CN114717135B - 一种普拉特链霉菌及其发酵产假尿苷和1-甲基-假尿苷的方法 - Google Patents

一种普拉特链霉菌及其发酵产假尿苷和1-甲基-假尿苷的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种普拉特链霉菌(Streptomyces platensis)DHE020，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.23602，保藏日期为2021年10月14日。所述普拉特链霉菌可同时发酵产假尿苷和1‑甲基‑假尿苷，具有工业化生产潜力。

Description

一种普拉特链霉菌及其发酵产假尿苷和1-甲基-假尿苷的 方法
技术领域
本发明涉及工业微生物发酵技术领域，具体涉及一种普拉特链霉菌及其发酵产假尿苷和1-甲基-假尿苷的方法。
背景技术
相对传统疫苗而言，mRNA体外转录效率高，能快速、规模化生产，适用于流感病毒、人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)等高变异性病毒疫苗的研发。另外，基因工程技术的发展使得mRNA更加适用于个性化医疗。但是，由于mRNA疫苗自身的稳定性差、易被组织内的核酸酶降解、进入细胞的效率较低、翻译效率较低等问题，这些缺陷限制了mRNA疫苗的应用。针对mRNA存在的以上问题，在提高mRNA疫苗稳定性和降低免疫刺激方面，mRNA中核苷酸类似物的修饰在一定程度上阻止了内源性mRNA的免疫监测，使细胞能够区分内源性mRNA与病理性或入侵性mRNA。这为mRNA疫苗的开发提供了新的思路，即通过合并修饰核苷来降低免疫刺激的产生，因此也提高了安全性。进一步的，作为化学修饰核苷酸的一种，即假尿苷以及进一步甲基化修饰的1-甲基-假尿苷为mRNA中较为重要的结构性修饰核苷酸，在增加mRNA稳定性的同时，也极大的降低了免疫原性，从而降低免疫刺激，实现mRNA疫苗在体内的高效表达。由此可知，假尿苷和1-甲基-假尿苷为mRNA疫苗中非常重要的一种结构性原辅料，在mRNA的生产以及发挥功能方面均具有不可或缺的重要意义。
而在假尿苷以及1-甲基-假尿苷制备方面，(1)假尿苷的合成技术难度大，存在化学合成步骤长，反应过程易燃易爆，综合收率低，且全球范围内尚未有公司可以开展假尿苷的大规模工业化生产；(2)1-甲基-假尿苷，作为mRNA中的结构性核苷酸，是以假尿苷为起始物料进行甲基化修饰而得来，其制备难度更高，对其质量标准要求也更高。在生物合成方面，尚未发现可专一大量用于假尿苷和1-甲基-假尿苷同时制备的微生物菌种和技术报道。因此，假尿苷和1-甲基-假尿苷的低成本便捷式获取存在一定的缺陷。
针对现有技术中假尿苷和其甲基化产物1-甲基-假尿苷只能通过化学合成法制备，且化学合成过程中存在的合成步骤长、收率低，且用到的试剂易燃易爆，较不安全等一系列的问题，在此，本发明寻求一种新的微生物，并可通过简单的发酵和较低的成本实现假尿苷和1-甲基-假尿苷的生产。
发明内容
考虑到mRNA疫苗广阔的应用前景，而假尿苷和1-甲基-假尿苷作为mRNA疫苗中至关重要的原辅料，为了解决假尿苷和1-甲基-假尿苷现有制备方法不足的问题，为了保证mRNA疫苗的稳定性生产和供应，本发明的目的之一在于提供一种新的发酵菌种，该菌为普拉特链霉菌(Streptomyces platensis)DHE020，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.23602，保藏日期为2021年10月14日。
本发明的目的还在于提供了一种普拉特链霉菌(Streptomyces platensis)DHE020(CGMCC NO.23602)在制备假尿苷和1-甲基-假尿苷或者含有假尿苷和1-甲基-假尿苷的药物组合物的应用。
本发明还提供了一种假尿苷和1-甲基-假尿苷的制备方法，该方法包括采用普拉特链霉菌(Streptomyces platensis)DHE020(CGMCC NO.23602)在含有可同化的碳源和/或氮源的营养培养基里，进行有氧发酵的步骤。
在优选的实施方案中，上述可同化的碳源选自玉米淀粉、麦芽糊精、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、工业糖蜜、甘油、豆油、山梨醇、甘露醇之一或者上述物质任意几种的组合，优选为玉米淀粉、乳糖、葡萄糖、工业糖蜜、山梨醇之一或上述物质任意几种的组合。
在优选的实施方案中，上述可同化的氮源选自酵母抽提粉、酵母粉、酵母膏、大豆卵磷脂、黄豆饼粉、棉籽饼粉、花生饼粉、麸质粉、玉米浆干粉、豆粕、蛋白胨、尿素、铵盐之一或者上述物质任意几种的组合，优选为黄豆饼粉、蛋白胨、酵母膏、玉米浆干粉之一或上述物质任意几种的组合。
在优选的实施方案中，上述营养培养基还包括无机盐，所述无机盐选自柠檬酸三钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸铵、碳酸钙、硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸铜、氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、氯化铁、硫酸锰之一或上述物质任意几种的组合，优选为硫酸铵、磷酸氢二钾、硫酸镁、碳酸钙之一或任意几种的组合。
在优选的实施方案中，所述营养培养基含有玉米淀粉8-60g/L、乳糖5-50g/L、葡萄糖5-60g/L、工业糖蜜10-50g/L、蛋白胨3-15g/L、黄豆饼粉10-20g/L、玉米浆干粉5-20g/L、硫酸镁2-10g/L、硫酸铵2-8g/L、硫酸锰1-5g/L、碳酸钙5-30g/L。
在优选的实施方案中，所述有氧发酵的温度为20-35℃，优选为20-30℃；培养基pH为5.0-8.0，优选为5.0-7.0；培养时间为24-240小时，优选为72-168小时；通氧量为0.1-2.0vvm，优选为0.8-2.0vvm。
在优选的实施方案中，所述普拉特链霉菌(Streptomyces platensis)DHE020是通过种子液接种至所述营养培养基中进行所述发酵培养的；其中，所述种子液是将普拉特链霉菌DHE020在种子培养基里进行种子培养得到的。
在优选的实施方案中，所述的种子培养基含有葡萄糖5-30g/L、工业糖蜜10-30g/L、玉米淀粉5-20g/L、黄豆饼粉2-10g/L、酵母膏1-10g/L、碳酸钙1-20g/L，硫酸镁1-10g/L，磷酸氢二钾1-10g/L。
在优选的实施方案中，所述种子培养的条件为：种子培养的温度为20℃-30℃，优选为23℃-28℃；培养基pH为5.0-8.0，优选为5.0-7.0；培养时间为24-80小时，优选为24-60小时。
本发明假尿苷和1-甲基-假尿苷通过以下条件进行HPLC检测：
本发明假尿苷和1-甲基-假尿苷效价检测所用的液相检测方法条件如下：
色谱柱：Waters XBridge Amide(250mm×460mm,3.5μm)，流动相A：1％(质量体积比，单位为g/L)三乙胺乙酸水溶液，流动相B：乙腈，保留时间：15min，流速：1mL/min，进样量：10μL，检测波长：255nm，柱温：(25±1)℃。
表1流动相A和B的洗脱程序体积比
Min A B
0 100 0
3 100 0
6 98 2
12 70 30
15 60 40
本发明普拉特链霉菌(Streptomyces platensis)DHE020主要生物学特征为：菌落形态呈椭圆，表面多褶皱，凸起，菌落直径大小约8～20mm，菌落表面有沟纹，中间稍凹陷，基质菌丝发达，与培养基结合紧密，不易挑起，颜色呈米色或淡黄色，气生菌丝白色，产孢丰富，前期白色，后期转浅黄色，无可溶性色素。
本发明菌株(Streptomyces platensis)DHE020为一株全新的可同时发酵产假尿苷和1-甲基-假尿苷产生菌，经发酵培养后，假尿苷和1-甲基-假尿苷的效价可分别达到1000mg/L和700mg/L以上，具有工业化生产潜力。
附图说明
图1为菌株DHE020在ISP2培养基上的显微镜检图(400×)。
图2为菌株DHE020在ISP2培养基上的菌落特征图。
图3为菌株DHE020通过发酵培养后，对菌体进行分离提取，经HPLC检测的含有假尿苷和1-甲基-假尿苷的图谱。
具体实施方式
下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中采用的材料、试剂等如无特殊说明，皆为普通市售品，皆可于市场购得。
其中所用放线菌DNA提取试剂盒购自北京三博远志生物技术有限责任公司；
PCR产物纯化回收所用的SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明，应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例1：菌株来源
普拉特链霉菌(Streptomyces platensis)DHE020是从中国湖北省丹江口市太和山山坡的土壤中分离得到。
在太和山区域土壤进行交叉采样，随机取5个采样点，每个点取土壤样品10g，放入锥形瓶中，混合均匀后取样品10g，加入到一个装入90mL无菌水的锥形瓶中(瓶中有一个磁力搅拌器)，漩涡搅拌30分钟，使其充分混匀制成悬浊液，即为10-1菌悬液。用稀释涂布平板法将上述悬浊液与无菌水按照体积比1：9稀释成10-2，10-3，10-4，10-5浓度，取不同稀释倍数菌悬液0.1mL，涂布于ISP2培养基平板中，用无菌涂布棒在培养基表面轻轻涂布，室温下静置30分钟后置于28℃恒温培养箱。待菌落长出后，观察记录菌落颜色、透明度、菌落表面、边缘形态。最终挑取1000株菌株接种于ISP2培养基制成斜面，并进行发酵验证。用接种环挑取斜面培养的菌体一环，分别接种于含有20mL种子培养基的250mL锥形瓶中，于28℃条件下震荡培养1天后，再吸取1mL移种于含有20mL发酵培养基的250mL锥形瓶中，于28℃条件下震荡培养3天后，经HPLC检测所得发酵液中假尿苷和1-甲基-假尿苷的含量，挑选出最高产菌株即普拉特链霉菌(Streptomyces platensis)DHE 020。
种子培养基配方(g/L)：葡萄糖10g/L，玉米淀粉10g/L，乳糖10g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨5g/L，碳酸钙15g/L，硫酸镁1.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，加水定容至1000mL，pH 7.0±0.1。
发酵培养基配方(g/L)：玉米淀粉10g/L，工业糖蜜10g/L，葡萄糖20g/L，酵母抽提粉5g/L，酵母粉10g/L，酵母膏10g/L，碳酸钙30g/L，加水定容至1000mL，pH 7.0±0.1。
实施例2：普拉特链霉菌(Streptomyces platensis)DHE020的形态学、培养学特征、生理生化特征。
参照《链霉菌鉴定手册》、《放线菌的分类与鉴定》、《常见细菌系统鉴定手册》等书中的有关内容进行实验：颜色的判断参照RAL K7色卡中的颜色进行对照。
1、菌株的形态学特征：将菌株DHE020接种于ISP2培养基中进行插片培养，28℃培养3-5天后取盖玻片于载片中，在光学显微镜下400×倍观察，结果见图1。
2、菌株培养学特征：菌株DHE020在ISP2培养基上28℃条件下培养7～10天后，菌落形态椭圆形，有放射状条纹，表面凸起，菌落直径大小约8～20mm，菌落表面有沟纹，中间稍凹陷，基质菌丝发达，与培养基结合紧密，不易挑起，颜色呈米白色，气生菌丝白色，产孢丰富，前期白色，后期转浅黄色，无可溶性色素，结果见图2。
其他培养学特征则采用ISP1、ISP3、ISP4、ISP5、苹果酸钙、高氏一号、营养琼脂7种培养基，28℃条件下培养7～10天后，观察其菌落、菌丝、孢子及色素产生情况，结果如表2所述。
表2菌株DHE020在7种培养基上的培养特征
3、生理生化特征试验：结果表3～表8。
a)碳源的利用：采用ISP9作为基础培养基，各种碳源的终浓度均为1.0％，见表3。
b)无机氮源的利用：采用ISP9作为基础培养基，硝酸钾和硫酸铵的浓度均为0.1％，见表3。
c)降解试验和NaCl耐受实验采用基础培养基为GYEA(pH6.8)，各种降解物的浓度及降解试验结果见表4；NaCl耐受实验结果见表8。
d)过氧化氢酶试验、pH试验和温度试验均采用ISP2培养基。过氧化氢酶试验结果见表5，pH试验结果见表6，温度试验结果见表7。
e)M.R、V-P等实验采用《常见细菌系统鉴定手册》方法，结果见表5。
f)除温度实验外，均为28℃培养7～10天。
表3菌株DHE020的碳源和氮源的利用情况
表4菌株DHE 020的降解试验结果
表5菌株DHE020主要的生理生化特征
表6菌株DHE020生长的pH试验
表7菌株DHE020生长的温度试验
表8菌株DHE020对NaCl的耐受性
备注：表3-8中，0：无生长；1：生长很弱；2：能生长，有少量孢子；3：生长良好，有大量孢子；4：生长最好，有丰富孢子；+：阳性；-：阴性。
实施例3菌种鉴定
1、普拉特链霉菌DHE020的16S rDNA序列分析
参照《分子克隆实验指南》书中的有关内容进行实验。收集菌丝体，然后用放线菌DNA提取试剂盒抽提总DNA。采用通用引物27F(27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)/1495R(1495R 5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’)进行16S rDNA序列扩增，PCR产物检测采用0.8％琼脂糖凝胶电泳，PCR产物纯化回收采用SanPrep柱式PCR纯化产物试剂盒，纯化后的PCR产物直接送南京金斯瑞生物科技有限公司进行序列测定。
菌株DHE020所测的16S rDNA的序列经校对后，与GenBank数据库中相关种、属的序列进行同源序列BLAST比较，以确定该菌株的分类地位。
菌株DHE020所测得到的16S rDNA序列(SEQ ID NO:1)，提交NCBI与GenBank中相关序列进行BLAST比较，结果见表9(表中只列出同源性较高的模式菌株)。
表9菌株DHE020和典型模式菌株的同源性
通过对菌株DHE020(CGMCC NO.23602)16S rDNA区域进行测序，与GenBank数据库中相关种、属的序列进行同源序列BLAST比较，发现其与链霉菌(Streptomyces platensisstrain YBQ90、Streptomyces platensis strain LCQ38、Streptomyces sp.strain H197和Streptomyces platensis strain ATCC 23948)同源性均高达99.48％，与普拉特链霉菌Streptomyces platensis YBQ90和LCQ38同源性均为100％，同时对菌株DHE020进行表观特征试验，发现该菌株和普拉特链霉菌属(Streptomyces platensis)分类相关参数非常接近，故将菌株DHE020鉴定为普拉特链霉菌属(Streptomyces platensis)菌株。
实施例4制备假尿苷和1-甲基-假尿苷发酵液
(1)斜面孢子的制备与培养：
斜面培养基配方(g/L)：酵母抽提粉10g/L，麦芽抽提物5g/L，葡萄糖10g/L，琼脂20.0g/L，消前pH 7.2～7.4，试管30×200mm，装量15mL，经121℃灭菌20min，冷却至55-60℃左右摆斜面，待冷却凝固后，接种一环孢子或菌丝体至斜面，28±1℃培养7～10天后，孢子成熟。
(2)种子液的制备与培养：
种子培养基配方(g/L)：葡萄糖20g/L、工业糖蜜10g/L、玉米淀粉10g/L、黄豆饼粉10g/L、酵母膏5g/L、碳酸钙5g/L，硫酸镁5g/L，磷酸氢二钾3g/L。消前pH 7.0；250mL规格的三角摇瓶，装量50mL，121℃灭菌20min。接种107～108cfu/mL至种子培养基中，28±1℃，250rpm振荡培养48小时，此时培养液pH 6.8-7.2，菌丝体浓度15-25％(体积百分比)。
(3)发酵培养基的制备与培养：
发酵培养基配方(g/L)：
玉米淀粉8g/L、乳糖5g/L、葡萄糖5g/L、工业糖蜜10g/L、蛋白胨3g/L、黄豆饼粉10g/L、玉米浆干粉5g/L、硫酸镁2g/L、硫酸铵2g/L、硫酸锰1g/L、碳酸钙5g/L。消前pH 5.0。250mL规格的三角摇瓶，装量20mL，121℃灭菌20min。将种子液以10％(体积比)的接种量接入。在20±1℃，250rpm振荡培养120小时。
经HPLC方法检测发酵液中假尿苷和1-甲基-假尿苷的含量，测得分别为840mg/L和325mg/L。
实施例5制备假尿苷和1-甲基-假尿苷发酵液
(1)斜面培养基配方及培养条件同实施例4中步骤(1)；
(2)种子培养基配方及培养条件同实施例4中步骤(2)；
(3)发酵培养基的制备与培养：
玉米淀粉20g/L、乳糖20g/L、葡萄糖30g/L、工业糖蜜30g/L、蛋白胨8g/L、黄豆饼粉15g/L、玉米浆干粉10g/L、硫酸镁5g/L、硫酸铵5g/L、硫酸锰3g/L、碳酸钙20g/L。消前pH6.0。250mL规格的三角摇瓶，装量20mL，121℃灭菌20min。将种子液以10％(体积比)的接种量接入。在25±1℃，250rpm振荡培养72小时。
经HPLC方法检测发酵液中假尿苷和1-甲基-假尿苷的含量，测得含量分别为950mg/L和530mg/L。
实施例6制备假尿苷发酵液
(1)斜面培养基配方及培养条件同实施例4中步骤(1)；一级种子培养基配方及培养条件同实施例4中步骤(2)。
(2)种子罐种子液的制备：
种子罐中种子液培养基配方同实施例4中步骤(2)中种子培养基；
在15L的种子罐中投入10L的种子培养基，用蒸汽灭菌，121℃灭菌20min，待冷却至28℃后接入一级的摇瓶种子液200mL。搅拌转速200rpm，通气量1.0vvm，28±1℃培养48小时，此时种子液pH7.0-7.4，菌丝浓度20-30％(体积比)。
(3)发酵罐发酵液的制备：
发酵培养基的配方
玉米淀粉60g/L、乳糖50g/L、葡萄糖60g/L、工业糖蜜50g/L、蛋白胨15g/L、黄豆饼粉20g/L、玉米浆干粉20g/L、硫酸镁10g/L、硫酸铵8g/L、硫酸锰5g/L、碳酸钙30g/L。消前pH7.0。
发酵罐体积50L，投料体积30L，用蒸汽灭菌，121℃，20min，待冷却至28℃后接入种子罐种子液3L。搅拌转速300-600rpm(转速在前3天逐渐从300rpm升至600rpm)，通气量2.0vvm，30±1℃培养168小时。
经HPLC方法检测发酵液中假尿苷和1-甲基-假尿苷的含量，测得含量分别为1080mg/L和720mg/L。
序列表
<110> 浙江珲达生物科技有限公司
<120> 一种普拉特链霉菌及其发酵产假尿苷和1-甲基-假尿苷的方法
<130> P0102021110842
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1525
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acggagagtt tgatcctggc tcaggacgaa cgctggcggc gtgcttaaca catgcaagtc 60
gaacgatgaa cctccttcgg gaggggatta gtggcgaacg ggtgagtaac acgtgggcaa 120
tctgcccttc actctgggac aagcctggaa acggggtcta ataccggata cgacctccga 180
ccgcatggtc tggtggtgga aagctccggc ggtgaaggat gagcccgcgg cctatcagct 240
tgttggtggg gtgatggcct accaaggcga cgacgggtag ccggcctgag agggcgaccg 300
gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg 360
cacaatgggc gaaagcctga tgcagcgacg ccgcgtgagg gatgacggcc ttcgggttgt 420
aaacctcttt cagcagggaa gaagcgagag tgacggtacc tgcagaagaa gcgccggcta 480
actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta gggcgcaagc gttgtccgga attattgggc 540
gtaaagagct cgtaggcggc ttgtcgcgtc ggatgtgaaa gcccggggct taaccccggg 600
tctgcattcg atacgggcag gctagagttc ggtaggggag atcggaattc ctggtgtagc 660
ggtgaaatgc gcagatatca ggaggaacac cggtggcgaa ggcggatctc tgggccgata 720
ctgacgctga ggagcgaaag cgtggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccacg 780
ccgtaaacgt tgggaactag gtgtgggcga cattccacgt cgtccgtgcc gcagctaacg 840
cattaagttc cccgcctggg gagtacggcc gcaaggctaa aactcaaagg aattgacggg 900
ggcccgcaca agcagcggag catgtggctt aattcgacgc aacgcgaaga accttaccaa 960
ggcttgacat acaccggaaa accctggaga cagggtcccc cttgtggtcg gtgtacaggt 1020
ggtgcatggc tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc 1080
aacccttgtt ctgtgttgcc agcatgccct tcggggtgat ggggactcac aggagactgc 1140
cggggtcaac tcggaggaag gtggggacga cgtcaagtca tcatgcccct tatgtcttgg 1200
gctgcacacg tgctacaatg gccggtacaa tgagctgcga taccgcgagg tggagcgaat 1260
ctcaaaaagc cggtctcagt tcggattggg gtctgcaact cgaccccatg aagtcggagt 1320
tgctagtaat cgcagatcag cattgctgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc 1380
gcccgtcacg tcacgaaagt cggtaacacc cgaagccggt ggcccaaccc cttgtgggag 1440
ggaatcgtcg aaggtgggac tggcgattgg gacgaagtcg taacaaggta gccgtaccgg 1500
aaggtgcggc tggatcacct ccttt 1525

Claims (20)

1.一种普拉特链霉菌（Streptomyces platensis）DHE020，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC NO.23602，保藏日期为2021年10月14日。
2.一种含权利要求1所述的普拉特链霉菌（Streptomyces platensis）DHE020的发酵液。
3.权利要求1所述的普拉特链霉菌（Streptomyces platensis）DHE020或权利要求2所述的发酵液在制备假尿苷和/或1-甲基-假尿苷中的应用。
4.权利要求1所述的普拉特链霉菌（Streptomyces platensis）DHE020或权利要求2所述的发酵液在制备含有假尿苷和/或1-甲基-假尿苷的药物组合物中的应用。
5.一种假尿苷和/或1-甲基-假尿苷的制备方法，其特征在于：采用如权利要求1所述的普拉特链霉菌（Streptomyces platensis）DHE020进行发酵制备。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的发酵过程在含有可同化的碳源和/或氮源的营养培养基里，进行有氧发酵。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述可同化的碳源选自玉米淀粉、麦芽糊精、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、工业糖蜜、甘油、豆油、山梨醇、甘露醇之一或者上述物质的组合。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述可同化的氮源选自酵母抽提粉、酵母粉、酵母膏、大豆卵磷脂、黄豆饼粉、棉籽饼粉、花生饼粉、麸质粉、玉米浆干粉、豆粕、蛋白胨、尿素、铵盐之一或者上述物质的组合。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述营养培养基还包括无机盐。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述无机盐选自柠檬酸三钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸铵、碳酸钙、硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸铜、氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、氯化铁、硫酸锰之一或上述物质任意几种的组合。
11.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述营养培养基含有玉米淀粉8-60 g/L、乳糖5-50 g/L、葡萄糖5-60 g/L、工业糖蜜10-50 g/L、蛋白胨3-15 g/L、黄豆饼粉10-20 g/L、玉米浆干粉5-20 g/L、硫酸镁2-10 g/L、硫酸铵2-8 g/L、硫酸锰 1-5 g/L、碳酸钙5-30g/L。
12.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述有氧发酵的温度为20-35℃；培养基pH为5 .0-8 .0；培养时间为24-240小时；通氧量为0 .1-2 .0vvm。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：所述有氧发酵的温度为20-30℃。
14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：所述有氧发酵的培养基pH为5 .0-7.0。
15.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：所述有氧发酵的培养时间为72-168小时。
16.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：所述有氧发酵的通氧量为0 .8-2.0vvm。
17.根据权利要求6-16任一项所述的方法，其特征在于：所述普拉特链霉菌（Streptomyces platensis）DHE020是通过种子液接种至所述营养培养基中进行所述发酵培养的；所述种子液是将权利要求1所述的普拉特链霉菌（Streptomyces platensis）DHE020在种子培养基里进行种子培养得到的；
所述的种子培养基含有葡萄糖5-30g/L、工业糖蜜 10-30 g/L、玉米淀粉5-20g/L、黄豆饼粉2-10g/L、酵母膏1-10g/L、碳酸钙1-20g/L，硫酸镁1-10g/L，磷酸氢二钾1-10g/L；
种子培养的温度为20℃-30℃；培养基pH为5 .0-8 .0；培养时间为24-80小时。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于：所述种子培养的温度为23℃-28℃。
19.根据权利要求17所述的方法，其特征在于：所述种子培养的培养基pH为5 .0-7 .0。
20.根据权利要求17所述的方法，其特征在于：所述种子培养培养时间为24-60小时。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104988083A (zh) * 2014-08-13 2015-10-21 长沙天赐生物医药科技有限公司 普拉特链霉菌及其在生产平板霉素和平板素方面的应用
CN112592880A (zh) * 2020-12-31 2021-04-02 浙江珲达生物科技有限公司 一种产假尿苷工程菌及其应用
CN112746036A (zh) * 2020-12-08 2021-05-04 浙江珲达生物科技有限公司 一种链霉菌及其发酵产假尿苷的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104988083A (zh) * 2014-08-13 2015-10-21 长沙天赐生物医药科技有限公司 普拉特链霉菌及其在生产平板霉素和平板素方面的应用
CN112746036A (zh) * 2020-12-08 2021-05-04 浙江珲达生物科技有限公司 一种链霉菌及其发酵产假尿苷的方法
CN112592880A (zh) * 2020-12-31 2021-04-02 浙江珲达生物科技有限公司 一种产假尿苷工程菌及其应用

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