌体，上清液保存于2～8℃冰箱中待检。(液体初筛培养基配方组成为：乳糖2.5％，硫酸铵0.4％，消毒前调pH至 7.5，消毒条件为121～123℃、30min。)
以纯水当作参比对照，连同每个样品取上清液0.1mL与0.8mL 水及0.1mL蔗糖酶震荡均匀后加入2mL 10％的蔗糖溶液，放入25℃水浴反应1h。反应后各取0.6m L反应液加入1mLDNS试剂，沸水浴5min，冷水冷却至室温，加8.4mL水稀释至10mL，混匀后各吸取 1ml加入到96孔UV板，在520nm波长下测吸光值，如果样品管吸光值低于参比管吸光值，则可认为该发酵液中存在蔗糖酶抑制剂，且抑制剂相对含量可以用吸光值来进行表征。
挑选吸光值远低于参比的样品上清液2ml，加入等体积乙醇混匀后10000rpm高速离心10min。取上清液20μL置于1.5mL的离心管中，加入0.4mol/L的硼酸盐缓冲液(pH＝8.5)20μL及2mmol/L的 FMOC-Cl的乙腈溶液40μL，振荡混匀，于25℃水浴中反应20min，加入1mol/L的甘氨酸20μL，静置5min，让多余的衍生化试剂反应完。最后加入1.5mL 0.1％(V/V)的醋酸水溶液，经0.45μm微孔滤膜滤过后进行液相色谱分析，查找与DNJ标准品有相同保留时间的样品，最后用LCMS进行分子量测定，以确定是否为DNJ。
实验结果：本实验共分离1164株菌落，成功从编号为25#的浙江桐乡市西牛桥村桑树根系土壤样品中，分离得到了47株产DNJ的菌株，该47株菌株再次经过两轮划线分离纯化后，进行发酵验证， DNJ的含量最高为0.12g/L，其HPLC图谱和LCMS图谱如图1和图 2所示，挑出该单株编号为HDCC00031。
实施例2DNJ原始生产菌种(HDCC00031)形态学检查及生理生化试验
在营养琼脂平板上划线接种菌株(HDCC00031)，置于37℃培养，记录菌落形态及颜色等特征，革兰氏染色后光学显微镜观察。生理生化特征，分别对目的菌株进行葡萄糖发酵实验、淀粉水解、V-P测定、吲哚试验、明胶水解、过氧化氢酶试验、硝酸盐还原试验、产气实验、厌氧琼脂实验。
形态特征：菌落不规则圆形或椭圆，白色，表面粗糙，有隆起。菌落形态如图3所示，镜检照片如图4所示。
生理生化特征：详见表1～表4。
表1原始菌株(HDCC00031)的碳源和氮源利用情况
Figure BDA0003202162730000071
表2原始菌株(HDCC00031)主要的生理生化特征
试验项目 结果 试验项目 结果
明胶液化 + 牛奶胨化 +
淀粉水解 ++ 硝酸盐还原 -
精氨酸水解 - 吲哚 -
氧化酶 + V.P实验 -
过氧化氢酶 + M.R实验 -
β-半乳糖苷酶 + / / 
表3原始菌株(HDCC00031)生长pH试验
pH 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0
生长情况 0 0 1 2 3 4 4 4 
表4原始菌株(HDCC00031)生长温度试验
温度(℃) 10 20 25 28 37 45
生长情况 0 0 2 3 4 0 
*注：0，无生长；1，生长很弱；2，能生长；3，生长良好；4，生长最好；+，阳性；-，阴性；w，弱。
实施例3DNJ原始生产菌种(HDCC00031)16S rDNA鉴定
取原始菌种(HDCC00031)斜面，收集新鲜菌苔，采用上海生工的 SK8255试剂盒提取DNA基因组，采用通用引物(27F和1492R)进行 16S rRNA基因扩增，PCR产物经检测纯化后，直接进行序列测定，测序由浙江工业大学生物工程研究所进行。菌株(HDCC00031)所测的 16S rDNA序列(SEQ ID NO:1)经校对后与GenBank数据库中相关种、属的序列进行同源序列BLAST比较，如表5所示(表中只列出同源性较高的模式菌株)，发现该菌株和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciensstrain.)分类相关参数非常接近，故将菌株HDCC00031鉴定为伯克霍尔德菌属(Bacillusamyloliquefaciensstrain.) 菌株。
表5菌株(HDCC00031)和典型模式菌株的同源性
Figure BDA0003202162730000081
Figure BDA0003202162730000091
实施例4DNJ高产菌种(HDCC00252)诱变筛选
1.NTG诱变筛选
以原始菌种(HDCC00031)为出发菌株，收集其新鲜菌苔，用无菌生理盐水洗下，加玻璃珠振荡打散，获得菌悬液。菌悬液与500μg/ml 的NTG母液1：1(v/v)混合，置于30℃摇床上诱变处理30min， 14000rpm高速离心，用生理盐水重悬，如此反复洗涤3次后梯度稀释，涂布到营养琼脂平板上，置于37℃培养24h，用不锈钢铲刮取少量菌体，接种到液体初筛培养基中并搅散，置于37℃摇床上220rpm 振荡培养5天，获得初筛发酵液。取发酵液1ml，加入等体积乙醇混匀后超声处理20min，混匀，14000rpm高速离心10min。再取上清液 20μL置于1.5mL的离心管中，加入0.4mol/L的硼酸盐缓冲液 (pH＝8.5)20μL及2mmol/L的FMOC-Cl的乙腈溶液40μL，振荡混匀，于25℃水浴中反应20min，加入1mol/L的甘氨酸20μL，静置 5min，让多余的衍生化试剂反应完。最后加入1.5mL 0.1％(V/V)的醋酸水溶液，经0.45μm微孔滤膜滤过后进行液相色谱分析，挑选效价高于对照100％以上的菌株进行复筛，确定生产能力稳定可重复的菌株作为继续诱变筛选的出发菌株。(液体初筛培养基配方组成为：乳糖2.5％，硫酸铵0.4％，消毒前调pH至7.5，消毒条件为121～123℃、 30min。)
2.ARTP-紫外复合诱变筛选
取NTG诱变筛选获得的高产菌株作为出发菌株，收集其新鲜菌苔，用无菌生理盐水洗下，加玻璃珠振荡打散，离心收集菌体，加入少量无菌生理盐水重悬，获得浓缩菌悬液。取浓缩菌悬液10μL，涂于ARTP(ARTP-IIS)载片表面，放入到处理仓，设定功率100W，气体流量10SLM，照射时长8S。将载片取下，放入到1ml无菌生理盐水中，振荡将菌体洗下，然后进行梯度稀释至10-1～10-4，每个梯度稀释液0.1ml涂布到营养琼脂平板上。将接种好的平板，置于15W紫外灯下方约30cm处，打开平皿盖，开启紫外灯进行紫外诱变处理，处理时长10S，盖上平皿盖，包裹好置于37℃培养24h。用不锈钢铲刮取少量菌体，接种到液体初筛培养基中并搅散，置于37℃摇床上 220rpm振荡培养5天，获得初筛发酵液。取发酵液1ml，加入等体积乙醇混匀后超声处理20min，混匀，14000rpm高速离心10min。再取上清液20μL置于1.5mL的离心管中，加入0.4mol/L的硼酸盐缓冲液(pH＝8.5)20μL及2mmol/L的FMOC-Cl的乙腈溶液40μL，振荡混匀，于25℃水浴中反应20min，加入1mol/L的甘氨酸20μL，静置5min，让多余的衍生化试剂反应完。最后加入1.5mL 0.1％(V/V) 的醋酸水溶液，经0.45μm微孔滤膜滤过后进行液相色谱分析。(液体初筛培养基配方组成为：乳糖2.5％，硫酸铵0.4％，消毒前调pH 至7.5，消毒条件为121～123℃、30min。)
挑选出DNJ含量最高的菌株，经连续三轮划线分离纯化后进行保藏，保藏编号为HDCC00252。(该菌种之后于2021年06月25 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22781)。
实施例5原始菌种发酵制备1-脱氧野尻霉素
(1)菌种复苏活化：取原始菌种HDCC00031，在室温下解冻，吸取0.1ml菌悬液接种到LB固体平板，涂布均匀，置于37℃培养箱内培养24h，得到活化复苏的菌苔。
(2)液体种子制备：取活化复苏的菌苔，用接种环刮取一环，接种到盛有100ml液体种子培养基的500ml三角瓶中，包扎好置于 37℃、220rpm的摇床上振荡培养16h，控制种子液OD值≥5.0。
液体种子培养基组成为：葡萄糖1.5％，酵母浸出粉0.5％，蛋白胨1％，氯化钠1％。消毒前调pH至7.0，消毒条件为121～123℃、 30min。
(3)发酵培养：取培养合格的液体种子，以4％(V/W)的比例接种到装有30ml优化液体发酵培养基的250ml三角瓶中，包扎好置于 37℃、220rpm的摇床上振荡培养4天结束。
液体发酵培养基配方组成为：葡萄糖0.4％，蔗糖2％，乳糖2％，酵母浸出粉3％，硫酸铵0.1％，硝酸钠0.05％，硫酸亚铁铵0.25％，磷酸氢二钾0.28％。消毒前调pH至8.0，消毒条件为121～123℃、30min。
(4)样品处理：发酵结束后，取发酵液2ml，10000rpm高速离心10min去除菌体，然后取上清液，加入等体积乙醇混匀后10000rpm 高速离心10min。取上清液20μL置于1.5mL的离心管中，加入0.4mol /L的硼酸盐缓冲液(pH＝8.5)20μL及2mmol/L的FMOC-Cl的乙腈溶液40μL，振荡混匀，于25℃水浴中反应20min，加入1mol/L的甘氨酸20μL，静置5min，让多余的衍生化试剂反应完。最后加入1.5mL 0.1％(V/V)的醋酸水溶液，经0.45μm微孔滤膜滤过后进行液相色谱分析。
(5)液相分析方法：
色谱柱：Kromasil C18分析柱(4.6mm×250mm，5μm)
流动相：乙腈-0.1％冰醋酸(50:50，V/V)
流速：1.0mL/min
柱温：30℃
检测条件：荧光检测器，激发波长254nm，发射波长322nm
进样体积：10μL
(6)实验结果：
以已知浓度DNJ对照品采用同样方法衍生处理的样品作为标准，根据标准浓度、峰面积、样品峰面积进行计算得到样品浓度，结果确认该实施方案所得发酵液中DNJ含量为0.12g/L。
实施例6 1-脱氧野尻霉素高效制备
(1)菌种复苏活化：取菌种HDCC00252，在室温下解冻，吸取0.1ml菌悬液接种到LB固体平板，涂布均匀，置于37℃培养箱内培养24h，得到活化复苏的菌苔。
(2)液体种子制备：取活化复苏的菌苔，用接种环刮取一环，接种到盛有100ml液体种子培养基的500ml三角瓶中，包扎好置于 37℃、220rpm的摇床上振荡培养16h，控制种子液OD值≥5.0。
液体种子培养基组成为：葡萄糖1.5％，酵母浸出粉0.5％，蛋白胨1％，氯化钠1％。消毒前调pH至7.0，消毒条件为121～123℃、 30min。
(3)发酵培养：取培养合格的液体种子，以4％(V/W)的比例接种到装有30ml优化液体发酵培养基的250ml三角瓶中，包扎好置于 37℃、220rpm的摇床上振荡培养4天结束。
液体发酵培养基配方组成为：葡萄糖0.4％，蔗糖2％，乳糖2％，酵母浸出粉3％，硫酸铵0.1％，硝酸钠0.05％，硫酸亚铁铵0.25％，磷酸氢二钾0.28％。消毒前调pH至8.0，消毒条件为121～123℃、 30min。
(4)样品处理：发酵结束后，取发酵液2ml，10000rpm高速离心10min去除菌体，然后取上清液，加入等体积乙醇混匀后10000rpm 高速离心10min。取上清液20μL置于1.5mL的离心管中，加入0.4mol /L的硼酸盐缓冲液(pH＝8.5)20μL及2mmol/L的FMOC-Cl的乙腈溶液40μL，振荡混匀，于25℃水浴中反应20min，加入1mol/L的甘氨酸20μL，静置5min，让多余的衍生化试剂反应完。最后加入1.5mL 0.1％(V/V)的醋酸水溶液，经0.45μm微孔滤膜滤过后进行液相色谱分析。
(5)液相分析方法：
色谱柱：Kromasil C18分析柱(4.6mm×250mm，5μm)
流动相：乙腈-0.1％冰醋酸(50:50，V/V)
流速：1.0mL/min
柱温：30℃
检测条件：荧光检测器，激发波长254nm，发射波长322nm
进样体积：10μL
(6)实验结果：
以已知浓度DNJ对照品采用同样方法衍生处理的样品作为标准，根据标准浓度、峰面积、样品峰面积进行计算得到样品浓度，结果确认该实施方案所得发酵液中DNJ含量为5.31g/L，相对于原始菌株提升了44倍。
为了评估该菌种遗传稳定性，采用相同的条件，连续进行4轮分离菌落鉴定，每一代的摇瓶发酵水平汇总如下表6所示。结果表明该菌种连续传代4代仍遗传稳定。
表6 CGMCC NO.22781菌株遗传稳定性
代时 F1 F2 F3 F4
鉴定效价 5.12g/L 5.29g/L 5.08g/L 5.20g/L 
实施例7 1-脱氧野尻霉素发酵制备
(1)菌种复苏活化：取菌种HDCC00252，在室温下解冻，吸取 0.1ml菌悬液接种到LB固体平板，涂布均匀，置于37℃培养箱内培养24h，得到活化复苏的菌苔。
(2)液体种子制备：取活化复苏的菌苔，用接种环刮取一环，接种到盛有100ml液体种子培养基的500ml三角瓶中，包扎好置于 28℃、220rpm的摇床上振荡培养24h，控制种子液OD值≥5.0。
液体种子培养基组成为：葡萄糖4％，酵母浸出粉1％，蛋白胨 4％，氯化钠2％。消毒前调pH至5.0，消毒条件为121～123℃、30min。
(3)发酵培养：取培养合格的液体种子，以4％(V/W)的比例接种到装有30ml优化液体发酵培养基的250ml三角瓶中，包扎好置于 28℃、220rpm的摇床上振荡培养4天结束。
液体发酵培养基配方组成为：葡萄糖0.1％，蔗糖0.5％，乳糖10％，酵母浸出粉5％，硫酸铵4％，硫酸亚铁铵0.1％，磷酸氢二钾0.6％。消毒前调pH至9.0，消毒条件为121～123℃、30min。
(4)样品处理：发酵结束后，取发酵液2ml，10000rpm高速离心10min去除菌体，然后取上清液，加入等体积乙醇混匀后10000rpm 高速离心10min。取上清液20μL置于1.5mL的离心管中，加入0.4mol /L的硼酸盐缓冲液(pH＝8.5)20μL及2mmol/L的FMOC-Cl的乙腈溶液40μL，振荡混匀，于25℃水浴中反应20min，加入1mol/L的甘氨酸20μL，静置5min，让多余的衍生化试剂反应完。最后加入1.5mL 0.1％(V/V)的醋酸水溶液，经0.45μm微孔滤膜滤过后进行液相色谱分析。
(5)液相分析方法：
色谱柱：Kromasil C18分析柱(4.6mm×250mm，5μm)
流动相：乙腈-0.1％冰醋酸(50:50，V/V)
流速：1.0mL/min
柱温：30℃
检测条件：荧光检测器，激发波长254nm，发射波长322nm
进样体积：10μL
(6)实验结果：
以已知浓度DNJ对照品采用同样方法衍生处理的样品作为标准，根据标准浓度、峰面积、样品峰面积进行计算得到样品浓度，结果确认该实施方案所得发酵液中DNJ含量为5.01g/L。
实施例8 1-脱氧野尻霉素发酵制备
(1)菌种复苏活化：取菌种HDCC00252，在室温下解冻，吸取 0.1ml菌悬液接种到LB固体平板，涂布均匀，置于37℃培养箱内培养24h，得到活化复苏的菌苔。
(2)液体种子制备：取活化复苏的菌苔，用接种环刮取一环，接种到盛有100ml液体种子培养基的500ml三角瓶中，包扎好置于 40℃、220rpm的摇床上振荡培养4h。
液体种子培养基组成为：葡萄糖0.2％，酵母浸出粉0.2％，蛋白胨0.2％，氯化钠0.2％。消毒前调pH至9.0，消毒条件为121～123℃、 30min。
(3)发酵培养：取培养合格的液体种子，以4％(V/W)的比例接种到装有30ml优化液体发酵培养基的250ml三角瓶中，包扎好置于 37℃、220rpm的摇床上振荡培养4天结束。
液体发酵培养基配方组成为：葡萄糖2％，蔗糖4％，乳糖0.5％，酵母浸出粉2％，硝酸钠3％，硫酸亚铁铵0.8％，磷酸氢二钾0.2％。消毒前调pH至5.0，消毒条件为121～123℃、30min。
(4)样品处理：发酵结束后，取发酵液2ml，10000rpm高速离心10min去除菌体，然后取上清液，加入等体积乙醇混匀后10000rpm 高速离心10min。取上清液20μL置于1.5mL的离心管中，加入0.4mol /L的硼酸盐缓冲液(pH＝8.5)20μL及2mmol/L的FMOC-Cl的乙腈溶液40μL，振荡混匀，于25℃水浴中反应20min，加入1mol/L的甘氨酸20μL，静置5min，让多余的衍生化试剂反应完。最后加入1.5mL 0.1％(V/V)的醋酸水溶液，经0.45μm微孔滤膜滤过后进行液相色谱分析。
(5)液相分析方法：
色谱柱：Kromasil C18分析柱(4.6mm×250mm，5μm)
流动相：乙腈-0.1％冰醋酸(50:50，V/V)
流速：1.0mL/min
柱温：30℃
检测条件：荧光检测器，激发波长254nm，发射波长322nm
进样体积：10μL
(6)实验结果：
以已知浓度DNJ对照品采用同样方法衍生处理的样品作为标准，根据标准浓度、峰面积、样品峰面积进行计算得到样品浓度，结果确认该实施方案所得发酵液中DNJ含量为4.98g/L。
序列表
<110> 浙江珲达生物科技有限公司
<120> 一种解淀粉芽孢杆菌及其在制备1-脱氧野尻霉素中的应用
<130> P0102021080613
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1427
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gagagtttga tcctggctca ggacgaacgc tggcggcgtg cctaatacat gcaagtcgag 60
cggacagatg ggagcttgct ccctgatgtt agcggcggac gggtgagtat cacgtgggta 120
acctgcctgt aagactggga taactccggg aaaccggggc taataccgga tgcttgtttg 180
aaccgcatgg ttcaaacata aaaggtggct tcggctacca cttacagatg gacccgcggc 240
gcattagcta gttggtgagg taacggctca ccaaggcgac gatgcgtagc cgacctgaga 300
gggtgatcgg ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtag 360
ggaatcttcc gcaatggacg aaagtgtgac ggagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggttt 420
tcggatcgta aagctgtgtt gttagggaag aacaagtgcc gttcaaatag ggcggcacct 480
cgacggtacc taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gttatacgta 540
ggtggctagc gttgtccgga attgttgggc gtgaagggct cgcaggcggt ttcttgagtc 600
tgatgtgaaa gcccccggct caaccgggga gggtcattgg aaactgggga acttgagtgc 660
agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc ggtgaaatgc gtagagatgt ggaggaacac 720
cagtggcgaa cgcgactctc tggtctgtaa ctgacgctga ggagcgaaag cgtggggagc 780
gaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagggg 840
gtttccgccc cttagtgctg cagtaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc 900
aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat 960
tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatcct ctgacaatcc tagagatagg 1020
acgtcttcgg gggcagagtg acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat 1080
gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttgatctta gttgccagca ttcagttggg 1140
cactctaagg tgactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca 1200
tgccccttat gacctaggct acacacgtgc tacaatgggc agaacaaagg gcagcgaaac 1260
cgcgaggtca agccaatccc acaaatctat tctcagttcg gatcgcagtc tgcaactcga 1320
ctgcgtgaag ctggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc 1380
gggccttgta cacaccgccc gtcacacccc gagagtttgt aacaccc 1427

Claims (14)

1.一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)HDCC00252，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.22781，保藏日期为2021年06月25日。
2.一种含权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的发酵液。
3.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)或其发酵液在制备1-脱氧野尻霉素中的应用。
4.一种1-脱氧野尻霉素的制备方法，其特征在于：采用权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)进行发酵制备。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述的发酵过程包括在含有可同化的碳源和/或氮源的发酵培养基里，进行有氧发酵。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述的碳源选自葡萄糖、甘油、蔗糖、果糖、乳糖、麦芽糖、糊精、淀粉、甘露醇、山梨醇；和/或所述的氮源选自玉米浆、玉米粉、酵母膏、酵母浸出粉、酵母蛋白胨、大豆蛋白胨、牛骨蛋白胨、肉胨、鱼粉蛋白胨、硝酸盐或铵盐。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述的碳源选自葡萄糖、蔗糖、乳糖或其任意几种的组合。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述的氮源选自酵母浸出粉、硝酸盐、铵盐或其任意几种的组合。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述的发酵培养基还包括无机盐。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：所述的无机盐为硫酸盐、磷酸盐、亚铁盐。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于：所述的无机盐为硫酸铵、磷酸氢二钾、硫酸亚铁铵。
12.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述的发酵培养基含有葡萄糖0.1～2％，蔗糖0.5～4％，乳糖0.5～10％，酵母浸出粉2～5％，硫酸铵0～4％，硝酸钠0～3％，硫酸亚铁铵0.1～0.8％，磷酸氢二钾0.2～0.6％，余量为水。
13.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述发酵温度为28-40℃，所述培养基pH为5.0-9.0；培养时间为12-100小时。
14.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述解淀粉芽孢杆菌是通过种子液接种至所述发酵培养基中进行发酵培养的；
其中，所述种子液是将解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)HDCC00252在种子培养基里进行种子培养得到的；
和/或所述种子培养的条件为：种子培养的温度为28-40℃，所述培养基pH为5.0-9.0；培养时间为4-24小时；
和/或所述的种子培养基含葡萄糖0.2～4％，酵母浸出粉0.2～1％，氯化钠0.2～2％，蛋白胨0.2～4％。
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