SK279768B6

SK279768B6 - Plesňový kmeň tolypocladium varium a spôsob mikrob

Info

Publication number: SK279768B6
Application number: SK7225-89A
Authority: SK
Inventors: N�E Bokany Antonia Jekkel; Gabor Ambrus; Sarudy Eva Toth; Istvan Mihaly Szabo; N�E Dobos Agota Huelber; Attila Andor; K�Roly Albrecht; K�Lm�N Koenczoel; Val�Ria Szell; N�E Joszt Eva Tomori; Imre Moravcsik; K�Lm�N Polya; J�Nos Erdei; Lajos Kiss; K�Roly Nagy; B�La Palot�S; N�E Konszky Etelka Deli; K�Roly Buz�Si; N�E Antal Aniko Moln�R; Gy�Rgy S�Ntha
Original assignee: Biogal Gy�Gyszergy�R
Priority date: 1988-12-20
Filing date: 1989-12-20
Publication date: 1999-03-12
Also published as: IT8922765A0; FI896157A0; SE8904262D0; PL162959B1; NO175873B; DK640989D0; FI92603B; GB2227489B; GB8928715D0; JPH02231071A; DD290356A5; EP0379708A1; NO895160L; LV10500B; NO175873C; CZ722589A3; CA2006144A1; FR2640641A1; FI92603C; HUT52164A

Description

Vynález sa týka nového plesňového kmeňa Tolypocladium varium a jeho použitia pri mikrobiálnej príprave cyklosporínového komplexu alebo jeho zložiek, cyklosporínu A, cyklosporínu B a cyklosporínu C aeróbnou fermentáciou.

Doterajší stav techniky

Cyklosporíny sú cyklické, neutrálne, nepoláme jedenásťčlenné oligopeptidy, v ktorých niektoré zo skupín aminokyselín sú rozdielne. Cyklosporín A a cyklosporín B izoloval najprv A. Riieger et al. (Helv. Chim. Acta 59, 1075 (1976)), zatiaľ čo cyklosporíny B, D, E a G izoloval R. Traber et al. (Helv. Chim. Acta 60, 1568 (1977)) z kultúry plesní (NRRL 8044), identifikovanej najprv ako Trichoderma polysporum (Ling. ex. Pers.) Rifai. Neskôr sa uskutočnila taxonómiou revízia uvedeného kmeňa a potom bol opísaný v literatúre ako Tolypocladium inflatum Gams.

V súčasnosti je známych 25 rôznych cyklosporínových antibiotík uvedených ako cyklosporíny A až Z (Helv. Chim. Acta 70, 13 (1987)). Z týchto zložiek je najcennejší cyklosporín A, ktorý má selektívny imunosupresívny účinok.

Cyklosporín A bol najskôr známy ako mierne antifungicídne antibiotikum, jeho význačný imunosupresívny účinok sa potvrdil až neskôr (J. F. Borel et al: Immunology 32, 1017(1977)).

V sériách skúšok in vitro a in vivo sa potvrdilo, že cyklosporíny A, C a G sú veľmi špecifické imunosupresívne látky.

Cyklosporín A inhibuje očakávanú humorálnu a tkanivovú imunitnú odpoveď. Pri štúdiu jeho spôsobu účinku sa zistilo, že inhibuje T bunkovú proliferáciu a aj syntézu interleukínu 2.

Terapeutické použitie cyklosporínu A pri transplantácii ľudských orgánov bolo uverejnené v r. 1978. Najprv bol aplikovaný pri transplantácii obličiek (R. J. Calne et al.: Lancet 1978/2, 1323) a kostnej drene (R. L. Powles et al.: Lancct 1978/2, 1327) transplantations.

V priebehu transplantácie orgánov (obličiek, podžalúdkovej žľazy, pečene, srdca, pľúc) a kostnej drene bola negatívna reakcia orgánov potlačená aplikáciou cyklosporínu A.

Ďalej bol cyklosporín A úspešne aplikovaný pri liečení niektorých autoimunitných ochorení (uveitídy, reumatickej artritídy, psoriázy a ťažkej myasténie).

V patentovej literatúre sa na produkciu cyklosporínového komplexu použili nasledujúce mikroorganizmy: Cylindrocarpon lucidum Booth, NRRL 5760 (švajčiarsky patent č. 589,716); Tolypocladium inflatum Gams, NRRL 8044 (podľa predošlej taxonómie: Trichoderma polysporum (Link ex Pers.) Rifai (švajčiarsky patent č. 603,790 podľa Bisetta (1983): Tol. inflatum w. Gams, 1971 je synonymný s Tol. niveum (rostrup) Bisett com.mov. a Fusarium solani, MCI-1549, MCI-1550 (publikovaná japonská patentová prihláška č. 82 63093)). V priebehu fermentačného procesu uskutočňovaného s uvedenými mikroorganizmami sa dosiahla po dlhom čase fermcntácic nízka úroveň produkcie cyklosporínu a výťažok izolácie bol tiež nízky.

Výskum sa uskutočnil s cieľom nájsť kmene mikroorganizmov, ktoré by produkovali cyklosporínový antibiotikový komplex alebo jeho zložky s vyššou koncentráciou a pri výhodnejších podmienkach ako pri predošlých kmeňoch. Pri skríningu veľkého počtu vláknitých plesňových kmeňov izolovaných z pôdy sa našiel kmeň mikroorganizmu Tolypocladium genus, ktorý je schopný biosyntézy cyklosporínového antibiotikového komplexu.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu je jednak tento mikroorganizmus označený CY/93, ktorý' nemohol byť identifikovaný pri taxonomickej štúdii žiadnym druhom plesní produkujúcim cyklosporínový komplex Tolypocladium species nová CY 93 je nový taxón kmeňa Tolypocladium qenus, ktorý sa môže diferencovať na úrovni druhu.

Predmetom vynálezu je ďalej aj spôsob mikrobiálnej prípravy cyklosporínového komplexu alebo jeho zložiek, cyklosporínu A, cyklosporínu B a cyklosporínu C, aeróbnou fermentáciou vláknitého plesňového kmeňa vedúcou k biosyntéze uvedeného antibiotika (antibiotík) v živnom prostredí, obsahujúcom využiteľné zdroje uhlíka a dusíka a minerálne soli a izoláciou vytvorených produktov, ktorý sa vyznačuje tým, že sa kmeň uvedeného druhu plesne Tolypocladium varium, produkujúci cyklosporínový antibiotikový komplex, kultivuje v živnom prostredí obsahujúcom zdroje uhlíka, organické a anorganické zdroje dusíka a minerálne látky za aeróbnych podmienok pri 25 až 30 °C a prípadne sa vyrobený cyklosporínový antibiotikový komplex alebo jeho zložky izolujú a čistia.

Fermentácia sa uskutočňuje v prostredí obsahujúcom ako zdroj dusíka peptón, síran amónny a tryptón a ako zdroj uhlíka glukózu, maltózu a sorbit.

Taxonomické znaky nového druhu plesne sa porovnali s hlavnými diagnostickými vlastnosťami druhu Tolypocladium nasledujúcim spôsobom.

Tolypocladium genus bol najskôr opísaný Gamsom v r. 1971 ako nový rod Moniliales. Jeho charakteristické vlastnosti sú: pomalý rast, poduškovité biele kolónie, koncové a bočné fialidy rozvinuté čiastočne na krátkom bočnom vetvení so silno napučanou bázou a vláknitým, často skloneným hrdlom, končiacim v jednobunkovom konídiu. V tomto rode rozlíšil Gams nasledujúce tri nové druhy:

T. geodes, T, cylindrosporum a T. inflatum.

T. geodes sa vyznačoval pôdnou vôňou typu Actinomycetes, zatiaľ čo novému T. varium sp. nov. CY/93 táto vlastnosť úplne chýba. Ďalej sú nosičové bunky T. geodes značne užšie ako bunky T. varium sp. nov. CY/93. Konídiá T. cylindrosporum sú charakteristicky dlhé a predĺžené, zatiaľ čo konídiá T. varium sp, nov. CY/93 sú sférické a len nepatrne predĺžené. Konídiá T. inflatum sú vajcovité a dlhšie ako pozorované v kultúre T. varium sp. nov. CY/93. Fialidy T. inflatum sú charakteristicky produkované vo verticiloch buď priamo na hýfach alebo na 2 až 3 pm dlhých nosičových bunkách. T. varium sp. nov. CY/93 zvyčajne nepreukazuje žiadne podobné verticilátové usporiadanie, také usporiadanie je detegovateľné len z času na čas ojedinelo. V dôsledku bieleho páperistého vzdušného mycélia sú kolónie všetkých známych druhov Tolypocladium biele, zatiaľ čo rub kolónií je žltkavosivý, bezfarebný alebo žltý. Nie sú produkované žiadne typicky rozpustné pigmenty. T. varium sp. nov. CY/93 sa môže odlíšiť aj v tomto ohľade: v prostredí obsahujúcom glukózu a peptón a sladový a kvasnicový výťažok je produkovaný tmavý, tmavosivý (a čierny) s časovou premenlivosťou.

Taxonomické hodnotenie nových druhov v porovnaní s inými známymi druhmi Tolypocladium sa uskutočnilo na základe nasledujúcich publikácií: W. Gams: Perseonia, 6, 185-191, (1971); G. L. Barron: Can. J. Bot. 5R, 439-442 (1980) a Bisett J., Can. J. Bot. 61, 1311-1329 (1983).

Diagnostické vzory Tolypocladium varium sp. nov. CY/93 sú zhromaždené v nasledujúcom:

10-dňové kolónie majú priemer 10 až 25 mm, ich povrch je pokrytý bielym, páperistým, bohato sporulujúcim vzdušným mycéliom. Rub kolónií je žlto až špinavosivý. V niektorých prostrediach sa produkuje tmavosivý, rozpustný pigment. Na hýťach vzdušného mycélia sa pozoruje koncová a bočná sporulácia. Fialidy sú umiestnené buď osamelo, alebo sporadicky, náhodne vo verticiloch, priamo na hýfach alebo na krátkych (2 až 3 pm) nosičových bunkách. Fialidy sú vytvorené z napučanej bázy (2 až 4 x 2 až 3 pm) a dlhého, vláknitého hrdla (2 až 4 x 0, 5 až 0, 6 pm). Konídiá hlavičiek sú malé (2 až 3. 1,3 až 2,2 pm), zvyčajne sférické a hladké. Špecifický epiteton varium sa týka variability fialíd. 7b/. varium ukazuje vo svojom životnom cykle určitú podobnosť s rodom Harptsporium, o ktorom sa bude zmieňovať inde. Kmeň označený CY/93 nemôže využívať rafmózu, ale rastie dobre na nasledujúcich zdrojoch uhlíka: mámte, inozite, sacharóze, fruktóze, ramnóze, galaktóze, dextróze, arabinóze a xylóze v povrchových kultúrach. Tieto kultúry sa nevyvíjajú dobre na živnej pôde a agare so sladovým výťažkom, dobre sa vyvíjajú na agare so sójovou múkou, Czapekovom agare a agare so zemiakovou dextrózou. Na uskladnenie nie je vhodný agar s ovsenou múkou a agar s dextrózou a kvasnicovým výťažkom.

Tol. varium sa ostro odlišuje od Tol. trigonosporum, ktoré produkuje konídiá trojhranné na povrchu so slabo vydutými okrajmi. Tol. varium sa odlišuje aj od Tol. balanoides. Posledné produkuje fľašovité bočné fialidy.

Okrem toho sa kmeň (CY/93) Tolypocladium varium n.sp. odlišuje od autentického typu kmeňa Tolypocladium inflatum (CBS 714.70) vzhľadom na to, že posledný uvedený kmeň vyvíja bohaté biele vzdušné mycélium pri kultivácii na živnej pôde maltóza-agar, zatiaľ čo Tolypocladium varium sp.nov. CY/93 neprodukuje toto vzdušné mycélium. Typ kmeňa Tolypocladium inflatum produkuje v mycéliu v živnej pôde železopeptón čcrvenkastohnedý konečný pigment, zatiaľ čo mycélium Tolypocladium varium sp.nov. CY/93 zostáva svetložlté. Kmeň Tolypocladium varium sp.nov. CY/93 nevyužíva arabinózu, zatiaľ čo Tolypocladium inflatum využíva. Pri použití dusitanu sodného vyvíja posledný uvedený kmeň bohaté mycélium, zatiaľ čo Tolypocladium varium sp.nov. CY/93 rastie ťažko.

Porovnanie Tolypocladium.varium sp.nov. CY/93 s autentickými kmeňmi iných Tolypocladium species, Trichoderma polysporum ATCC 16,641 a Cylindrocarpon lucium NRRL 5760 je uvedené v tabuľke 1.

Tabuľka I

Rozklad celulózy		-		TI	++ +	♦-+4 ^!
VžduSité mycéliuni: zelené alebo tnodravozelené	-	-	-			+++	++ +
Červený rozpustný pigment produkcie na Ringovom agare	-	-	-	-	-	-	+ + 4-
Hnedý pigment produkcie					-	-	++♦
na aaare so železom							1
Tmavohnedý pigment produkcie na agare so syntetickým gtycerolom	-	-	-	-	-	♦++	-
Využitie sacharózy	++♦	+4 +	4++	++ +	·♦ + +	-	♦ +4
Využitie iuulinu	-	-	-	-	-	-	+ + +
Rast pri 5 °C	v _{+ +}	+ + +	+ + 4-	H-t	t + +	-	-
Rast pri 37 ^aC	-			-	-	4-	+ + *
Odolnosť proti zohrievaniu pri $0 ’C počas 50 minút	+ + +	-	-	-	-		t4- +
Produkcia kyseliny z glukózy	+ + -··	+ +*	+	+	4- + 4-	+ + +	+ + +
Využitie salicylitu sodného			-			+ + +
Využitie malonátu sodného			ľ + -P			4- +
Využitie vínanu sodného	+		⁺ +	-		+ +
Fialový rozpustný pigment
produkcie na agare i tyrozL	-	1 _ 1	-	+4 +	+ + t		-
no a Icudnom		1				1	1

Kmeň podľa vynálezu je veľmi výhodný vzhľadom na rýchly rast. Priaznivým znakom je to, že kmeň môže využiť sacharózu, glukózu, sorbózu, maltózu, fruktózu, škrob, giycerol a tiež tuky a oleje ako zdroje uhlíka a rôzne organické a anorganické zdroje dusíka, ako kukuričný výluh, peptón, kvasnicový výťažok, mäsový výťažok, dusičnan sodný, dusičnan amónny, síran amónny a rôzne aminokyseliny. Okrem uvedených zdrojov uhlíka a dusíka môžu živné prostredia použité na produkciu cyklosporínového antibiotikového komplexu obsahovať aj minerálne soli (chlorid draselný, síran horečnatý alebo dihydrogenfosforečnan draselný), stopové prvky (soli medi, mangánu, železa), ďalej vitamíny a odpeňovacie látky.

Podľa výhodnej metódy podľa vynálezu sa kvapalné prostredie naočkuje suspenziou konídia a mycélia pripraveného z kultúry Tolypocladium varium sp.nov. CY/93 na šikmom agare. Po trojdňovej kultivácii sa získaná predkultúra použije na naočkovanie prostredia použitého na výrobu antibiotika, ktoré sa potom inkubuje pri 25 až 30 °C, výhodne pri 25 °C, 5 až 7 dní. Počas fermentácie sa pH udržiava v rozmedzí 6,0 až 2,5, výhodne pri 5,2. Fermentácia sa uskutočňuje za aeróbnych podmienok za intenzívneho miešania (750 až 1000 otáčok za minútu) a za prevzdušňovania 300 1/h.

Počas fermentácie sa obsah cyklosporínu v živnej pôde monitoruje mikrobiálnou skúškou a vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou. Len čo sa vyrobia maximálne množstvá antibiotika, získajú sa tieto z kultúry známym spôsobom extrakčnou a/alebo absorpčnou metódou.

Cyklosporínová koncentrácia živnej pôdy sa meria na základe antifungicídnej účinnosti cyklosporínov doskovým difúznym testom. Ako skúšané organizmy sa môžu výhodne použiť Aspergillus niger, Aspergillus japonicus a Curvularia lunata (M. Dreyfuss et al.: European J. Appl. Microbiol. 3, 125-133 (1976)). Vysokotlaková kvapalinová chromatografia cyklosporínovej koncentrácie živnej pôdy sa uskutočňuje na vzorke pôdy desaťnásobným zriedením metanolom podľa F. Kreuziga (J. Chromat. 290, 181 (1284)). Podľa týchto pokusov sa vyrobí cyklosporinový

SK 279768 Β6 antibiotikový komplex obsahujúci cyklosporín A ako hlavný produkt a cyklosporín B a cyklosporín C ako menšie zložky s vysokým výťažkom (950 mcg/ml) s použitím nového kmeňa Tolypocladium varium sp. nov. CY/93.

Na izoláciu cyklosporínového komplexu z fermentačnej živnej pôdy sa výhodne môže použiť extrakčná metóda. Pred extrakciou sa mycélium oddelí buď fdtráciou alebo odstredením. Antibiotiká vyrobené počas fermentácie sa môžu výhodne vymyť z buniek mikroorganizmu nižšími alkanolmi, výhodne metanolom alebo organickými ketónmi, výhodne acetónom, zatiaľ čo cyklosporíny vo filtráte sa môžu extrahovať organickými rozpúšťadlami miešateľnými s vodou, ako je etylacetát, n-butylacetát, dichlórmetán, 1,2-dichlóretán alebo chloroform, výhodne n-butylacetát. Surový produkt získaný extrakciou je znečistený červenými a fialovými pigmentmi produkovanými plesňou, ktoré sa môžu odstrániť adsorpciou na aktívnom uhlí alebo silikagcli. Prípadne lipidové nečistoty (t.j. odpeňovacia látka) sa môžu oddeliť distribúciou do systému petroléteru a metanolu obsahujúceho 10 % vody, kde sa nečistoty prevedú do petroléterovej fázy.

Vodná metanolová fáza sa koncentruje za zníženého tlaku, potom sa vodný zvyšok extrahuje dichlórmetánom, ktorý sa odparí a získa sa vyčistený cyklosporín. Cyklosporín A sa môže oddeliť od menších cyklosporínových zložiek stĺpcovou chromatografiou a prekryštalizovaním.

Štruktúra izolovaných produktov sa objasnila ultrafialovou, infračervenou, 1H nukleárnou magnetickou rezonančnou, 13c nukleárnou magnetickou rezonančnou a hmotnostnou spektroskopiou a analýzou aminokyselín.

Vynález bude objasnený v nasledujúcich príkladoch bez toho, aby bol obmedzený jeho rozsah.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Suspenzia konídia a mycélia sa pripraví s 5 ml 0,9 % roztoku chloridu sodného, získaného z kultúry Tolypocladium varium sp nov. CY/93 na šikmom agare so sladovým výťažkom a kvasnicovým výťažkom. 1 ml tejto suspenzie sa použije na naočkovanie 100 ml sterilného inokulačného prostredia IC v 500-mililitrovej Erlenmeyerovej banke.

Zloženie prostredia IC:

glukóza 40g kazeín-peptón5 g dusičnan sodný3 g dihydrogenfosforečnan draselný 2 g chlorid draselný 0,5g síran horečnatý x 7 H2O 0,5g síran železnatý x 7 H2O 0,01 g v 1000 ml vodovodnej vody.

pH živného prostredia sa upraví pred sterilizáciou na 5,2 a zmes sa sterilizuje 25 minút pri 121 °C. Kultúra sa inkubuje pri 25 °C na rotačnej trepačke (340 otáčok za minútu), potom sa použije 5 ml tohto inokulačného prostredia na naočkovanie 15 500-mililitrových Erlenmeyerových baniek obsahujúcich 100 ml sterilného prostredia FC|.

Zloženie prostredia FCj:

glukóza	80 g
tryptón	40 g
močovina	2g
síran amónny	12g
dusičnan amónny	3 g
dihydrogenfosforečnan draselný	2g
chlorid draselný	0,5 g
síran horečnatý x 7 H2O	0,5 g
síran železnatý’ x 7 H2O	0,01 g
v 1000 ml vodovodnej vody.
pH živného prostredia sa upraví pred sterilizáciou na
5,2 a zmes sa sterilizuje 25 minút	pri 121 °C.

Banky sa inkubujú pri 25 °C na rotačnej trepačke (340 otáčok za minútu). Počas fermentácie sa monitoruje antibiotiková koncentrácia živnej pôdy doskovým difúznym testom.

Ako skúšaný organizmus sa použije Aspergillus niger. Koncentrácia cyklosporínového antibiotikového komplexu v živnej pôde sa stanoví s použitím cyklosporínu A ako štandardu.

Fermentácia prebieha 168 hodín, keď živná pôda obsahuje 400 pg/ml cyklosporínového antibiotikového komplexu. Cyklosporínový komplex sa izoluje podľa nasledujúcej metódy.

Bunky jedného litra živnej pôdy sa fdtrujú a antibiotiká sa premyjú dvakrát 200 ml metanolu. Vodný metanolový roztok sa koncentruje za zníženého tlaku, potom sa antibiotikový komplex extrahuje z vodného koncentrátu 2 x 50 ml n-butylacetátu. Cyklosporínový obsah filtrátu sa extrahuje 200 ml n-butylacetátu. n-Butylacetátové extrakty sa zhromaždia, sušia bezvodým síranom sodným, potom sa odparia za zníženého tlaku pri 40 °C. 3,7 g získaného surového produktu sa rozpusti v 10 ml metanolu a privedie sa na vrchol gélovej kolóny Sephadex LH-20 (dĺžka kolóny 40 cm, priemer 2,5 cm), pripravenej s metanolom. Lipidové nečistoty sa potom oddelia elúciou metanolom. Frakcie obsahujúce cyklosporínový komplex sa odparia za zníženého tlaku pri 40 °C. Oddelenie zložiek získaného cyklosporínového komplexu (1,05 g) sa uskutočňuje chromatografiou na silikagélovej kolóne pripravenej z 20 g silikagélu 40 (Reanal, Budapešť) elúciou, zmesou chloroform-metanol, obsahujúcou postupne sa zvyšujúci objem metanolu. Elúcia začína so 100 ml chloroformu, potom pokračuje zmesou chloroform-metanol, kde obsah metanolu každej 100-mililitrovej časti sa zvýši o 0,5 %. Cyklosporínový obsah frakcií sa monitoruje chromatografiou na tenkej vrstve (doska: silikagél 60 F254, DC Alufoil (Merck), elučné činidlo: etylacetát-izopropylalkohol 95 : 5, detekcia: jódové pary). Cyklosporíny A, B a C sa eluujú z kolóny zmesou metanol-chloroform obsahujúcou 2,0 %, 2,5 % a 3,0 % metanolu. Frakcia obsahujúca čisté zložky sa odparí za zníženého tlaku a získa sa 225 mg cyklosporínu A (t.t.: 137-140 °C, [«][)' -189 ⁰ (metanol)), 25 mg cyklosporínu B (t.t.: 149-151 °C) a 52 mg cyklosporínu C (t. t.: 150-152 °C).

Príklad 2

1 inokulačného prostredia IC, sterilizovaného 45 minút pri 121 °C v 10-litrovom laboratórnom fermentore, sa naočkuje 200 ml inokulačnej kultúry pripravenej tak, ako sa opisuje v príklade 1, potom sa inkubuje pri 25 °C, mieša

SK 279768 Β6 sa pri 750 otáčkach za minútu a prevzdušňuje sa 300 1/h vzduchu.

Fermentácia sa ďalej uskutočňuje 72 hodín, potom sa použije 500 ml tohto inokulačného prostredia na naočkovanie 5 1 prostredia FC2, sterilizuje sa 45 minút pri 121 °C v 10-litrovom laboratórnom fermentore,.

Zloženie prostredia FC2;

glukóza80 g tryptón40 g močovina2 g síran amónny12 g dusičnan sodný3 g dihydrogenfosforečnan draselný 2 g chlorid draselný0,5 g síran horečnatý x 7 H2O0,5 g síran meďnatý x 5H2O 0,01 g síran mangánatý x 7 H2O 0,01 g síran železnatý x Ί H2O 0,01 g v 1000 ml vodovodnej vody.

pH prostredia sa upraví pred sterilizáciou na 5,2. Naočkovaná kultúra sa inkubuje pri 25 °C, mieša sa pri 750 0táčkach za minútu a prevzdušňuje sa 300 1/h.

Fermentácia sa uskutočňuje za uvedených podmienok 144 hodín až po dosiahnutie vrcholu cyklosporínového titra, potom je živná pôda bohatá a môže sa spracovať.

Cyklosporín A sa izoluje zo 4,8 1 fermentačnej živnej pôdy obsahujúcej 500 kg/ml cyklosporínového komplexu nasledujúcim spôsobom.

Bunky mikroorganizmu sa odstredia a cyklosporínový komplex sa vymyje z buniek 2 x 1 litrom metanolu. Vodný mctanolový roztok sa koncentruje za zníženého tlaku, potom sa antibiotikový komplex extrahuje z vodného koncentrátu 2 x 250 ml n-butylacetátu.

Cyklosporínový komplex sa extrahuje z filtrátu fermentačnej živnej pôdy 2 x 500 ml n-butylacetátu. Všetky n-butylacetátové extrakty sa zhromaždia, vysušia bezvodým síranom sodným, potom sa roztok odparí za zníženého tlaku pri 40 °C. Predbežné čistenie získaného surového produktu (19,2 g) sa uskutočňuje chromatografiou na kolóne pripravenej zo 100 g silikagélu 60 (veľkosť častíc 0,063 až 0,2 mm), so zmesou chloroform-metanol-acetón (92 : 4 : : 4) ako elučným činidlom.

Frakcie obsahujúce cyklosporínový komplex (chromatografia na tenkej vrstve: doska: silikagél 60 F254, DC Alufoil (Merck), elučné činidlo: hexán-acetón 2:1; detekcia: chlórž-tolidín) sa odparia do sucha. Odparok (5,28 g) sa podrobí stĺpcovej chromatografii a získa sa cyklosporín A. Kolóna sa pripraví zo 115 g silikagélu 60 (veľkosť častíc 0,063 až 0,2 mm) a eluuje sa zmesou hexán-acetón obsahujúcou postupne sa zvyšujúci objem acetónu. Cyklosporín A sa eluuje z kolóny zmesou obsahujúcou 23 % acetónu. Odparením frakcií obsahujúcich cyklosporín A sa získa 1,46 g cyklosporínu A.

Príklad 3

Suspenzia konídia a mycélia sa pripraví s 5 ml 0,9 % roztoku chloridu sodného, získaného z kultúry Tolypocladium varium nov.sp. CY/93 na šikmom agare so sladovým výťažkom a kvasnicovým výťažkom a použije na naočkovanie 800 ml inokulačného prostredia IC opísaného v príklade 1 a sterilizuje sa v 3-litrovej Erlenmeyerovej banke.

Banka sa inkubuje pri 25 °C na rotačnej trepačke (340 otáčok za minútu) 2,5 dňa, potom sa týmto prostredím naočkuje 5 1 prostredia FC3, sterilizovaného v 10-litrovom laboratórnom fermentore pri 121 °C 45 minút.

Zloženie prostredia FC3:

sorbóza60 g tryptón40 g močovina2 g síran amónny12 g dusičnan sodný3 g dihydrogenfosforečnan draselný 2 g chlorid draselný0,5 g síran horečnatý x 7 H2O0,5 g síran mangánatý x 7 H2O 0,01 g síran železnatý x 7 H2O 0,01 g v 1000 ml vodovodnej vody.

pH prostredia sa upraví pred sterilizáciou na 5,2. Naočkovaná kultúra sa inkubuje pri 25 °C za miešania pri 1000 otáčkach za minútu a prevzdušňuje 300 1/h. Fermentácia sa ďalej uskutočňuje 168 hodín, keď obsahuje fermentačná živná pôda podľa mikrobiálnej skúšky 600 mcg/ml cyklosporínového komplexu.

Izoláciou podľa príkladu 2 sa získa z jedného litra živnej pôdy 310 mg cyklosporínu A.

Príklad 4

Suspenzia konídia a mycélia sa pripraví s 5 ml 0,9 % roztoku chloridu sodného získaného, z päť- až sedemdňovej kultúry Tolypocladium varium nov.sp.CY/93 (NCAIM(P)F 001005) na šikmom agare so sladovým výťažkom a kvasnicovým výťažkom a použije na naočkovanie 500 ml inokulačného prostredia IC opísaného v príklade 1 a sterilizuje sa v 3-litrovej Erlenmeyerovej banke. Banka sa inkubuje pri 25 °C na rotačnej trepačke (340 otáčok za minútu) 3 dni, potom sa týmto prostredím naočkuje 5 1 prostredia FC4, sterilizovaného v 10-litrovom laboratórnom fermentore pri 121 °C 45 minút.

Zloženie prostredia FC4:

maltóza80 g tryptón40 g močovina2 g síran amónny12 g dusičnan sodný3g dihydrogenfosforečnan draselný 2 g chlorid draselný 0,5g síran horečnatý x 7 H2O0,5 g síran mangánatý x 7 H2O 0,01 g síran meďnatý x 5 H2O 0,01 g síran železnatý x 7 H2O 0,01 g v 1000 ml vodovodnej vody.

pH prostredia sa upraví pred sterilizáciou na 5,2. Po naočkovaní sa fermentačná živná pôda inkubuje pri 25 °C za miešania pri 1000 otáčkach za minútu a prevzdušňuje 300 1/h.

Fermentácia sa ďalej uskutočňuje 144 hodín, keď obsahuje fermentačná živná pôda podľa mikrobiálnej skúšky 620 mcg/ml cyklosporínového komplexu.

Izolácia sa uskutočňuje metódou opísanou v príklade 1. Z jedného litra živnej pôdy sa získa 305 mg cyklosporínu A.

Príklad 5

Suspenzia konídia a mycélia sa pripraví s 5 ml 0,9 % roztoku chloridu sodného z päť- až sedemdňovej kultúry Tolypocladium varium nov.sn. CY/93 (NCAIM(P)F 001005) na šikmom agare so sladovým výťažkom a kvasnicovým výťažkom a použije na naočkovanie 500 ml inokulačného prostredia IC opísaného v príklade 1 a sterilizuje sa v 3-litrovej Erlenmeyerovej banke. Banka sa inkubuje pri 25 °C na rotačnej trepačke (340 otáčok za minútu) 2 dni, potom sa týmto prostredím naočkuje 5 1 prostredia FC], sterilizovaného v 10-litrovom laboratórnom fermentore, pri 121 °C 45 minút. Po naočkovaní sa fermentačná živná pôda mieša pri 25 °C pri 750 otáčkach za minútu a prevzdušňuje 300 1/h. Po 96-hodinovej kultivácii sa pridá sterilizovaný vodný roztok 100 g maltózy a fermentácia pokračuje 144 hodín, keď živná pôda obsahuje podľa mikrobiálnej skúšky 950 mcg/ml cyklosporínového komplexu. Získa sa celkom 4,8 1 živnej pôdy. Izolácia sa uskutočňuje podľa metódy opísanej v príklade 2 a získa sa 2,75 g cyklosporínu A.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Plesňový kmeň Tolypocladium varium sp. nov. CY/93 uložený v NCAIM(P)F pod číslom 001005, produkujúci cyklosporínový antibiotikový komplex.

2. Spôsob mikrobiálnej prípravy cyklosporínového komplexu alebo jeho zložiek, cyklosporínu 1, cyklosporínu B a cyklosporínu C, acróbnou fermentáciou vláknitého plesňového kmeňa vedúcou k biosyntéze uvedeného antibiotika alebo antibiotík v živnom prostredí obsahujúcom využiteľné zdroje uhlíka a dusíka a minerálne soli a izoláciou vytvorených produktov, vyznačujúci sa tým , že sa plesňový kmeň Tolypocladium varium podľa nároku 1, produkujúci cyklosporínový antibiotikový komplex, kultivuje v živnom prostredí obsahujúcom zdroje uhlíka, organické a anorganické zdroje dusíka a minerálne soli za aeróbnych podmienok pri 25 až 30 “C a prípadne sa vyrobený cyklosporínový antibiotikový komplex alebo jeho zložky izolujú a čistia.

3. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým , že sa fermentácia uskutočňuje v prostredí obsahujúcom ako zdroj dusíka peptón, síran amónny a tryptón a ako zdroj uhlíka glukózu, maltózu a sorbit.