CN108676757B - 一株链霉菌属菌株及其产星孢菌素的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种新的链霉菌菌株及其应用，该菌株命名为链霉菌(streptomyce sp.)HS‑HY‑153，其保藏编号为CGMCC NO.14806；同时公开了通过培养该菌株HS‑HY‑153制备星孢菌素(Staurosporine)的方法。

Description

一株链霉菌属菌株及其产星孢菌素的应用
技术领域
本发明属于微生物工程技术领域，尤其涉及一株链霉菌属菌株及其在制备星孢菌素中的应用。
背景技术
星孢菌素(staurosporine，结构式如式1所示)，最初发现于Streptomycesstaurosporeus(AM-2282)菌株的发酵产物中，具有抗细菌，抗真菌，降血压，血小板凝聚，抗肿瘤以及神经保护等多种生物活性，尤其是作为蛋白激酶C的有效抑制剂，在治疗癌症方面极具研究开发的价值。2017年4月28日，FDA批准其半合成药物米哚妥林(Midostaurin，商品名为Rydapt，结构式如式2所示)与化疗疗法联合用于新确诊的急性髓系白血病(acutemyeloid leukemia，AML)成年患者的治疗，适用于有特定基因突变FLT3的患者。同时，Rydapt被批准与伴随诊断试剂LeukoStrat CDx FLT3Mutation Assay一起使用，用来检测AML患者的FLT3突变。另外，除AML之外，Rydapt也被批准用于患有某些类型罕见血液障碍的成年患者的治疗，包括侵袭性系统性肥大细胞增生症(ASM)、伴有血液肿瘤的系统性肥大细胞增生症(SM-AHN)和肥大细胞白血病(MCL)。
Figure BDA0001684506980000011
当前已报道的星孢菌素产生菌很多，US7608420B和EP0444503A公开了利用Streptomyces hygroscopicus C39280-450-9(ATCC 53730)发酵制备星孢菌素，其发酵单位分别为392mg/L、130mg/L；US4107297公开了星孢菌素产生菌Streptomyces sp.AM-2282(Streptomyces staurosporeus nov.sp.NRRL11184)的形态学特征、培养特征和生理生化特征；盖翠娟等(中国抗生素杂志，2015，40(5)：325-329)对海洋链霉菌Streptomycessp.YB-24进行了诱变育种，使得生产星孢菌素发酵单位为3.833mg/L；庄以彬等(中国海洋药物，2011，30(2)：29-33)以海洋链霉菌Streptomyces fradiae 007、Streptomycesarenae Z4007和Streptomyces rubrolavendulae THW-12为出发菌株进行复合诱变选育，其发酵单位较低，为9.06ug/mL；Byung-Yong Kim等(International Journal ofSystematic and Evolutionary Microbiology，2012，62：966-970)发表了星孢菌素产生菌Streptomyces staurosporininus sp.nov.，对其进行了形态学、生理生化、分子生物学的鉴定，但并未发表其发酵生产工艺和发酵单位。蒲小明等(微生物学通报，2009，36(11)：1631-1637)通过对海洋放线菌H41-38进行了发酵工艺优化，使得星孢菌素的发酵单位达到286.44ug/mL。
综上所述，公开的专利及文献中星孢菌素的生产菌虽然较多，但菌株比较原始，发酵单位水平低，不适合产业化。因此寻找一种新的、高效的星孢菌素的生产菌株的工作仍在继续进行中。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种新的链霉菌(Streptomyce sp.)HS-HY-153，具有产生星孢菌素的能力，其保藏编号为CGMCC NO.14806。
本发明的目的还在于提供了一种新的链霉菌HS-HY-153(CGMCC NO.14806)在制备星孢菌素或含有星孢菌素的药物组合物中的应用。
本发明还提供了一种星孢菌素的制备方法。该方法包括采用链霉菌HS-HY-153(CGMCC NO.14806)在含有可同化的碳源和/或氮源的营养培养基里进行有氧发酵的过程。
在优选的实施方案中，所述可同化的碳源选自玉米淀粉、玉米可溶性淀粉、麦芽糊精、蔗糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇、甘油、麦芽糖、乳糖、半乳糖、木聚糖、工业糖蜜、豆油、油酸甲酯之一或者上述物质的组合。
在优选的实施方案中，所述可同化的氮源选自牛肉抽提粉、牛肉浸膏、酵母浸膏、酵母抽提物、麦芽抽提粉、酵母粉、蛋白胨、麸质粉、小麦麸、小麦胚芽片、棉籽饼粉、棉籽精粉、花生饼粉、黄豆饼粉、小麦胚芽粉、大豆粉、鱼粉、玉米浆干粉、玉米粉、尿素、铵盐、硝酸盐之一或者上述物质的组合。
在优选的实施方案中，所述营养培养基还包括无机盐，所述无机盐选自硫酸锌、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸铜、硫酸锰、磷酸氢二铵、氯化钾、氯化钠、氯化镁、氯化钴、钼酸钠、柠檬酸三钠、碳酸钙、氯化钙之一或者上述物质的组合。
在优选的实施方案中，所述营养培养基含有葡萄糖0～30.0g/L、甘油5.0～90.0g/L、花生饼粉5.0～60.0g/L、酵母粉3.0～20.0g/L、黄豆饼粉0～40.0g/L，小麦胚芽片0～30.0g/L、大豆粉0～40.0g/L、硫酸镁0～5.0g/L、碳酸钙1.0～5.0g/L、硫酸亚铁0～5.0×10-2g/L、硫酸锌0～5.0×10-5g/L、硫酸锰0～2.0×10-4g/L、氯化钴0～5.0×10-5g/L、钼酸钠0～2.0×10-4g/L。
在优选的实施方案中，所述有氧发酵的温度为20℃-30℃，优选24℃-28℃；培养基pH为6.0-8.0，优选7.0-7.8；培养时间为24-300小时，优选120-168小时。
在优选的实施方案中，所述链霉菌HS-HY-153是通过种子液接种至所述营养培养基中进行所述发酵培养的；
其中所述种子液是将链霉菌HS-HY-153在种子培养基里进行种子培养得到的；所述种子培养的条件为：种子培养的温度为20℃-30℃，优选24℃-28℃；培养基pH为6.0-8.0，优选6.5-7.8；培养时间为17-80小时，优选19-72小时。
在优选的实施方案中，所述的种子培养基含有玉米淀粉2.0～40.0g/L、葡萄糖0～20.0g/L、麦芽糊精0～10.0g/L、甘油5.0～50.0g/L、花生饼粉5.0～40.0g/L、酵母粉5.0～20.0g/L、黄豆饼粉0～10.0g/L，碳酸钙1.0～4.0g/L。
本发明星孢菌素可通过以下条件进行HPLC检测：
色谱柱：C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；
流动相：甲醇:水:氨水＝85:15:0.1(v/v/v)；
进样量：20uL；
流速：1.0mL/min；
检测波长：254nm；
本发明链霉菌HS-HY-153(CGMCC NO.14806)的微生物菌种于2017年10月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，其保藏编号为CGMCC NO.14806，分类命名为链霉菌streptomyce sp.，并登记入册，证明存活。
本发明链霉菌HS-HY-153(CGMCC NO.14806)主要生物学特征为：菌落形态圆整，表面凸起，菌落直径大小约5～7mm，菌落表面光滑，有沟纹，中间偶稍凹陷，基质菌丝发达，与培养基结合紧密，不易挑起，颜色呈无色、米色或淡黄色，气生菌丝白色，产孢丰富，前期青色，后期转深青色、青灰色、玛瑙灰，无可溶性色素。
本发明菌株HS-HY-153生产能力高；且其产生星孢菌素的能力比现有技术中其他菌种有了大幅度的提高，有利于实现工业化生产。
附图说明：
图1为菌株HS-HY-153(CGMCC NO.14806)在ISP2培养基上的显微镜检图(400×)。
图2为菌株HS-HY-153(CGMCC NO.14806)在ISP2培养基上的菌落特征图。
图3为菌株HS-HY-153(CGMCC NO.14806)在ISP1、ISP3、ISP4、ISP5、苹果酸钙、高氏一号、营养琼脂培养基上的菌落特征图。
具体实施方式：
下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中采用的材料、试剂等如无特殊说明，皆为普通市售品，皆可于市场购得。
其中所用放线菌DNA提取试剂盒购自北京三博远志生物技术有限责任公司；
PCR产物纯化回收所用的SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明，应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例1：菌株来源
本发明链霉菌HS-HY-153(CGMCC NO.14806)系从浙江天台山的土壤样品中分离得到原始菌株，再通过诱变选育得到的。
原始菌株在ISP2斜面培养基中28℃培养7～10天后，在无菌条件下用接种铲将菌丝体刮下制得菌悬液，供NTG(亚硝基胍)诱变处理。
称取NTG晶体2mg，溶解在2mL无菌Tris缓冲液(pH6.0)中。用移液管吸取1mLNTG溶液加入到1mL菌悬液，于28℃旋转式或往复式摇床上振荡处理1小时。其余具体步骤如下：
(1)菌丝体的制备与培养
固体培养基配方：ISP2，经121℃灭菌20分钟后，冷却至50-60℃倒平板，将诱变处理过的菌悬液经适当稀释，吸取0.2mL菌液涂布ISP2平板上，未作诱变处理的菌悬液亦经适当稀释涂布于ISP2平板作为对照，置28℃恒温培养箱培养，菌落培养7天菌丝成熟。
(2)种子液的制备与培养
种子培养基配方(g/L)：酵母粉7.5g/L，葡萄糖8.0g/L，玉米淀粉10.0g/L，甘油20.0g/L，花生饼粉20.0g/L，碳酸钙2.0g/L，消前pH 7.2～7.4；三角摇瓶装液量25mL/250mL，121℃灭菌20min。每个种子摇瓶接种约0.5个菌落，28±1℃、250rpm振荡培养24小时。
(3)发酵培养基的制备与培养
发酵培养基配方(g/L)：甘油50.0g/L，葡萄糖5.0g/L，花生饼粉20.0g/L，酵母粉5.0g/L，碳酸钙3.0g/L，消前pH 7.4～7.6；三角摇瓶装液量20mL/250mL，121℃灭菌20min。将种子液以5～10％(体积比)的接种量接入发酵培养基，培养温度28±1℃，转速250rpm，培养120小时。
挑选经过NTG诱变处理后的单菌落800株，进行摇瓶发酵，HPLC方法检测发酵液中星孢菌素的含量，筛选出产星孢菌素最高产的菌株即为链霉菌HS-HY-153(CGMCCNO.14806)。
实施例2：链霉菌HS-HY-153(CGMCC NO.14806)的形态学、培养学特征、生理生化特征。
参照《链霉菌鉴定手册》、《放线菌的分类与鉴定》、《常见细菌系统鉴定手册》等书中的有关内容进行实验：颜色的判断参照RAL K7色卡中的颜色进行对照。
1、菌株的形态学特征：将菌株HS-HY-153(CGMCC NO.14806)接种于ISP2培养基中进行插片培养，28℃培养3-5天后取盖玻片于载片中，在光学显微镜下400×倍观察，结果见图1。
2、菌株培养学特征：菌株HS-HY-153(CGMCC NO.14806)在ISP2培养基上28℃条件下培养7～10天后，菌落形态圆整，表面凸起，菌落直径大小约5～7mm，菌落表面光滑，有沟纹，中间偶稍凹陷，基质菌丝发达，与培养基结合紧密，不易挑起，颜色呈淡黄色，气生菌丝白色，产孢丰富，前期青色，后期转深青色、青灰色，无可溶性色素，结果见图2。
其他培养学特征则采用ISP1、ISP3、ISP4、ISP5、苹果酸钙、高氏一号、营养琼脂7种培养基，28℃条件下培养7～10天后，观察其菌落、菌丝、孢子及色素产生情况，结果如表1和图3所示。
表1菌株HS-HY-153(CGMCC NO.14806)在7种培养基上的培养特征
Figure BDA0001684506980000051
3、生理生化特征试验：结果表2～表7。
a)碳源的利用：采用ISP9作为基础培养基，各种碳源的终浓度均为1.0％，见表2。
b)无机氮源的利用：采用ISP9作为基础培养基，硝酸钾和硫酸铵的浓度均为0.1％，见表2。
c)降解试验和NaCl耐受实验采用基础培养基为GYEA(pH6.8)，各种降解物的浓度及降解试验结果见表3；NaCl耐受实验结果见表7。
d)过氧化氢酶试验、pH试验和温度试验均采用ISP2培养基。过氧化氢酶试验结果见表4，pH试验结果见表5，温度试验结果见表6。
e)M.R、V-P等实验采用《常见细菌系统鉴定手册》方法，结果见表4。
f)除温度实验外，均为28℃培养7～10天。
表2菌株HS-HY-153(CGMCC NO14806)的碳源和氮源的利用情况
碳源 生长情况 碳源 生长情况 无机氮源 生长情况
D-葡萄糖 4 水杨苷 2 硫酸铵 +
D-棉子糖 2 D-乳糖 2 硝酸钾 -
D-木糖 2 半乳糖 3
D-山梨醇 2 肌醇 2
L-阿拉伯糖 2 甘露醇 3
甘油 2 甘氨酸 2
麦芽糖 2 木聚糖 4
D-果糖 2 菊粉 2
D-蔗糖 2 鼠李糖 2
表3菌株HS-HY-153(CGMCC NO.14806)的降解试验结果
降解物 降解物浓度 结果* 降解物 降解物浓度 结果
腺嘌呤 0.5％ 2，- 酪蛋白 1.0％ 4，-
鸟嘌呤 0.5％ 4，- 酪氨酸 1.0％ 4，+
黄嘌呤 0.4％ 4，- Tween-40 1.0％ 2，-
木聚糖 0.4％ 4，- Tween-60 1.0％ 2，-
次黄嘌呤 0.4％ 4，+ Tween-80 1.0％ 2，-
表4菌株HS-HY-153(CGMCC NO.14806)主要的生理生化特征
试验项目 结果 试验项目 结果 试验项目 结果
明胶液化 + 牛奶胨化 - 纤维素利用 -
淀粉水解 + 硝酸盐还原 - 过氧化氢酶 +
牛奶凝固 - 硫化氢产生 -
V.P实验 - M.R实验 -
表5菌株HS-HY-153(CGMCC NO.14806)生长的pH试验
Figure BDA0001684506980000061
Figure BDA0001684506980000071
表6菌株HS-HY-153(CGMCC NO.14806)生长的温度试验
温度(℃) 7 14 28 37 45
生长情况 2 4 4 0 0
表7菌株HS-HY-153(CGMCC NO.14806)对NaCl的耐受性
NaCl浓度(％) 1.0 4.0 7.0 10.0
菌株生长情况 4 3 0 0
*注：表2-7中：0，无生长；1，生长很弱；2，能生长，有少量孢子；3，生长良好，有大量孢子；4，生长最好，有丰富孢子；+，阳性；-，阴性。
实施例3：菌种鉴定
1、链霉菌HS-HY-153(CGMCC NO.14806)的16S rDNA序列分析
参照《分子克隆实验指南》书中的有关内容进行实验。收集菌丝体，然后用放线菌DNA提取试剂盒抽提总DNA。采用通用引物27F(SEQ ID NO:1)/1495R(SEQ ID NO:2)进行16SrDNA序列扩增，扩增体系和PCR反应程序如表8所示，PCR产物检测采用0.8％琼脂糖凝胶电泳，PCR产物纯化回收采用SanPrep柱式PCR纯化产物试剂盒，纯化后的PCR产物直接送南京金斯瑞生物科技有限公司进行序列测定。
表8 PCR扩增体系和反应程序
Figure BDA0001684506980000072
菌株HS-HY-153(CGMCC NO.14806)所测的16S rDNA的序列经校对后，与GenBank数据库中相关种、属的序列进行同源序列BLAST比较，以确定该菌株的分类地位。
菌株HS-HY-153(CGMCC NO.14806)所测得到的16S rDNA序列(SEQ ID NO:3)，提交NCBI与GenBank中相关序列进行BLAST比较，结果见表9(表中只列出同源性较高的模式菌株)。
表9菌株HS-HY-153(CGMCC NO.14806)和典型模式菌株的同源性
Taxon Name GenBank No. Similarity(％)
Streptomyces xanthophaeusNRRL B-5414(T) JOTT01000080 99.45
Streptomyces cirratusNRRL B-3250(T) AY999794 99.45
Streptomyces spororaveusLMG 20313(T) AJ781370 99.45
Streptomyces nojiriensisLMG 20094(T) AJ781355 99.45
Streptomyces vinaceusNBRC 13425(T) AB184394 99.44
Streptomyces sporoverrucosusNBRC 15458(T) AB184684 99.44
Streptomyces goshikiensisNBRC 12868(T) AB184204 99.44
Streptomyces colombiensisNRRL B-1990(T) DQ026646 99.38
Streptomyces lavendulae subsp.lavendulaeNRRL B-2774(T) JOEW01000098 99.38
Streptomyces avidiniiNBRC 13429(T) AB184395 99.17
通过对菌株HS-HY-153(CGMCC NO.14806)16S rDNA区域进行测序，与GenBank数据库中相关种、属的序列进行同源序列BLAST比较，发现其与黄暗色链霉菌(Streptomycesxanthophaeus)、卷须链霉菌(Streptomyces cirratus)、孢淡灰链霉菌(Streptomycesspororaveus)、野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)同源性均高达99.45％，同时对菌株HS-HY-153(CGMCC NO.14806)进行表观特征试验，发现该菌株和链霉菌属(streptomycessp.)分类相关参数非常接近，故将菌株HS-HY-153(CGMCC NO.14806)鉴定为链霉菌属(streptomyces sp.)菌株。
2、本发明链霉菌HS-HY-153(CGMCC NO.14806)与其他星孢菌素产生菌的比较如下：
US7608420B和EP0444503A公开了Streptomyces hygroscopicus C39280-450-9(ATCC 53730)生产星孢菌素的发酵单位分别为392mg/L、130mg/L，而本发明HS-HY-153(CGMCC NO.14806)的发酵单位高达1540mg/L。
US4107297公开了Streptomyces sp.AM-2282(后命名为Streptomycesstaurosporeus nov.sp.NRRL11184)的形态学特征、培养学特征和生理生化特征，本发明菌HS-HY-153(CGMCC NO.14806)与Streptomyces sp.AM-2282的培养学特征比较见表10，与Streptomyces sp.AM-2282的生理生化特征比较见表11。从表10和表11可以看出本发明菌HS-HY-153(CGMCC NO.14806)与Streptomyces sp.AM-2282在培养学特征、牛奶凝固、牛奶胨化、纤维素利用等生理生化特征方面均存在不同。
表10菌株HS-HY-153(CGMCC NO.14806)与菌株Streptomyces sp.AM-2282的培养学特征比较
Figure BDA0001684506980000081
Figure BDA0001684506980000091
表11菌株HS-HY-153(CGMCC NO.14806)与菌株Streptomyces sp.AM-2282的生理生化特征比较
Figure BDA0001684506980000092
注：表11中0，无生长；1，生长很弱；2，能生长，有少量孢子；3，生长良好，有大量孢子；4，生长最好，有丰富孢子；+，阳性；-，阴性，w，疑/弱阳性。
庄以彬等(中国海洋药物，2011，30(2)：29-33)报道了通过对菌株Streptomycesfradiae 007、Streptomyces arenae Z4007和Streptomyces rubrolavendulae THW-12进行复合诱变选育来提高星孢菌素发酵单位，结果从菌株Streptomyces fradiae 007中得到一株高产菌株，发酵发酵单位从原来的1.02mg/L提高至9.06mg/L，而本发明HS-HY-153(CGMCC NO.14806)的发酵单位可高达1540mg/L。
盖翠娟等(中国抗生素杂志，2015，40(5)：325-329)对Streptomyces sp.YB-24进行紫外线和氯化锂复合诱变后得到高产菌株，其代谢星孢菌素发酵单位的能力为3.833mg/L，而本发明HS-HY-153(CGMCC NO.14806)生产星孢菌素发酵单位最高为1540mg/L。
Byung-Yong Kim等(International Journal of Systematic and EvolutionaryMicrobiology，2012，62：966-970)公开了星孢菌素产生菌Streptomycesstaurosporininus sp.nov.在ISP4培养基上的培养特征和生理生化特征，本发明菌HS-HY-153(CGMCC NO.14806)与Streptomyces staurosporininus sp.nov.在ISP4培养基上的培养特征比较和生理生化特征比较见表12。从表12中可看出本发明菌HS-HY-153(CGMCCNO.14806)与Streptomyces staurosporininus sp.nov.在ISP4培养基上的培养特征不同，在硝酸盐还原、硫化氢产生、酪蛋白降解、木聚糖降解、果糖利用等生理生化特性方面均存在不同。
表12菌株HS-HY-153(CGMCC NO.14806)与菌株Streptomyces staurosporininussp.nov.培养特征和生理生化特征比较
Figure BDA0001684506980000101
注：表12中0，无生长；1，生长很弱；2，能生长，有少量孢子；3，生长良好，有大量孢子；4，生长最好，有丰富孢子；+，阳性；-，阴性。
蒲小明等(微生物学通报，2009，36(11)：1631-1637)报道的海洋放线菌H41-38，经过对发酵条件进一步调整后，其发酵生产星孢菌素的发酵单位达286.44ug/mL，而本发明HS-HY-153(CGMCC NO.14806)生产星孢菌素发酵单位最高为1540mg/L。此外，马春秀在《链霉菌H4138的鉴定、诱变及其毒素混配杀虫增效研究》中公开了H4138(同H41-38)的生理生化特性和碳氮源的利用情况，本发明菌HS-HY-153(CGMCC NO.14806)与菌株H4138的培养学特征比较见表13，与菌株H4138的生理生化特征比较见表14；从表13和表14中可以看出，本发明HS-HY-153(CGMCC NO.14806)与菌株H4138在培养学特征、硫化氢产生、牛奶凝固、牛奶胨化、纤维素利用等生理生化特征方面均存在不同。
表13菌株HS-HY-153(CGMCC NO.14806)与菌株H4138的培养学特征比较
Figure BDA0001684506980000111
表14菌株HS-HY-153(CGMCC NO14806)与菌株H4138的生理生化特征比较
Figure BDA0001684506980000112
注：表14中0，无生长；1，生长很弱；2，能生长，有少量孢子；3，生长良好，有大量孢子；4，生长最好，有丰富孢子；+，阳性；-，阴性。
结合前述本发明的链霉菌HS-HY-153(CGMCC NO.14806)的形态学、培养特征、生理生化特征和16S rDNA序列鉴定结果，可知本发明的菌株HS-HY-153(CGMCC NO.14806)属于链霉菌属(streptomyces sp.)菌株，且不同于其他已知的星孢菌素产生菌，故本发明的链霉菌HS-HY-153(CGMCC NO.14806)是一株全新的星孢菌素产生菌菌种。
实施例4：制备含星孢菌素的发酵液
(1)斜面孢子的制备与培养：
斜面培养基配方(g/L)：酵母抽提粉4.0g/L，麦芽抽提物10.0g/L，葡萄糖4.0g/L，琼脂20.0g/L，消前pH 7.2～7.4，250mL规格的茄形瓶，装量60mL，经121℃灭菌20min，冷却至55℃左右摆斜面，待冷却凝固后放37℃培养箱1～2天后，接种一环孢子或菌丝体至斜面，28±1℃培养7～10天后，孢子成熟。
(2)种子液的制备与培养：
种子培养基配方(g/L)：酵母粉7.5g/L，葡萄糖8.0g/L，玉米淀粉10.0g/L，甘油20.0g/L，花生饼粉20.0g/L，碳酸钙2.0g/L，消前pH 7.2～7.4；250mL规格的三角摇瓶，装量25mL，121℃灭菌20min。接种107～108cfu/mL至种子培养基中，28±1℃，250rpm振荡培养22～24小时，此时培养液pH 6.8-7.2，菌丝体浓度8-10％(体积百分比)。
(3)发酵培养基的制备与培养：
发酵培养基配方(g/L)：甘油50.0g/L，葡萄糖5.0g/L，花生饼粉20.0g/L，酵母粉5.0g/L，碳酸钙3.0g/L，消前pH 7.4～7.6；250mL规格的三角摇瓶，装量20mL，121℃灭菌20min。将种子液以5～10％(体积比)的接种量接入。在28±1℃，250rpm振荡培养168小时。经HPLC方法检测发酵液中星孢菌素的含量，测得为1310ug/mL。
实施例5：制备含星孢菌素的发酵液
(1)斜面培养基配方及培养条件同实施例4中步骤(1)
(2)种子培养基配方及培养条件同实施例4中步骤(2)
(3)发酵培养基的制备与培养：
发酵培养基配方(g/L)：甘油70.0g/L，葡萄糖5.0g/L，花生饼粉40.0g/L，酵母粉5.0g/L，硫酸镁1.0g/L，碳酸钙3.0g/L，消前pH 7.4～7.6；250mL规格的三角摇瓶，装量20mL，121℃灭菌20min。将种子液以5～10％(体积比)的接种量接入。在28±1℃，250rpm振荡培养168小时。经HPLC方法检测发酵液中星孢菌素的含量，测得为1380ug/mL。
实施例6：制备含星孢菌素的发酵液
(1)斜面培养基配方及培养条件同实施例4中步骤(1)
(2)种子培养基配方及培养条件同实施例4中步骤(2)
(3)发酵培养基的制备与培养
发酵培养基配方(g/L)：甘油80.0g/L，花生饼粉40.0g/L，酵母粉5.0g/L，小麦胚芽片20.0g/L，硫酸镁1.0g/L，碳酸钙3.0g/L，硫酸亚铁5.0×10-2g/L，硫酸锌2.0×10-3g/L，消前pH7.4～7.6；250mL规格的三角摇瓶，装量20mL，121℃灭菌20min。将种子液以5～10％(体积比)的接种量接入。在28±1℃，250rpm振荡培养168小时。经HPLC方法检测发酵液中星孢菌素的含量，测得为1480ug/mL。
实施例7：制备含星孢菌素的发酵液
(1)斜面培养基配方及培养条件同实施例4中步骤(1)；一级种子培养基配方及培养条件同实施例4中步骤(2)。
(2)种子罐种子液的制备：
种子罐中种子液培养基配方同实施例4中步骤(2)中种子培养基；
在15L的种子罐中投入10L的种子培养基，用蒸汽灭菌，121℃灭菌20min，待冷却至28℃后接入一级的摇瓶种子液200mL。搅拌转速200rpm，通气量1.0vvm，28±1℃培养24小时，此时种子液pH 7.0-7.4，菌丝浓度12-15％(体积比)。
(3)发酵罐发酵液的制备：
发酵培养基的配方同实施例6中步骤(3)中发酵培养基；
发酵罐体积50L，投料体积30L，用蒸汽灭菌，121℃，20min，待冷却至28℃后接入种子罐种子液3L。搅拌转速200-400rpm(转速在前3天逐渐从200rpm升至320rpm)，通气量0.8～1.0vvm，28℃培养168小时。经HPLC方法检测发酵液中的星孢菌素的含量为1540ug/mL。
实施例8：星孢菌素的分离纯化与结构鉴定
将实施例7所得发酵液30L，离心(4000rpm；15min)得到菌丝体，菌丝体用丙酮提取两次，得到丙酮提取液。丙酮提取液经过真空浓缩至干后用乙酸乙酯萃取，即得含有星孢菌素的浸膏。浸膏硅胶拌样后，上硅胶柱，用99:1，98:2，97:3，96:4(V:V)的氯仿/甲醇梯度洗脱，分段收集洗脱流分，TLC检测(氯仿/甲醇＝9：1(V:V))，合并含有色谱纯度大于90％的流分，并真空浓缩至干得到粗品。星孢菌素粗品使用氯仿/甲醇＝1:1(V:V)重结晶得到纯品18.4g。
所得的纯品经过MS分析(ESI-MS m/z467[M+H]+)确定其分子量为466，其1H NMR(400MHz,CDCl3)数据如下：δ9.42(d,J＝7.7Hz,H-4),7.91(d,J＝8.4Hz,H-11),7.85(d,J＝7.7Hz,H-8),7.43(t,J＝7.7Hz,H-2),7.38(dd,J＝8.4,7.7Hz,H-10),7.35(t,J＝7.7Hz,H-3),7.31(t,J＝7.7Hz,H-9),7.27(d,J＝7.7Hz,H-1),6.54(br s,H-6),6.53(br d,J＝5.1Hz,H-6'),5.03(d,J＝15.5Hz,H-7a),4.95(d,J＝15.5Hz,H-7b),3.86(d,J＝3.3Hz,H-3'),3.38(s,H-3'-OMe),3.32(m,H-4'),2.70(dd,J＝14.7,3.1Hz,H-5'a),2.33(m,H-5'b),2.33(s,H-2'-Me),1.54(s,H-4'-NMe)，这些数据与参考文献(Hiroyuki Koshino,HiroyukiOsada and Kiyoshi Isono,A NEW INHIBITOR OF PROTEIN KINASE C,RK-1409(7-OXOSTAUROSPORINE)II.FERMENTATION,ISOLATION,PHYSICO-CHEMICAL PROPERTIES ANDSTRUCTUR.The Journal Of Antibiotics,45(2):195-198)对比，确定了其结构为星孢菌素。
序列表
<110> 浙江海正药业股份有限公司
<120> 一株链霉菌属菌株及其产星孢菌素的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列引物27F(人工序列)
<400> 1
gagagtttga tcctggctca g 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列引物1495R(人工序列)
<400> 2
ctacggctac cttgttacga 20
<210> 3
<211> 1557
<212> DNA
<213> 链霉菌（streptomyce sp.）(链霉菌（streptomyce sp.）)
<400> 3
attcgagctc ggtacccggg gatcctctag agattgagag tttgatcctg gctcaggacg 60
aacgctggcg gcgtgcttaa cacttgcaag tcgaacgatg aaacctttcg gggtggacta 120
gtggcgaacg ggtgagtaac acgtgggcaa tctgcccttc actctgggac aagccctgga 180
aacggggtct aataccggat actactcctg cctgcatggg tgggggttga aagctccggc 240
ggtgaaggat gagcccgcgg cctatcagct tgttggtggg gtaatggccc accaaggcga 300
cgacgggtag ccggcctgag agggcgaccg gccacactgg gactgagaca cggcccaggc 360
tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg cacaatgggc gaaagcctga tgcagcgacg 420
ccgcgtgagg gatgacggcc ttcgggttgt aaacctcttt cagcagggaa gaagcgagag 480
tgacggtacc tgcagaagaa gcgccggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta 540
gggcgcaagc gttgtccgga attattgggc gtaaagagct cgtaggcggc ttgtcacgtc 600
ggatgtgaaa gcccgaggct taacctcggg tctgcattcg atacgggcta gctagagtgt 660
ggtaggggag atcggaattc ctggtgtagc ggtgaaatgc gcagatatca ggaggaacac 720
cggtggcgaa ggcggatctc tgggccatta ctgacgctga ggagcgaaag cgtggggagc 780
gaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacgt tgggaactag gtgttggcga 840
cattccacgt cgtcggtgcc gcagctaacg cattaagttc cccgcctggg gagtacggcc 900
gcaaggctaa aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggcggag catgtggctt 960
aattcgacgc aacgcgaaga accttaccaa ggcttgacat ataccggaaa gcattagaga 1020
tagtgccccc cttgtggtcg gtatacaggt ggtgcatggc tgtcgtcagc tcgtgtcgtg 1080
agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgtc ctgtgttgcc agcatgccct 1140
tcggggtgat ggggactcac aggagaccgc cggggtcaac tcggaggaag gtggggacga 1200
cgtcaagtca tcatgcccct tatgtcttgg gctgcacacg tgctacaatg gccggtacaa 1260
tgagctgcga taccgtgagg tggagcgaat ctcaaaaagc cggtctcagt tcggattggg 1320
gtctgcaact cgaccccatg aagtcggagt cgctagtaat cgcagatcag cattgctgcg 1380
gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcacg tcacgaaagt cggtaacacc 1440
cgaagccggt ggcccaaccc gtaagggagg gagctgtcga aggtgggact ggcgattggg 1500
acgaagtcgt aacaaggtag ccgtagaatc gtcgacctgc aggcatgcaa gcttggc 1557

Claims (12)

1.一种链霉菌(Streptomyce sp.)HS-HY-153，其保藏编号为CGMCC NO.14806。
2.根据权利要求1所述的链霉菌HS-HY-153在制备星孢菌素或者含有星孢菌素的药物组合物中的应用。
3.一种星孢菌素的制备方法，其特征在于：包括采用如权利要求1所述的链霉菌HS-HY-153在含有可同化的碳源和/或氮源的营养培养基里进行有氧发酵的过程。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述可同化的碳源选自玉米淀粉、玉米可溶性淀粉、麦芽糊精、蔗糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇、甘油、麦芽糖、乳糖、半乳糖、木聚糖、工业糖蜜、豆油、油酸甲酯之一或者上述物质的组合。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述可同化的氮源选自牛肉抽提粉、牛肉浸膏、酵母浸膏、酵母抽提物、麦芽抽提粉、酵母粉、蛋白胨、麸质粉、小麦麸、小麦胚芽片、棉籽饼粉、棉籽精粉、花生饼粉、黄豆饼粉、小麦胚芽粉、大豆粉、鱼粉、玉米浆干粉、玉米粉、尿素、铵盐、硝酸盐之一或者上述物质的组合。
6.根据权利要求3-5任一项所述的方法，其特征在于：所述营养培养基还包括无机盐，所述无机盐选自硫酸锌、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸铜、硫酸锰、磷酸氢二铵、氯化钾、氯化钠、氯化镁、氯化钴、钼酸钠、柠檬酸三钠、碳酸钙、氯化钙之一或者上述物质的组合。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述营养培养基含有葡萄糖0～30.0g/L、甘油5.0～90.0g/L、花生饼粉5.0～60.0g/L、酵母粉3.0～20.0g/L、黄豆饼粉0～40.0g/L，小麦胚芽片0～30.0g/L、大豆粉0～40.0g/L、硫酸镁0～5.0g/L、碳酸钙1.0～5.0g/L、硫酸亚铁0～5.0×10-2g/L、硫酸锌0～5.0×10-5g/L、硫酸锰0～2.0×10-4g/L、氯化钴0～5.0×10-5g/L、钼酸钠0～2.0×10-4g/L。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述有氧发酵的温度为20℃-30℃；培养基pH为6.0-8.0；培养时间为24-300小时。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述有氧发酵的温度为24℃-28℃；培养基pH为7.0-7.8；培养时间为120-168小时。
10.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述链霉菌HS-HY-153是通过种子液接种至所述营养培养基中进行所述发酵培养的；
其中所述种子液是将权利要求1所述的链霉菌HS-HY-153在种子培养基里进行种子培养得到的；所述种子培养的条件为：种子培养的温度为20℃-30℃；培养基pH为6.0-8.0；培养时间为17-80小时。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述种子培养的温度为24℃-28℃；培养基pH为6.5-7.8；培养时间为19-72小时。
12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述的种子培养基含有玉米淀粉2.0～40.0g/L、葡萄糖0～20.0g/L、麦芽糊精0～10.0g/L、甘油5.0～50.0g/L、花生饼粉5.0～40.0g/L、酵母粉5.0～20.0g/L、黄豆饼粉0～10.0g/L，碳酸钙1.0～4.0g/L。
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