CN110832066B - 一种伊维菌素B1b产生菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

提供了一种伊维菌素B1b高产的除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)菌株C63‑51以及利用该菌株生产伊维菌素B1b的方法。利用上述菌株和方法，可以实现单一伊维菌素B1b的高效生产。

Description

一种伊维菌素B1b产生菌及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种伊维菌素B1b高产的除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)菌株及利用该菌株生产伊维菌素B1b的方法。
背景技术
伊维菌素对体内外寄生虫特别是线虫和节肢动物均具有高效驱杀作用。对于哺乳动物的机体组织有更强的渗透性和安全性，持效期更长，特别适用于一般口服驱虫剂难以到达的肌肉、器官和特殊组织中的寄生虫防治，对家畜的胃肠道线虫、外寄生虫有着特殊的疗效，是人们公认的具有广谱、高效、安全、残留少、无抗药性的多组分抗生素。
迄今为止，国内外报道的伊维菌素生产方法主要有两种：一种是用化学法对阿维菌素B1进行加氢选择性还原得到伊维菌素。该化学方法需要从阿维链霉菌的发酵液中分离、提纯阿维菌素B1后，将其还原成伊维菌素，该工艺的生产成本较高，其中伊维菌素B1b的产量仅有15％；且从阿维菌素B1化学合成伊维菌素B1b的工艺，杂质多，提纯工艺比较复杂，很难分离得到大量的伊维菌素B1b；另一种是使用基因工程菌生产伊维菌素，例如CN200510074936.X公开了将阿维链霉菌的阿维菌素聚酮合酶DH2－KR2结构域的编码基因替换为聚酮合酶DH－ER－KR结构域的编码基因得到产伊维菌素的工程菌的方法，其伊维菌素B1a的产量约为1-4μg/mL，但未提及伊维菌素B1b的产量；CN200910089970.2公开了将阿维链霉菌中编码麦芽糖转运蛋白的malEFG基因通过表达载体引入阿维链霉菌中获得麦芽糖转运蛋白过表达的重组菌，通过该重组菌过量表达麦芽糖转运系统基因来提高麦芽糖的利用效率的方法，该方法将伊维菌素的产量由约10μg/mL提高到约35μg/mL；PCT国际申请WO2015135242A1和WO2015135467A1公布了基因工程菌MA220的构建过程，基因工程菌MA220由除虫链霉菌MA-4680(Streptomyces avermitilis MA-4680)通过两步基因改造获得：首先通过PCR打靶(PCR targeting)技术将MA4680aveD基因失活，得到不产阿维菌素A组分只产阿维菌素B组分的基因工程菌AD28；然后通过基因重组技术将aveA1基因替换为吸水链霉菌(Streptomyces milbemycinicus)的milA1基因，得到重组链霉菌MA220。重组链霉菌MA220发酵产物中除主要组分天维菌素A(TEVA)和天维菌素B(TEVB)外，有极少量的伊维菌素B1b组分。上述通过基因工程构建新菌种生产伊维菌素的方法或者对实验条件和技术人员的技术水平要求较高，或者基因工程菌发酵产量不令人满意，基本上还停留在实验室阶段，不利于形成产业化。
综上，现有技术中伊维菌素的产量低，而且，产物或者均为伊维菌素B1a和B1b的混合物，或者为伊维菌素B1a，单一组分伊维菌素B1b的生产则尚未有关注。因此，现有技术中迫切需要寻找能够获得令人满意产量的伊维菌素尤其是伊维菌素B1b的新的微生物菌株及其制备方法。
本发明人意外地筛选得到直接发酵生产伊维菌素B1b的高产菌株，并进一步提供了利用该菌株生产伊维菌素B1b的方法。这一方面可以有效利用伊维菌素B1b，另一方面也可以为今后进一步研究伊维菌素B1b生物学活性和对其进行结构改造打下基础。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种能够产生伊维菌素B1b的新的高产菌株，以解决上述问题。
本发明的一个方面在于提供一种伊维菌素B1b高产微生物菌株。该菌株为除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)菌株C63-51，于2016年12月22日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC NO.13370，并登记入册，证明存活。
本发明的另一方面是提供除虫链霉菌菌株C63-51在生产伊维菌素B1b或含有伊维菌素B1b的药物组合物中的应用。
本发明的另一方面是提供一种利用除虫链霉菌菌株C63-51生产伊维菌素B1b的方法，该方法包括将除虫链霉菌菌株C63-51在含有可同化的碳源和/或氮源的培养基里进行发酵。
本发明还涉及一种组合物，其包含本发明的除虫链霉菌菌株C63-51。所述组合物可以是菌株组合物，其包含除菌株C63-51以外的其他菌株；优选地，所述其他菌株可以是用于生产伊维菌素B1b的菌株，例如阿维链霉菌、吸水链霉菌、基因工程菌MA220等，尤其是基因工程菌MA220。
本发明还涉及上述组合物在生产伊维菌素B1b或含有伊维菌素B1b的药物组合物中的应用。
在另一方面，本发明还涉及一种杀虫组合物，其包含由本发明的方法制得的伊维菌素B1b。
优选地，上述可同化的碳源为蔗糖、葡萄糖、淀粉酶、果糖、鼠李糖、棉籽糖、木糖、阿拉伯糖、工业糖蜜、乳糖、半乳糖、麦芽糖、海藻糖、木聚糖、糊精、玉米淀粉、山梨醇、水杨苷、肌醇、甘露醇、甘油、甘氨酸、菊粉中的一种或几种。
优选地，上述可同化的氮源为牛肉浸膏、酵母浸膏、酵母抽提物、酵母粉、蛋白胨、胰蛋白胨、麸质粉、棉籽饼粉、花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆干粉、麸皮、尿素、铵盐、硝酸盐中的一种或几种。
优选地，所述培养基还包括无机盐，所述无机盐为MnSO4，Na2MoO4，CoCl2，CaCO3，ZnSO4，FeSO4，(NH4)2SO4，FeCl3，KNO3，KH2PO4，K2HPO4，MgCl2，MgSO4，NaCl，CuSO4，NiSO4，KCl中的一种或几种。
优选地，所述培养基含有玉米淀粉120～160g/L，淀粉酶0.2g/L，黄豆饼粉10～40g/L，花生饼粉0～10g/L，酵母粉5～20g/L，(NH4)2SO4 0～4g/L，MnSO4 0.024g/L，Na2MoO40.024g/L，CoCl2 0.01～0.04g/L，CaCO3 3～7g/L。
优选地，所述培养基含有玉米淀粉140g/L，淀粉酶0.2g/L，黄豆饼粉20g/L，花生饼粉5g/L，酵母粉10g/L，(NH4)2SO4 2g/L，MnSO4 0.024g/L，Na2MoO4 0.024g/L，CoCl2 0.02g/L，CaCO3 7g/L。
优选地，所述发酵的温度为20℃-40℃，更优选为25℃-30℃，最优选为28℃。优选地，在本发明的发酵方法中对发酵的pH条件进行控制，所述pH为6.0-8.0，更优选为6.5-7.5，最优选为7.0-7.2。本发明方法的发酵时间可以为288-312小时；本发明方法的通气量可以为0.6-1.1vvm。
在本发明中，“通气量”表示每分钟内通过单位体积培养液的经过滤除菌的无菌空气的量。
在本发明中，所述“除虫链霉菌C63-51”、“菌C63-51”、“诱变菌C63-51”具有相同的含义。
在本发明中，所述“基因工程菌MA220”、“MA220菌株”、“天维菌素产生菌MA220”、“重组链霉菌MA220”、“出发菌株MA220”具有相同的含义。
本发明中，伊维菌素B1b可以通过以下HPLC方法进行检测：
色谱柱为C18柱，5μm，4.6×250mm；
流动相为甲醇：乙腈：水＝81:7:12(体积比)；
流速：1ml/min；
检测波长：240nm；
进样量：10μl。
本发明与现有技术相比至少具有以下优点：
1、本发明筛选得到的除虫链霉菌菌株C63-51可直接用于伊维菌素B1b的发酵生产，与用化学法制备伊维菌素相比，避免了复杂的分离提纯和化学还原的工艺步骤，使生产成本大幅降低。
2、在现有技术中，例如CN200510074936.X中伊维菌素B1a的产量约为1-4mg/L，但未提及伊维菌素B1b的产量；CN200910089970.2中伊维菌素的产量约为35mg/L，且产物为伊维菌素B1a和B1b的混合物，较难分离出伊维菌素B1b；WO2015135242A1和WO2015135467A1中出发菌株MA220生产伊维菌素B1b的效价为200mg/L；而本发明除虫链霉菌C63-51生产伊维菌素B1b摇瓶发酵单位可达6500mg/L，在50L发酵罐中效价可达4000mg/L，本发明伊维菌素B1b的产量远远高于现有技术；且本发明除虫链霉菌C63-51发酵液中伊维菌素B1b含量超过60％，杂质少，发酵单位高，提纯工艺简单。
附图说明
图1：除虫链霉菌菌株C63-51和出发菌株MA220发酵产物对比图：A为出发菌株MA220在实施例1中产生的发酵液HPLC图谱，B为除虫链霉菌菌株C63-51在实施例1中产生的发酵液HPLC图谱。
图2：实施例5中制备得到的伊维菌素B1b的质谱图。
具体实施方式
以下各实施例中，如无特殊说明，所使用的试剂、仪器都是本领域常用试剂、仪器，可以从化学或生物制品/制剂公司购买得到；以下实施例中使用的方法都是本领域常规方法，本领域技术人员根据现有技术或生产商提供的操作手册可以毫无疑义地知道这些实验的操作过程并获得相应结果。
实施例1除虫链霉菌C63-51的筛选
1、MA220菌株的亚硝基胍(NTG)诱变：
以天维菌素产生菌MA220(其制备方法参见WO2015135242A1和WO2015135467A1)为出发菌株。取出发菌株MA220的新鲜斜面，用0.1mol/L，pH6.0的磷酸盐缓冲液制成孢子悬液，用终浓度为1mg/ml的NTG处理孢子悬液，于34℃震荡1h，用生理盐水离心洗涤孢子3次，经稀释后涂布于YMS固体培养基(酵母抽提物4g/L，葡萄糖4g/L，麦芽抽提物10g/L，微量元素溶液5ml/L，琼脂20g/L)上，28℃培养4d。挑取菌落直径较大，产孢丰富的单菌落转接到YMS固体平板培养基上，28℃培养7d。按如下所述的发酵验证方法，共筛选诱变菌600株左右，得到突变菌株58-46，其伊维菌素B1b效价为1600mg/L。
2、突变菌株58-46的常压室温等离子体(ARTP)诱变：
以上述NTG诱变得到的突变菌株58-46为出发菌株，挑取新鲜斜面上的成熟孢子，用生理盐水洗涤制备孢子悬液。取10μl孢子悬液滴加在无菌的载片上，放于等离子体室照射。照射条件设定为：以氦气为发生气，流量为12.5L/min，发射口与盛样品载片间距离2mm，照射功率100W，照射时间30s。照射完毕后，用无菌镊子将样品载片取出，放置于装有生理盐水的2ml无菌EP管中，利用漩涡混合器剧烈震荡2min，将载片上的样品彻底洗下并悬浮于生理盐水中。经梯度稀释后，涂布于YMS固体培养基平板，28℃培养4d。挑取菌落直径较大，产孢丰富的单菌落转接到YMS固体平板培养基上，28℃培养7d。按如下所述的发酵验证方法，共筛选诱变菌600株，获得一株伊维菌素B1b的高产菌株，命名为除虫链霉菌菌株C63-51。出发菌株MA220生产伊维菌素B1b的效价为200mg/L，杂质较多；除虫链霉菌菌株C63-51生产伊维菌素B1b的效价提高到3000mg/L，杂质较少。结果如图1所示，其中A是出发菌株MA220的发酵液HPLC图谱，B是除虫链霉菌菌株C63-51的发酵液HPLC图谱。
3、发酵验证方法如下：
(1)种子液的制备与培养
种子培养基配方(g/L)：玉米淀粉25，黄豆饼粉8，花生饼粉10，酵母粉9.5，CoCl20.03，pH7.2，经121℃灭菌20分钟。将培养好的孢子用接种铲刮取约1cm2的菌苔转接种子培养基中，培养温度28℃，250rpm，摇床振荡培养40小时。此时培养液pH 6.86，菌丝浓度为35％(体积百分比)。
(2)发酵培养基的制备与培养
发酵培养基配方(g/L)：玉米淀粉120，淀粉酶0.2，黄豆饼粉10，酵母粉5，MnSO40.024，Na2MoO4 0.024，CoCl2 0.01，CaCO3 3，pH 7.2，经121℃灭菌20分钟。种子液接种量为6％(体积百分比)。培养温度28℃，250rpm，摇床振荡培养12天。此时培养液pH 6.60，菌丝浓度为33％(体积百分比)。
(3)高液相色谱方法(HPLC)测定发酵液的效价
发酵液萃取：取发酵液1ml，加入4ml无水甲醇浸泡，超声1h后，过滤。滤液直接用于HPLC分析。HPLC分析条件为：色谱柱：C18Hypersil ODS24.6×250×5(大连依利特)，流动相：甲醇：乙腈：水＝81:7:12(体积比)，流速：1ml/min，吸收波长：240nm。
实施例2除虫链霉菌C63-51的形态学和培养学特征
参照《链霉菌鉴定手册》、《放线菌的分类与鉴定》、《常见细菌系统鉴定手册》等书中的有关内容进行实验。菌株的形态学和培养学特征实验采用ISP2、ISP3、ISP4、高氏一号、葡萄糖天冬素、LB和YMS 7种培养基，28℃培养5～7天后，观察菌丝体的颜色及色素情况。结果见表1。
表1菌株C63-51在7种不同培养基上的培养特征
培养基 生长情况 基质菌丝 气生菌丝 可溶性色素
ISP2 4 浅棕色 肉桂色 浅黄褐色
ISP3 3 浅黄色 黄白色 无
ISP4 3 黄色 浅黄色 浅黄棕色
高氏一号 4 米色 乳白色 黄色
葡萄糖天冬素 4 黄橙色 黄橙色 浅黄褐色
LB 2 米色 米色 黄色
YMS 4 黄色 黄色 黄色
实施例3除虫链霉菌C63-51的生理生化特征
(1)碳源的利用：采用ISP9作为基础培养基，各种碳源的终浓度均为1.0％(质量百分浓度)。其结果见表2。
(2)氮源的利用：采用配方为KH2PO4 1.36g/L，Na2HPO4 2.13g/L，MgSO4 0.2g/L，CaCl2 0.005g/L，葡萄糖10g/L，FeSO4 0.0005g/L的培养基作为基础培养基，硝酸钾和硫酸铵的浓度均为0.1％(质量百分浓度)。其结果见表2。
表2菌株C63-51的碳源和氮源的利用情况
Figure BDA0002199447610000081
(3)降解试验和NaCl耐受试验：降解试验采用基础培养基为GYEA(pH 6.8)，各种降解试验结果见表3；NaCl耐受试验结果为：NaCl耐受性较好，在7％的NaCl存在下仍能生长。
表3菌株C63-51的降解试验结果
降解物 降解物浓度 结果 降解物 降解物浓度 结果
腺嘌呤 0.5％ 4，+ 酪氨酸 1.0％ 4，+
鸟嘌呤 0.5％ 4，- Tween-40 1.0％ 3，-
次黄嘌呤 0.4％ 4，- Tween-80 1.0％ 4，-
酪蛋白 1.0％ 4，+
(4)生理生化试验、pH试验和温度试验：生理生化试验结果见表4。pH试验和温度试验均采用高氏一号培养基进行。其结果为：菌株在14℃到37℃之间均能生长，最适生长温度为28℃；pH 6.0～8.0均能生长，最适宜的范围为6.5～7.5。
表4菌株C63-51的主要生理生化特征
试验项目 结果 试验项目 结果 试验项目 结果
明胶液化 - 牛奶胨化 + 纤维素利用 -
淀粉水解 + 硝酸盐还原 +
牛奶凝固 + 硫化氢产生 +
注：表1-4中的数字和符号分别代表：
0：无生长；1：生长很弱；2：能生长；3：生长良好；4：生长最好；
+：阳性；-：阴性。
实施例4 16S rDNA序列分析以及菌种鉴定
收集待测菌株C63-51的新鲜菌体，采用溶菌酶法改进的Pitcher法(Letters inApplied Microbiology,1989,8:151-156)提取总DNA模板，采用通用引物(27F和1495R)进行16S rDNA基因扩增，PCR产物经检测纯化后，直接进行序列测定，测序由南京金斯瑞生物技术有限公司进行。所测的16S rDNA序列经校对后与GenBank数据库中相关种、属的序列进行同源序列BLAST比较，以确定该菌株的分类地位。
菌株C63-51(CGMCC NO.13370)16S rDNA序列与GenBank中相关序列进行BLAST比较，结果见表5(表中只列出同源性较高的菌株)。
表5菌株C63-51和相关菌株的同源性
Figure BDA0002199447610000091
Figure BDA0002199447610000101
菌株C63-51(CGMCC NO.13370)通过16S rDNA区域测序发现其和除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)有100％的同源性，同时对菌株C63-51(CGMCCNO.13370)进行表观特征试验，发现该菌株和除虫链霉菌(Streptomycesavermitilis)分类相关参数非常接近，故将菌株C63-51(CGMCC NO.13370)鉴定为除虫链霉菌(Streptomycesavermitilis)。
实施例5发酵培养基优化
(1)发酵培养基的优化与培养
以实施例1发酵培养基为基础培养基，调整配方中各组分浓度，优化发酵培养基，配方优化为(g/L)：玉米淀粉120～160，淀粉酶0.2，黄豆饼粉10～40，花生饼粉0～10，酵母粉5～20，(NH4)2SO4 0～4，MnSO4 0.024，Na2MoO4 0.024，CoCl2 0.01～0.04，CaCO3 3～7，pH7.2，经121℃灭菌20分钟。种子液接种量为6％(体积百分比)。培养温度28℃，250rpm，摇床振荡培养12天。
(2)高液相色谱方法(HPLC)测定发酵液的效价
发酵液萃取：取发酵液1ml，加入4ml无水甲醇浸泡，超声1h后，过滤。滤液直接用于HPLC分析。HPLC分析条件为：色谱柱：C18Hypersil ODS24.6×250×5(大连依利特)，流动相：甲醇：乙腈：水＝81:7:12(体积比)，流速：1ml/min，吸收波长：240nm。
按上述方法测定不同发酵培养基的发酵液效价，根据发酵液效价确定优选的发酵培养基配方。最为优选的发酵培养基配方为(g/L)：玉米淀粉140，淀粉酶0.2，黄豆饼粉20，花生饼粉5，酵母粉10，(NH4)2SO4 2，MnSO4 0.024，Na2MoO40.024，CoCl2 0.02，CaCO3 7，pH7.2，经121℃灭菌20分钟。培养温度28℃，250rpm，摇床振荡培养12天。此时培养液pH6.65，菌丝浓度为37％(体积百分比)。除虫链霉菌菌株C63-51生产伊维菌素B1b的效价提高到6500mg/L，比初始配方提高了2倍。
实施例6发酵罐生产伊维菌素B1b
(1)斜面菌体的制备与培养
斜面采用YMS培养基(g/L)：酵母抽提物4，葡萄糖4，麦芽抽提物10，微量元素溶液5ml/L，琼脂20，蒸馏水1000ml，pH 7.2，经121℃灭菌20分钟，冷却到50-60℃摆斜面，接入菌株C63-51，28℃培养7d。
(2)种子液的制备与培养
种子培养基配方(g/L)：玉米淀粉25，黄豆饼粉8，花生饼粉10，酵母粉9.5，CoCl20.03，pH7.2，经121℃灭菌20分钟。将培养好的孢子用接种铲刮取约1cm2的菌苔转接种子培养基中，培养温度28℃，250rpm，摇床振荡培养40小时。此时培养液pH 6.86，菌丝浓度为35％(体积百分比)。
(3)种子罐种子液的制备
在15L种子罐中投入10L的种子培养基，灭菌采用蒸汽灭菌，121℃条件下进行30分钟，接入300ml摇瓶种子液，培养温度为28±1℃，搅拌转速100-250rpm，通气量1.0vvm，培养18h，此时培养液pH 6.80，菌丝浓度30％(体积百分比)。
(4)发酵罐培养基的配制与培养
发酵培养基配方(g/L)：玉米淀粉140，淀粉酶0.2，黄豆饼粉20，花生饼粉5，酵母粉10，(NH4)2SO4 2，MnSO4 0.024，Na2MoO4 0.024，CoCl2 0.02，CaCO37，发酵罐体积50L，投料体积为30L，pH 7.2，于121℃条件下蒸汽灭菌30min，冷却后，接入约3L种子罐培养液，发酵温度28±1℃，搅拌转速101-308rpm，通气量0.6-1.1vvm，发酵培养12d，放罐，测得伊维菌素B1b发酵单位为4000mg/L。
(5)发酵液萃取
将得到的发酵液用滤布过滤得到滤饼，滤饼用乙醇提取两次，合并得到乙醇提取液。乙醇提取液经过真空浓缩至干后用乙酸乙酯萃取，即得到含有伊维菌素B1b的浸膏。该浸膏用硅胶拌样后，上硅胶柱，用体积比为90:10，80:20，70:30，60:40的石油醚/丙酮梯度洗脱，分段收集洗脱流分，TLC检测，得到含伊维菌素B1b的组分，该组分经真空浓缩至干得含伊维菌素B1b的样品，该样品在以下条件下进行反向色谱分离：
液相系统：Agilent 1100半制备高压液相色谱仪
色谱柱：ZORBAXEclipse XDB-C18(250mm×9.4mm)
洗脱剂：甲醇:乙腈:水＝46:46:8(体积比)
流速：1.5ml/min
检测波长：λ＝240nm
收集保留时间为26.79min的峰得到化合物，将该化合物做质谱分析，图谱见图2。结果表明其分子量为860，确定为伊维菌素B1b，结构如下：
Figure BDA0002199447610000121
综上所述，本发明除虫链霉菌C63-51为伊维菌素B1b的高产菌株，其摇瓶发酵单位达到6500mg/L，50L罐的发酵单位达到4000mg/L。

Claims (13)

1.一种除虫链霉菌（Streptomyces avermitilis）菌株C63-51，其于2016年12月22日以保藏编号CGMCC NO.13370保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）。
2.一种组合物，其包含权利要求1所述的除虫链霉菌菌株C63-51。
3.权利要求1所述的除虫链霉菌菌株C63-51或权利要求2所述的组合物在生产伊维菌素B1b或含有伊维菌素B1b的药物组合物中的应用。
4.一种生产伊维菌素B1b的方法，该方法包括将权利要求1所述的除虫链霉菌菌株C63-51在含有可同化的碳源和氮源的培养基里进行发酵，其中所述可同化的碳源为蔗糖、葡萄糖、果糖、鼠李糖、棉籽糖、木糖、阿拉伯糖、工业糖蜜、乳糖、半乳糖、麦芽糖、海藻糖、木聚糖、糊精、玉米淀粉、山梨醇、水杨苷、肌醇、甘露醇、甘油、菊粉中的一种或几种；并且所述可同化的氮源为牛肉浸膏、酵母浸膏、酵母抽提物、酵母粉、蛋白胨、胰蛋白胨、麸质粉、棉籽饼粉、花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆干粉、麸皮、尿素、铵盐中的一种或几种。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述培养基还包含无机盐，所述无机盐为MnSO4，Na2MoO4，CoCl2，CaCO3，ZnSO4，FeSO4，(NH4)2SO4，FeCl3，KNO3，KH2PO4，K2HPO4，MgCl2，MgSO4，NaCl，CuSO4，NiSO4，KCl中的一种或几种。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述培养基含有玉米淀粉120~160 g/L，淀粉酶0.2g/L，黄豆饼粉10~40 g/L，花生饼粉0~10 g/L，酵母粉5~20 g/L，(NH4)2SO4 0~4 g/L，MnSO40.024 g/L，Na2MoO4 0.024 g/L，CoCl2 0.01~0.04 g/L，CaCO3 3~7 g/L。
7.根据权利要求4所述的方法，其中所述培养基含有玉米淀粉140 g/L，淀粉酶0.2 g/L，黄豆饼粉20 g/L，花生饼粉5 g/L，酵母粉10 g/L，(NH4)2SO4 2 g/L，MnSO4 0.024 g/L，Na2MoO4 0.024 g/L，CoCl2 0.02 g/L，CaCO3 7 g/L。
8.根据权利要求4-7中任一项所述的方法，其中所述发酵的温度为20℃- 40℃ 。
9.根据权利要求4-7中任一项所述的方法，其中所述培养基的pH为6.0-8.0。
10.根据权利要求4-7中任一项所述的方法，其中发酵时间为288-312小时；和/或通气量为0.6-1.1 vvm。
11.根据权利要求4-7中任一项所述的方法，其中所述发酵的温度为25℃-30℃；所述培养基的pH为6.5-7.5。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述发酵的温度为28℃。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述培养基的pH为7.0-7.2。
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