CN108070548A

CN108070548A - 一株高产1-脱氧野尻霉素的解淀粉芽孢杆菌工程菌及发酵方法

Info

Publication number: CN108070548A
Application number: CN201810125101.XA
Authority: CN
Inventors: 冀志霞; 程相锦; 陈守文; 卢玉
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2018-02-07
Filing date: 2018-02-07
Publication date: 2018-05-25

Abstract

本发明提供了一株高产1‑脱氧野尻霉素的解淀粉芽孢杆菌工程菌及发酵方法，其保藏号为CCTCC NO.M2017849，命名为解淀粉芽孢杆菌HZ‑15，并进一步提供了解淀粉芽孢杆菌HZ‑15的构建方法及高产DNJ的方法。采用分子生物学技术，在之前实验室保存的产DNJ解淀粉芽孢杆菌LX‑12的基础上，通过同源重组方法成功构建了高产DNJ的工程菌HZ‑15。该菌株以黄豆为原料进行固体发酵，通过在固体发酵培养基中添加1%的麦芽浸粉和2%的乳糖，DNJ产量高达1117.2mg/kg。

Description

一株高产1-脱氧野尻霉素的解淀粉芽孢杆菌工程菌及发酵方法

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株高产1-脱氧野尻霉素的解淀粉芽孢杆菌工程菌及发酵方法。

背景技术：

随着糖尿病患者的日益增加，寻找治疗糖尿病的药物已成为医学领域的一大难题。1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin)简称DNJ，是一种哌啶类多羟基生物碱，其化学结构与葡萄糖类似，具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，可以竞争性结合α-糖苷酶活性部位，当消化道中或糖蛋白加工过程中的糖苷酶被DNJ等多羟基生物碱竞争性抑制时，会出现糖类吸收障碍和糖蛋白寡糖链的合成异常等现象，从而具有抑制血糖升高、抗肿瘤、抗病毒等一些生物学活性。DNJ的来源很广泛，可通过植物、动物和微生物产生，因微生物具有生长繁殖快，易培养，且可通过菌种改良，发酵工艺优化的方法来提高产量等优点，近年来利用微生物合成DNJ已成为研究热点。已经发现的可以合成DNJ的微生物主要有芽孢杆菌和链霉菌。

微生物中DNJ的合成途径相关研究表明，在芽孢杆菌中，葡萄糖通过异构化为果糖，之后经氨化、脱磷酸、氧化生成一种氨基糖，氨基糖经异构化生成甘露伊霉素(MJ)和野尻霉素(NJ)，最终还原生成了DNJ。转氨酶、肌醇磷酸酶和氧化还原酶分别由基因gabT1、yktC1和gutB1编码，是DNJ合成途径中的关键酶，这三个基因在解淀粉芽孢杆菌基因组上连在一起，形成调控DNJ合成的操纵子。然而在DNJ合成过程中，调控DNJ合成的关键酶不仅上述三种催化反应酶，还包括催化MJ转化为NJ的异构酶等，而尚未有研究者查找到相关的调控基因。目前通过菌株改造的方法来提高DNJ产量的研究相对较少。

目前，已有野生菌发酵用于DNJ的生产，例如枯草芽孢杆菌B2利用豆渣进行发酵生产DNJ；解淀粉芽孢杆菌140N以可溶性淀粉为碳源发酵，其DNJ产量达到0.8g/L；但上述发酵的产量依然不理想，通过生物技术手段获得一株产量高的工程菌，一直是本领域技术人员努力的目标。

发明内容：

本发明提供一株可以高产1-脱氧野尻霉素的解淀粉芽孢杆菌HZ-15，该菌株于2017年12月28日保存于湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2017849。

本发明的另一个目的在于提供了一种解淀粉芽孢杆菌HZ-15高产1-脱氧野尻霉素的发酵方法，本发明提供的发酵方法包括固体发酵和液体发酵，两种发酵方式均可获得高浓度的目的产物。

本发明的最后一个目的在于提供了解淀粉芽孢杆菌工程菌HZ-15在制备DNJ中的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一株可以高产1-脱氧野尻霉素的解淀粉芽孢杆菌工程菌HZ-15，所述的菌株通过下述方式构建得到：

本发明通过同源重组的方法，在解淀粉芽孢杆菌LX-12(保藏编号为CCTCCNO.M2015234)的染色体上重组并整合了含有转氨酶基因gabT1，肌醇磷酸酶基因yktC1和氧化还原酶基因gutB1的表达盒，具体的，本发明所述转氨酶基因gabT1的表达盒依次含有P43启动子，转氨酶基因gabT1序列和amyL终止子；所述的肌醇磷酸酶基因yktC1的表达盒依次含有P43启动子，肌醇磷酸酶基因yktC1和amyL终止子；所述的氧化还原酶基因gutB1的表达盒依次含有P43启动子，氧化还原酶基因gutB1和amyL终止子。本发明所述转氨酶基因gabT1，肌醇磷酸酶基因yktC1和氧化还原酶基因gutB1所连接的P43启动子来源于枯草芽孢杆菌168的基因组，为强启动子，其可高效启动下游基因的表达。本发明所用的终止子为枯草芽孢杆菌168中淀粉酶基因amyL的终止子。本发明所述转氨酶基因，肌醇磷酸酶基因和氧化还原酶基因重组载体中的同源重组序列位于噬菌体位点。该位点为噬菌体蛋白的基因位点，位于整个基因组靠近5’端的位置，其特征在于：基因组上含有转氨酶基因gabT1，肌醇磷酸酶基因yktC1和氧化还原酶基因gutB1的表达盒，基因gabT1、yktC1和gutB1的表达盒位于解淀粉芽孢杆菌HZ-15基因组噬菌体位点的5′端第734285-740083位核苷酸序列，通过上述步骤构建筛选的阳性转化子进行发酵培养，最终通过高效液相色谱检测筛选出一株制备DNJ含量最高的菌株，即为本发明的DNJ高产菌株。

至此，得到一株高产1-脱氧野尻霉素的解淀粉芽孢杆菌工程菌HZ-15，该菌株已于2017年12月28日保存于湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2017849，分类命名：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)HZ-15。

解淀粉芽孢杆菌工程菌HZ-15呈杆状，革兰氏阳性菌，产芽孢。培养初期在LB平板上菌落形态呈圆形突起、表面光滑、粘稠、挑之拉丝，随着培养时间的延长，菌落表面逐渐形成粗糙、皱褶的白色菌膜。常规生理生化实验表明，是好氧菌，接触酶，vp试验呈阳性，水解淀粉，还原硝酸盐成亚硝酸盐。

解淀粉芽孢杆菌HZ-15产1-脱氧野尻霉素的固体发酵方法，其步骤包括：

(1)固体发酵培养基的制备：将黄豆放入黄豆的3～6倍质量的水中在10～30℃下浸泡8～16h，倒掉多余的水，将其分装于培养容器中，厚度为两层黄豆厚，分别加入0.5～1.5％(w/w)麦芽浸粉和1.5～2.5％(w/w)乳糖，用封口膜封好，121℃，高压灭菌；

(2)发酵条件为：种龄为9～11h，接种量(v/w)为7～12％，发酵培养温度为37～40℃，发酵时间为48～60h，黄豆装载量为50g/250mL三角瓶。

解淀粉芽孢杆菌HZ-15产1-脱氧野尻霉素的液态发酵方法，其步骤包括：

挑取HZ-15单菌落接到5mL LB培养基中，37℃，180r/min振荡培养过夜。将培养物以2％的接种量接到50mL LB培养基中，37℃，180r/min振荡培养9h，直至OD600到4.0，再以2％的接种量接种到30mL优化的液体发酵培养基中，180r/min，37℃培养48h。

所述优化的液体发酵培养基配方为：麦芽浸粉70g/L，可溶性淀粉30g/L，K₂HPO₄·3H₂O0.75g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，MnSO₄·H₂O 0.075g/L，pH为7.5；

本发明的有益效果是：

通过将DNJ合成途径中的关键基因(转氨酶基因gabT1、肌醇磷酸酶基因yktC1和氧化还原酶基因gutB1)整合到实验室之前保存的产DNJ解淀粉芽孢杆菌LX-12，再通过目的产物的筛选，构建了解淀粉芽孢杆菌工程菌HZ-15；同时该菌株经固体发酵后，DNJ产量高达1117.2mg/kg。为以后的科学研究和大规模生产奠定了基础，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1：基因gabT1、yktC1和gutB1重组载体中表达元件琼脂糖凝胶图；

图1a：泳道M：DL5000分子量Maker；泳道1：启动子P43扩增产物；泳道2：终止子Amy扩增产物；泳道3：基因gabT1扩增产物；泳道4：基因yktC1扩增产物；泳道5：基因gutB1扩增产物，泳道6：基因gabT1上游同源臂gabT1-up扩增产物；泳道6：基因gabT1上游同源臂gabT1-down扩增产物；

图1b：泳道M：DL5000分子量Maker；泳道1：基因yktC1上游同源臂yktC1-up扩增产物；泳道2：基因yktC1下游同源臂yktC1-down扩增产物；泳道3：基因gutB1上游同源臂gutB1-up扩增产物；泳道4：基因gutB1下游同源臂gutB1-down扩增产物。

图2：重组质粒T2(2)-gabT1、T2(2)-yktC1和T2(2)-gutB1琼脂糖凝胶图；

泳道M：Supercoiled DNA Ladder Maker；泳道1：质粒T2(2)-gabT1；泳道2：质粒T2(2)-yktC1；泳道3：质粒T2(2)-gutB1。

图3：重组质粒T2(2)-gabT1、T2(2)-yktC1和T2(2)-gutB1的构建图；

图3a为重组质粒T2(2)-gabT1构建图；图3b为重组质粒T2(2)-yktC1构建图；图3c为重组质粒T2(2)-gutB1构建图。

图4：重组质粒转化解淀粉芽孢杆菌LX-12的菌落PCR验证图；

泳道M：DL5000分子量Maker；泳道1：以gabT1-YF、gabT1-YR作为验证引物扩增泳道；2：以yktC1-YF、yktC1-YR作为验证引物扩增；泳道4：以gutB1-YF、gutB1-YR作为验证引物扩增。

具体实施方式：

本发明实施例所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方式；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1

解淀粉芽孢杆菌HZ-15的构建：

1.基因gabT1、yktC1和gutB1重组载体的构建

根据枯草芽孢杆菌168的基因组序列，PCR扩增启动子P43SEQ ID NO:1及终止子amyL SEQ ID NO:2，引物分别为P43-F SEQ ID NO:3，P43-R SEQ ID NO:4，TamyL-F SEQIDNO:5，TamyL-R SEQ IDNO:6。根据解淀粉芽孢杆菌LX-12的基因组序列，PCR扩增基因gabT1SEQ IDNO:7及其上下游同源臂gabT1-up SEQ IDNO:8和gabT1-down SEQ IDNO:9，引物分别为gabT1-F SEQ IDNO:10，gabT1-R SEQ IDNO:11，gabT1-upF SEQ IDNO:12，gabT1-upR SEQ IDNO:13，gabT1-downF SEQ IDNO:14，gabT1-downRSEQ IDNO:15。根据解淀粉芽孢杆菌LX-12的基因组序列，PCR扩增基因yktC1SEQ IDNO:16及其上下游同源臂yktC1-up SEQIDNO:17和yktC1-down SEQ IDNO:18，引物分别为yktC1-F SEQ IDNO:19，yktC1-R SEQIDNO:20，yktC1-upF SEQ IDNO:21，yktC1-upR SEQ IDNO:22，yktC1-downF SEQ IDNO:23，yktC1-downRSEQ IDNO:24。根据解淀粉芽孢杆菌LX-12组的基因序列，PCR扩增gutB1SEQIDNO:25及其上下游同源臂gutB1-up SEQ IDNO:26和gutB1-down SEQ IDNO:27。gutB1-FSEQ IDNO:28，gutB1-R SEQ IDNO:29，gutB1-upF SEQ IDNO:30，gutB1-upR SEQ IDNO:31，gutB1-downF SEQ IDNO:32，gutB1-downRSEQ IDNO:33。

产物纯化回收后，将基因片段gabT1、yktC1和gutB1分别与启动子P43、终止子amyL及其对应的上下游同源臂进行SOE-PCR扩增，纯化回收产物后分别与温敏型敲除载体T2(2)-ori同时用限制性内切酶BamHI和XbaI进行双酶切，纯化回收后用T4DNA连接酶16℃连接过夜，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，挑取单菌落进行菌落PCR验证，初步确定为阳性克隆后，提取质粒进行PCR和双酶切验证并测序，即构建成功的重组质粒T2(2)-gabT1、T2(2)-yktC1和T2(2)-gutB1。

2.基因gabT1、yktC1和gutB1重组工程菌的构建

将解淀粉芽孢杆菌LX-12(CCTCC NO.M2015234)接种于5mL液体LB培养基中，180r/min，37℃培养过夜，取5％培养物转接于50mL电转化生长培养基(LB+0.5mol/L山梨醇)中，250r/min，37℃振荡培养3h，使OD₆₀₀达到0.85-0.95，将培养物加入灭菌的50mL离心管中，置冰上预冷10min，6000r/min离心6min收集菌体，用预冷电转化洗涤培养基(0.5mol/L山梨醇，0.5mol/L甘露醇，10％甘油)洗涤菌体3次，每次30mL，6000r/min离心6min，弃上清，将菌体重悬于800uL洗涤培养基中，每100μL分装于一个1.5mL离心管中，-80℃保存，即为感受态细胞。取上述感受态细胞加入5μL质粒DNA(50ng/μL)，轻柔混匀后转移到预冷的2mm电转化杯中，冰浴2-3min，用电脉冲转化仪2.4KV电击后，迅速加入800μL恢复培养基，110r/min，37℃，恢复培养3h，涂布含有20ug/mL的卡那抗生素平板，静置培养16-18h，筛选阳性转化子。

挑取转化子单菌落，在含卡那抗生素平板上划线，培养10～12h。挑适量菌体于装有30μL无菌水的1.5mL离心管中，混匀，沸水中煮约15min；12000r/min离心2min，依据菌体的量吸取上清8μL作为菌落PCR的模板，用验证引物进行PCR扩增反应，PCR和测序验证阳性克隆。将正确的单菌落在45℃条件下进行单交换，单交换传代后在37℃条件下进行双交换筛选，选取最终在LB平板生长而在含Kan的平板不生长的单菌落进行PCR验证，将筛选出的正确的阳性转化子进行发酵培养，最终通过高效液相色谱检测筛选出一株DNJ含量最高的菌株，即为DNJ高产菌株。将菌株命名为解淀粉芽孢杆菌HZ-15，-80℃保存备用。

验证引物分别为gabT1-YF SEQ IDNO:34，gabT1-YRSEQ ID NO:35，yktC1-YF SEQIDNO:36，yktC1-YF SEQ IDNO:37，gutB1-YF SEQ IDNO:38，gutB1-YF SEQ ID NO:39。

该菌株已于2017年12月28日保存于湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2017849，分类命名：解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)HZ-15。

实施例2

解淀粉芽孢杆菌HZ-15高产1-脱氧野尻霉素的固体发酵方法：

1-脱氧野尻霉素的检测方法和定量方法：

发酵结束后以1:1(w/v)的比例向黄豆中添加蒸馏水，200r/min处理1h抽提DNJ，10000r/min离心20min，取上清。将样品进行衍生化处理：发酵上清液35μL于1.5mL的离心管，加入0.4mol/L硼酸钾缓冲液(pH 8.5)169μL，5mmol/L的衍生化试剂FMOC-Cl(溶解于50％乙腈中)250μL，混匀，25℃恒温水浴中反应20min，加入1mol/L的甘氨酸25μL终止反应(中和剩余的FMOC-Cl)，再加1％(V/V)的醋酸溶液66μL，用水定容至707μL，用孔径0.22μm微孔滤膜过滤，收集滤液，用RP-HPLC-UV法测定，色谱柱为ZORBAX SB-C18(规格：5μm,4.6×150mm)，检测器为UVD 170U紫外检测器，检测波长254nm，流动相为乙腈-0.1％醋酸(11:16，V/V)，流速为1.0mL/min，进样量20μL。以DNJ标准品作为对照，对发酵产物进行定量分析。

解淀粉芽孢杆菌HZ-15高产1-脱氧野尻霉素的固体发酵方法：

挑取HZ-15单菌落，接到5mL LB培养基中，37℃，180r/min振荡培养过夜。将培养物以2％(v/v)的接种量接到50mL LB培养基中，37℃，180r/min振荡培养9h，直至OD₆₀₀到4.0，作为种子液。随后按接种量10％(v/w)接种于50g优化的黄豆固体培养基(含水量50％)中，在37℃条件下固体发酵48h，每隔12h混匀1次。

所述优化的黄豆固体培养基制备方法：将黄豆放入4倍黄豆质量的水中10～30℃下浸泡12h，倒掉多余的水，将其分装于培养容器中，厚度为两层黄豆厚，分别添加1％(w/w)麦芽浸粉和2％(w/w)乳糖，用封口膜封好，121℃，高压灭菌20min，得到固体培养基质。

在优化的固体发酵培养基中，工程菌HZ-15的DNJ产量为1117.2mg/kg。

实施例3：

解淀粉芽孢杆菌HZ-15高产1-脱氧野尻霉素的液体发酵方法：

挑取HZ-15单菌落接到5mL LB培养基中，37℃，180r/min振荡培养过夜。将培养物以2％的接种量接到50mLLB培养基中，37℃，180r/min振荡培养9h，直至OD600到4.0，再以2％的接种量接种到30mL优化的液体发酵培养基中，180r/min，37℃培养48h。

所述优化的液体发酵培养基配方为：麦芽浸粉70g/L，可溶性淀粉30g/L，K₂HPO₄·3H₂O0.75g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，MnSO₄·H₂O 0.075g/L；发酵条件为：种龄为9h，接种量(v/v)为2％，发酵培养温度为37℃，培养基初始pH为7.5，装液量为30mL/250mL三角瓶。

在优化的液体发酵培养基中，工程菌HZ-15的DNJ产量为297.38m g/L,比原始菌提高了20.9％。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一株高产1-脱氧野尻霉素的解淀粉芽孢杆菌工程菌及发酵方法

<160> 39

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 398

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcggaatttc caatttcatg ccgcagccgc ctgcgctgtt ctcatttgcg gcttccttgt 60

agagctcagc attattgagt ggatgattat attccttttg ataggtggta tgttttcgct 120

tgaactttta aatacagcca ttgaacatac ggttgattta ataactgaca aacatcaccc 180

tcttgctaaa gcggccaagg acgctgccgc cggggctgtt tgcgtttttg ccgtgatttc 240

gtgtatcatt ggtttactta tttttttgcc aaagctgtaa tggctgaaaa ttcttacatt 300

tattttacat ttttagaaat gggcgtgaaa aaaagcgcgc gattatgtaa aatataaagt 360

gatagcggta ccattatagg taagagagga atgtacac 398

<210> 2

<211> 235

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aagatagaag agcagagagg acggatttcc tgaaggaaat ccgttttttt attttgcccg 60

tcttataaat ttctttgatt acattttata attaatttta acaaagtgtc atcagccctc 120

aggaaggact tgctgacagt ttgaatcgca taggtaaggc ggggatgaaa tggcaacgtt 180

atctgatgta gcaaagaaag caaatgtgtc gaaaatgacg gtatcgcggg tgatc 235

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcggaatttc caatttcatg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtgtacattc ctctcttacc 20

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aagatagaag agcagagag 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gatcacccgc gataccgtc 19

<210> 7

<211> 1278

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtggtatttg tgggaacgaa ggaaatcacg aatccagaca gcttgtatta cagtgttgac 60

gatgtagtaa tggagcgcgg agaagggatt tacctgtacg atcaagaggg gaatgagtac 120

attgattgcg cttctgccac atttaacttg aatttaggat acggtaacaa agaagtcatt 180

gatacggtta aagaacaagc cgataagctg atccatgtga catcatcttt tcaaacagac 240

gccgtaaata aactggcaga aaaactagta gaaatcgccc ccgataatct cacaaaagta 300

caccctaaag tcagcagcgg ttccggtgca aatgaaggag ctattaaaat ggctcagtat 360

tactccggaa aaaccgatgt catctcctta tttcgaagcc acctcggaca aacgtatatg 420

acttccgctt tgtccggcaa ctcattcaga aaagaacctt tcccgccgca aatttctttt 480

ggccttcaag tccccgatcc gtattgcagc cgctgttttt ataatcagaa acctgattca 540

tgcggtatgc tgtgcgtaga aagaattaat gattttattg agtatgcgag taatggaaaa 600

attgccgcca tgattattga accgatatcc ggaaacggtg gaaacgtcgt tccgcctaaa 660

gagtatttta aacagctgag acagctttgt gatgaacacg atatcgccct gatttttgat 720

gaaattcaga ccgggttcgg acggacgggc aaaatgtttg ccgcggacca cttcgatgtg 780

aaacctaata tgatgacggt agcaaaaggg ctcgggggca caggcttcca agtcgccgcc 840

actctgacgg aggacaagta taccgggctt ccggggtata cgcactcctt cacgtacggc 900

tcaaatgtga tggccgccgc tgccgcgtgt aaaaccatag atatcatgca gcgtccggga 960

tttttggaaa atgtaacgac ggtcggtcat tatattatgg atcgcttaga aacgatgaaa 1020

gaggatttcg cttttatttc tgaggtaaga ggcgtcggtc ttatgatcgg tgtggagatt 1080

gtaaaagaga acaatgaacc ggatgtggag ctgaccaatt atattgcaaa acgggcaatg 1140

gattacgggc tgattctccg gacatcccgt tacgggttcg gaaatgtatt taaaatccgt 1200

ccgcctttaa ccattacact tagtgaagcc gaagtgctct gctacagact tcgcaagcta 1260

ttggaggaaa tcaagtga 1278

<210> 8

<211> 493

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cttcggaact gacaccgtct catgataaat atcgcatctg tcagtgagca gccgttcgta 60

gctcataaag gtctcacctt tgcgtgtgca gaaaccggag aataacccgg cgtgatatat 120

tcacagagca gatggtgcac cgccggtttt ctgattccgc cttcacctgc caccgtatac 180

gagtagtcgc ctatcttttc agattgatag gcggaagcgg ctgcttcatt ctggttgatc 240

agcgcaaaat attgagaaag ctttaataac gcaatcttaa tcttttcggg aagcggtgag 300

taaacagggt cagtgaacga atgccccgcc attctggccg cttccgcctc cgcctccaga 360

atgtcctgta taagaagcgg ctccggcctg tttttgactt gatcataaac tgaatatgaa 420

acaacgtcag acggctgaat taacataact gccacccccg tcttattctt taacgtttac 480

gattttggcg ctt 493

<210> 9

<211> 494

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gaaaatggtc ggcgtgttct gcaccatgcg gataaatgct gaagcttgtg cggggttcat 60

taaaccgccg ctttttaaag cggaaagtga catttccgcc tttctgatga tatcttgatt 120

tctcactcta cagttcctcc ttctgactgg gcttaaagca gtccgctcca aatggatttt 180

ttaacaggct cttgaccgcc cgtctcttct tccggctgct ttgatgcgcc tcttactttt 240

tcaagcgctt caatgcgttt aataatcggc gccagcatgt cctcaacaag tgttttcagc 300

ttttcttcat cagacggcgc agccgccccg tctttgtctt ccgtgttctg gtccaaactg 360

tcaagccgct ttaaaagcgg gtgcagcgcg tgttcaatcg attctcttac gtcttctttt 420

ctcatcttgt tcaagtcctc tcccttgcgg tttcttgatt tgcggtcacg gtcgagaaat 480

tgcttgactg cgcc 494

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtggtatttg tgggaacgaa gg 22

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tcacttgatt tcctccaata gcttg 25

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cttcggaact gacaccgt 18

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aagcgccaaa atcgtaaac 19

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gaaaatggtc ggcgtgtt 18

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ggcgcagtca agcaattt 18

<210> 16

<211> 951

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gtgagagact atatcatcgg gcttggacaa tttgtttatc ataaggtgaa aagtcaaaaa 60

ggcacgctga aaaaccggct cgtaaacggc tattctccgg gaggcgacgc ccaatttaac 120

atagacgccg ctgctgagga ggcggtgctg gattatattc aagataaggg ccatccggtt 180

gctttttaca cggaggatgg cggcctgaag ctgattggag aagatccgca atatatttta 240

attgtagatc cgatagacgg aacgcgtccg gccgccgcgg ggcttgaaat gtcgtgtatt 300

tcgattgcgc ttgcttcata taagccaaac gcaaagatta aggatatcga atttgctttt 360

ttgcttgaat tgaaatcggg cgcttacatg tacggtgata tttacagcga tgccattcag 420

tttgaggggt atcagggaga attaccgaat ttgagcggag tgcgggatat taaaaatatg 480

ttttggagcc ttgaatttaa cgggcatccg gcacagctga tgacggatgc atacggtcat 540

ctgattgacc ggtcagccaa taatggcggg gtttttgttt tcaacagcgc ttcttattcg 600

atttcacgaa ttatcacggg gcagatggat gcttatgtgg atatcggcaa tcgtctgctg 660

aaagatgatc cgaagctgct ttcagatttt cagcaggtcg gaaacggaga ggtgctgcat 720

ttgtttcctt atgatattgc cgcaagcgtc tttttggcga agaaagcggg agtggtcatt 780

acggatgcat acggccggtc tttggacgaa acgcttctga cagatttaag ttatcagaac 840

cagcaatcat gtattgcggc atcaacgaag gagcttcatc aaacattgtt agaccaaatc 900

cgctggggca gaaaggaaga gaaatatgaa ggcgttggtc tggactccta a 951

<210> 17

<211> 537

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cgggctcaag acttcagtat acaaaaaagc tgaaacggtt caaacatatc tattgctcag 60

acagctgtga aaatacgatc cgcgaattgc agaacttaac gtacgcaaaa aacaaaaacg 120

gcgttctgtc ggaagatgag ttttcaattg atccccacac actttcagcc atttggtatg 180

cgctggatga ctatgacgcg gcggatctga aagatgcatc acaaaaacgg agacgtccga 240

atcgggaaag gaggagatag gcgttgccta actatcaaaa cgttagagcc accgtcttta 300

aatcaaaaat ggccgcgccg caggcaaggc agatgaacga agatcaattt gccgatctgt 360

acggcgaaga catcatttca ccgccctata atctcattga actgaaaaca atcgccgaat 420

actcgacgat tcttcagcag tgcattgacg cgtatcgggt caatattacg ggttttgggt 480

tcgatgtgga atataccttt gatgtaaata gcccagattg ctcaccgtct aaaaagg 537

<210> 18

<211> 545

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cattacgccc gtgtctgtgg aaattaaatc acttgcggaa attctgcagg atgatgcgct 60

gtttcttgaa tatgacgaca gaagcagaaa taaactccgt tccgctttcc gtctcccgcc 120

gctttatacg ggagaggcgc aggaatacaa caaagccaca gccgatacgg cacggaaaat 180

aacggaggag caggtgtttc agccggagcg gaaaacgctg attaataagc tcaacacgtt 240

atttttgcct gaactgggtc tccacgatgt acagctcaca ttaaaagggc ctgattttcg 300

cgatccgctt gaaattgcga aggtgcttac gccatttatt tccgccggcg cggtctctcc 360

taatgacctc cgtgatctgg cgggaagagt gctcggcaag acgcttgagg aatggcctga 420

agagtactac agccggccgg tgctgaaagg gaaataggag caatcctgaa agggggtgaa 480

aacatctcgt gccgagagaa ttgagaaatg ccgtcatcag ttttgtgagc tatgtcgata 540

aggcg 545

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gtgagagact atatcatcgg gctt 24

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ttaggagtcc agaccaacgc 20

<210> 21

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

cgggctcaag acttcagt 18

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

cctttttaga cggtgagca 19

<210> 23

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

cattacgccc gtgtctgt 18

<210> 24

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

cgccttatcg acatagctc 19

<210> 25

<211> 1046

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

atgaaggcgt tggtctggac tcctaatgat aagcttgaat atcaagaggt ggacgagcct 60

caaattcgga aatccaatga tgtgaaagtg aaaattttcg gcaccggtat ctgcggaacg 120

gatttaaatg tgttgaaagg aaaaatgaat gcaacccatc atatgattat ggggcatgaa 180

tcggtgggag cggtcgtgga aatcggaccg gacgtgacaa atgtaaaagt cggagaccgc 240

gtcgtgattg atcctacgca gttttgcggg aaatgtcatt attgccggag agggctgacg 300

tgttattgcg aaaccttcga ggattggcag ctcggaatcg gggcgcacgg aacgtttgcg 360

gaatattacg tcggagaaga caggttcatg tacagaattc cggattcaat ggaatgggag 420

cgggccacat tggttgagcc tctctcctgt gtgctgaatg ttgtggacaa agcttcgatt 480

cagccggagg actcggtctt ggttttgggg tcggggccaa tcggactgct tgtgcaaatg 540

atggtgaaaa aactggcgcg gttgacggtt gcgactgaaa taggcagttt ccgaagcgag 600

gcggcgagcc ggatatcgga ttatgtctac caccctgaag cattaaccgt ggatgaagtg 660

aaacggatta atcaaggaag aaaatttgat gtaatttttg acgcgatcgg caatcagctt 720

gattgggctt atccttttat gaaaagggag gcagaatcgt gccgatgggc tttgatgata 780

cgtatgagat gacagtcagg ccgtaccagc tgctgtcaaa cggcgtaacg attgtgggca 840

caggtgaagc ccgtcagatc atggaggctg cgttagcatg cgcgtccgac cttccgcagc 900

tctatgattt tattacggaa aagacggaac tgaagaatta tgaagaagcc attgatcatc 960

tcatgggcat cgacccggtg acaaaagaaa gaaaggatat cagcgcaata aaaacgattc 1020

ttgtgtctga tccggaactt ttataa 1046

<210> 26

<211> 503

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

agcccggcat aagaagagcg atagaccgca gagacgctta tcagagaatg ctcattaaag 60

atccgagaat catagaaacc tattcgcagg cgctgatgtt tgaaccgtcc gcaaatgtga 120

ctgaagaaga cagaatcaga ctgcgggacg cattagccgt tttaacggat agagaaaaag 180

aaatgctgct gctccacaaa gcggaatgct tttcgtatga acggatcgcc gccttgctga 240

atgtaaagaa atcaaccgta caaacgacgg tcaaacgggc gcttctgaaa attcaaaaac 300

agcaggaaca aagaaatcaa tcgcctgctt cataagttgt catacgtttg ccacctagaa 360

gtgaacagac gatcacaaaa agcggcccga ttagaagccg ctttttatta tagacaatca 420

tgtcggaggt ggcggtgatg ccgtagcatg aaaaacgcaa aaagagaaca ggcatttaca 480

atctatcagt ctcataaagg ccg 503

<210> 27

<211> 564

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ccaaaagccg attgacattg tcattacgcg gaaagaggaa cggacatgat tgaaaaagcg 60

gttaacccgc gctttgaaga ttatttgttc aattggaatg aaacgtacca atttctcgtc 120

ggaggctacg gctcgtcaaa aagctatcat accgcgctga aaatcatctt gaagctgctt 180

cgtgaaaagc ggacggcgct tgtcgtgcgg gaagttttcg atacgcacag agattctact 240

tttgccttgt ttgaggacat tatcgaagag cttgagctgg gacatgccgt aaaggccgtg 300

tcatcaccga tgcagctgag attttcaaac ggaagccgga ttatgtttaa agggatggac 360

aacccggcca aattgaaatc cattcatcat atttcactga tttggattga agaatgctct 420

gaagtgaagt atgaaggctt taaggagctg atcggccgtc tgcgccatcc tgagctttcg 480

cttcatatga tatgcaccac aaatcccgtc ggcacctcca attggacgta ccggcatttt 540

tttcgtgatg agcaaaacaa acgg 564

<210> 28

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

atgaaggcgt tggtctgga 19

<210> 29

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

ttataaaagt tccggatcag acac 24

<210> 30

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

agcccggcat aagaagag 18

<210> 31

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

cggcctttat gagactgat 19

<210> 32

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

ccaaaagccg attgacat 18

<210> 33

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

ccgtttgttt tgctcatc 18

<210> 34

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

cggaaaatga acgagaaac 19

<210> 35

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

gaaatcggga atgctgtga 19

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

aagagtcata caatgcggtc 20

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

ggccttttca atctcttcag 20

<210> 38

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

ataaacgcac gctgaaaga 19

<210> 39

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

gtaatgccgt aagctgtcc 19

Claims

1.一株解淀粉芽孢杆菌基因工程菌，所述的基因工程菌为：保藏编号为：CCTCCNO.M2017849。

2.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌基因工程菌在制备1-脱氧野尻霉素中的应用。

3.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌基因工程菌的固态发酵方法，包括下述步骤：

（1）固体发酵培养基的制备：将黄豆放入黄豆的3~6倍质量的水中在10~30℃下浸泡8~16h，倒掉多余的水，将其分装于培养容器中，厚度为两层黄豆厚，分别加入0.5~1.5%（w/w）麦芽浸粉和1.5~2.5%（w/w）乳糖，用封口膜封好，121℃，高压灭菌；

（2）发酵条件为：种龄为9~11 h，接种量（v/w）为7~12%，发酵培养温度为37~40℃，发酵时间为48~60h。