DK174719B1 - Mikrobiel fremgangsmåde til fremstilling af immunundertrykkende antibiotika omfattende dyrkning af en ny Tolypocladium svamp og svampestammen Tolypocladium varium sp. nov. CY/93 - Google Patents

Description

i DK 174719 B1

Den foreliggende opfindelse angår en mikrobiel fremgangsmåde til fremstilling af et cyklosporinkompleks eller dets komponenter, cyklosporin A, cyklosporin B og cyklospo-rin C, ved aerob gæring og svampestammen Tolypocladium vari-5 um sp. nov. CY/93,. som er deponeret hos National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest, Ungarn under accessionsnummeret NCAIM(P)F 001005, til anvendelse ved fremstilling af et cyklosporinkompleks eller dets komponenter, cyklosporin A, cyklosporin B og cyklosporin C.

10 Cyklosporinerne er cykliske, neutrale, apolære elle- veleddede oligopeptider i hvilke nogle af aminosyreresterne er uens. Cyklosporin A og cyklosporin B blev først isoleret af A. Ruegger et al. (Helv. Chim. Acta 59, 1075, 1976) mens cyklosporinerne B, D, E og G isoleredes af R. Traber et al.

15 (Helv. Chim. Acta 60, 1568, 1977) fra en kultur af en svamp (NRRL 8044) som tidligere var identificeret som Trichoderma polysporum (Ling ex Pers.) Rifai. Senere blev den nævnte stammes taksonomi revideret og den blev derefter i litteraturen benævnt Tolypocladium inflatum Gams.

20 For tiden kendes der 25 forskellige cyklosporin-anti- biotika, litreret som cyklosporinerne A til Z (Helv. Chim.

Acta 70, 13, 1987). Blandt disse komponenter er cyklosporin A det mest værdifulde stof og det har selektiv immununder-trykkende eller immunosupressiv virkning.

25 Cyklosporin A blev først kendt som et mildt antifun galt antibiotikum og dets vigtige immunundertrykkende effekt blev først anerkendt senere (J. F. Borel et al., Immunology 32, 1017, 1977).

Det blev bekræftet ved en række 'forsøg in vitro og in 30 vivo at cyklosporinerne A, C og G er meget specifikke immunundertrykkende midler.

Cyklosporin A inhiberede både humoral-formidlet og celleformidlet immunreaktion. Ved undersøgelse af dets virkningsmåde inhiberede det formering af T-celler såvel som 35 syntese af interleukin-2.

Den terapeutiske anvendelse af cyklosporin A ved organtransplantationer hos mennesker blev rapporteret i 1978.

DK 174719 B1 2

Den blev først anvendt på nyretransplantationer (R.J. Calne et al., Lancet 1978/2, 1323) og knoglemarvtransplantationer (R.L. Powles et al., Lancet 1978/2. 1327).

Under forløbet af transplantationer af organer (nyre, 5 bugspytkirtel, lever, hjerte, lunge) og knoglemarv kan udstødelsen af organerne eller knoglemarven undertrykkes ved anvendelse af cyklosporin A.

Desuden blev cyklosporin A anvendt med held til behandling af nogle autoimmunsygdomme (uveitis, rheumatoid 10 arthritis, psoriasis og myasthenia gravis).

Ifølge patentlitteraturen har følgende mikroorganismer været anvendt til fremstilling af cyklosporinkomplekset: Cylindrocarpon lucidum Booth, NRRL 5760 (schweizisk patentskrift nr. 589.716); Tolypocladium inflatum Garns, NRRL 15 8044 (i henhold til ældre taksonomi: Trichoderma polysporum (Link ex Pers.) Rifai) (schweizisk patentskrift nr.

603.790); ifølge Bisett (1983) er Tolypocladium inflatum W.

Gams, 1971, synonym med Tolypocladium niveum (Rostrup) Bisett comb. mov. og Fusarium solani MCI-1549, MCI-1550 (ja-20 pansk offentliggørelsesskrift nr. 82 63093). Ved forløbet af gæringsprocesser udført med de ovennævnte mikroorganismer opnåedes der kun lave produktionsniveauer af cyklosporinerne efter lange gæringsperioder, og udbytterne ved isolerings-proceserne var også lave.

25 Nærværende opfinderes undersøgelser har været kon centreret om at finde frem til mikroorganismestammer som kunne producere cyklosporin-antibiotikumkomplekset eller dets komponenter i højere koncentrationer og under mere fordelagtige betingelser end de tidligere'kendte stammer. Ved 30 undersøgelse af et stort antal trådformede svampestammer i-soleret fra jorden viste der sig en mikroorganismestamme af slægten Tolypocladium som var i stand til at biosyntetisere cyklosporin-antibiotikumkomplekset. Denne mikroorganisme, som af nærværende opfindere blev betegnet CY/93 kunne ikke 35 identificeres ved taksonomiske studier med nogen af de svampearter som producerer cyklosporinkompleks. Tolypocladium varium species nova CY/93 er et nyt takson i slægten Toly- 3 DK 174719 B1 pocladium, som kan differentieres på artsniveau.

På basis af de ovennævnte resultater angår opfindelsen en mikrobiel proces som giver en gæringssuppe indeholdende høje koncentrationer af cyklosporin ved anvendelse af 5 en hidtil ukendt mikroorganisme, Tolypocladium varium species nova CY/93, som er deponeret hos National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest, Ungarn under nummeret NCAIM(P)F 001005. Gæringssuppen indeholder foruden hovedproduktet cyklosporin A også små mængder cy-10 klosporin B og cyklosporin C.

De taksonomiske træk hos denne nye svampeart blev sammenlignet med de vigtigste diagnostiske egenskaber af arter af Tolypocladium som følger:

Slægten Tolypocladium blev først beskrevet af Gams i 15 1971 som en ny slægt af jordboende Moniliales. Dens karakte ristiske egenskaber er: langsom vækst, pudeagtige hvide kolonier, terminale og laterale phialider som udvikles delvist på en kort sidekæde, med kraftig opsvulmet basis og med en trådagtig, hyppigt buet hals som ender i et encellet conidi-20 um. Inden for denne slægt differentierede Garns tre nye arter: T. geodes, T. cylindrosporum og T. inflatum. T. geodes har en udtalt jordlugt af actinomycet-type mens den nye T. varium sp. nov. CY/93 er fuldstændig fri for denne lugt.

Desuden er bærecellerne hos T. geodes væsentligt smallere 2 5 end dem hos T. varium sp. nov. CY/93. Conidierne i T.‘ cylindrosporum er karakteristisk lange og forlængede mens conidierne hos T. varium sp. nov. CY/93 er kugleformede og kun svagt forlængede. Conidierne hos T. inflatum er ægformede og længere end dem der ses i en kultur af 'T. varium sp. nov.

30 CY/93. Phialiderne hos T. inflatum produceres karakteristisk i kranse enten direkte på hyferne eller på 2-3 μπι lange bærerceller. T. varium sp. nov. CY/93 har ikke noget sådant mønster med et kransstillet arrangement, et sådant kan kun konstateres sporadisk fra tid til anden. Først og fremmest 35 på grund af det hvide, bomuldslignende luftmycelium er kolonierne af alle kendte arter af Tolypocladium hvide mens bagsiden af kolonierne er gulliggrå, farveløse eller gule. Der DK 174719 B1 4 produceres ikke nogen typiske opløselige pigmenter. T. vari-um sp. nov. CY/93 kan også skelnes fra de andre arter i denne henseende: på medier indeholdende glukose og pepton såvel som maltekstrakt-gaerekstrakt udvikler der sig henholdsvis et 5 mørkt, dybgråt og sort pigment med tidsbestemt variabilitet.

Den taksonomiske bedømmelse af den nye art i sammenligning med de andre kendte arter af Tolypocladium blev udført på basis af følgende publikationer: W. Garns: Persoonia, 6, 185-191 (1971); G.L. Barron: Can. J. Bot. 5R, 439-442 10 (1980); og J. Bisett: Can. J. Bot. 61, 1311-1329 (1983).

De diagnostiske mønstre af Tolypocladium varium sp. nov. CY/93 resummeres i det følgende.

Ti dage gamle kolonier har en diameter på 10-25 mm, deres overflade er dækket med et hvidt, bomuldsagtigt, rige-15 ligt sporulerende luftmycelium. Koloniernes bagside er gul-liggrå eller smudsiggrå. I nogle komplekse medier dannes der et mørkegråt opløseligt pigment. Der iagttages både terminal og lateral sporulering på luftmyceliets hyfer. Phialiderne befinder sig enten enkelvis eller sporadisk, lejlighedsvis i 20 kranse, direkte på hyfer eller på korte (2-3 μπι) bæreceller. Phialiderne er opbygget fra en opsvulmet basis (2-4 x 2-3 μτη) og en lang trådagtig hals (2-4 x 0,5-0,6 μτη) . Conidierne på hovederne er små (2-3 x 1,3-2,2 μτη) , som regel kugleformede og glatte. Den specifikke betegnelse "varium" refererer 25 til phialidernes variabilitet. Tolypocladium varium hår i sit livsforløb en vis lighed med slægten Harposporium, som vi vil gøre rede for andetsteds. Stammen CY/93 kan ikke udnytte raffinose, men den vokser godt på følgende kulstofkilder: mannitol, inositol, sakkarose, fruktose, ramnose, ga-30 laktose, glukose, arabinose og xylose i overfladekultur. Kulturerne udvikler sig dårligt på næringsagar og maltekstraktagar og udvikler sig godt på sojamelsagar, Czapeks agar og kartoffel-glukose-agar. Havremelsagar og glukose-gæreks-traktagar egner sig ikke til oplagring.

35 Tolypocladium varium afviger tydeligt fra Tolypocla dium trigonosporum, der producerer conidierne som set forfra er trekantede med svagt konkave kanter. Tolypocladium varium 5 DK 174719 B1 er også forskellig fra Tolypocladium balanoides. Sidstnævnte danner lageniforme laterale phialider.

Desuden er holotype-stammen (CY/93) af Tolypocladium varium n. sp. forskellig fra den autentiske type stamme af 5 Tolypocladium inflatum (CBS 714.70) i den henseende at sidstnævnte stamme udvikler et rigt hvidt luftmycelium ved dyrkning på maltose-agar-næringsmedium mens Tolypocladium varium sp. nov. CY/93 ikke danner et sådant luftmycelium. Typestammen af Tolypocladium inflatum producerer et rødlig-10 brunt endopigment i sit substratmycelium på et jern-pepton-agar dyrkningsmedium mens substratmyceliet af Tolypocladium varium sp. nov. CY/93 forbliver lysegult. Stammen Tolypocladium varium sp. nov. CY/93 udnytter ikke arabinose mens Tolypocladium inflatum gør. Ved udnyttelse af natriumnitrit 15 udvikler sidstnævnte stamme rige mycelier mens Tolypocladium varium sp. nov. CY/93 næsten ikke vokser under disse omstændigheder .

En sammenligning af Tolypocladium varium sp. nov.

CY/93 med autentiske stammer af andre arter af Tolypocladi-20 um, med Trichoderma polysporum ATCC 16.S41 og med Cylindro-carpon lucidum NRRL 5760 er vist summarisk i tabel I.

\ DK 174719 B1 6

Tabel I

ΒπΒμ B Si

Ή 0s* Ή Q Ή O Ή -Η (Π CT

c Ό\ΌίίιθΌϋθ,σ oOneE'-hi u fDiHfntnr'icwr^tof^rocNfip'^rOo

r-H O i—i O i“H O · '—I * rH Γ» φ M CD O CD

o ΐίί® y -- y t? q ^ 5 e n* QE Q'O'— Q Ό <— Q V) C< Q UJ O Os'- 'O 3 W) O, 3 Qi C r- Dj C r- ο, φ r~- d φ χ: in c Ό

>ϊ·η >th 5-i-h So S'O u >iU -h -< J

^ Vi r-ί i—i CO f—1 i—i CO i—! O CO i—lO "'“I 1—I O 1—I U IC

__g g g »8 g 5-8 gg,B g 8, £8.g &3S

•Nedbrydning af 1Q cellulose_ - - - +++ +++

Luftmycelium: grønt _ eller blåliggrønt

Produktion af et rødt opløseligt - - - - +++ pigment på King-agar 1^ Produktion af et brunt pigment på - - - +++ jern-pepton-agar

Produktion af et mørkebrunt pigment „ _ _ _ ] | t på syntetisk glycerol-agar 20 Udnyttelse af +++ +-h- _ +++ sakkarose

Udnyttelse af , , , mulm Vækst ved 5°C +++ +++ -H-f +++ +++ Vækst ved 37°C - - -- + +++ 25 Resistens mod varmebehandling ved +++ - t++ +++ 50°C i 60 minutter

Syreproduktion ud w w + + ++++++ +++ fra glukose

Udnyttelse af ,,, ,,, 30 natriumsalicylat _

Udnyttelse af ++++++__++++ natriurrmalonat ____

Udnyttelse af + ++++__++++ natriumtartrat __

Produktion af et 35 lilla opløseligt ,,, ,,, pigment på tyro- ' _++++++_ sin- og leucin- agar_____ 7 DK 174719 B1

Baseret på den ovenfor refererede resultater angår opfindelsen en mikrobiel fremgangsmåde til fremstilling af et cyklosporin-antibiotikumkompleks eller dets komponenter cyklosporin A, cyklosporin B og cyklosporin C ved aerob gæ-5 ring af en trådformet svampestamme som biosyntetiserer ovennævnte antibiotikum eller antibiotika i et næringsmedium indeholdende udnyttelige kilder til kulstof og nitrogen såvel som mineralsalte, og påfølgende isolering af de dannede produkter, og fremgangsmåden er ejendommelig ved at man dyr-10 ker en stamme af den hidtil ukendte svampeart Tolypocladium varium som producerer cyklosporin-antibiotikumkomplekset, nemlig Tolypocladium varium sp. nov. CY/93 som er deponeret hos National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest, Ungarn under accessionsnummeret 15 NCAIM(P)F 001005, på et næringsmedium indeholdende kilder til kulstof, kilder til organisk og uorganisk bundet nitrogen såvel som mineralsalte, under aerobe betingelser ved en temperatur i området 25-30°C og eventuelt isolering og rensning af cyklosporin-antibiotikumkomplekset eller dens 20 komponenter som produceret.

Tolypocladium varium sp. nov. stammen CY/93 er særdeles fordelagtig på grund af sin hurtige vækst. Det er et gunstigt træk at stammen kan udnytte sakkarose, glukose, sorbose, maltose, fruktose, stivelse og glycerol såvel som 25 forskellige fedtstoffer og olier som kulstofkilder, og en række forskellige organiske og uorganiske nitrogenkilder såsom majsstøbevand, pepton, gærekstrakt, kødekstrakt, natriumnitrat, ammoniumnitrat og ammoniumsulfat såvel som forskellige aminosyrer. Foruden de ovennævnte kulstofkilder og 30 nitrogenkilder kan de næringsmedier der bruges til produktionen af cyklosporin-antibiotikumkomplekset tillige indeholde mineralske salte (kaliumklorid, magnesiumsulfat eller kali-umdihydrogenfosfat), sporelementer (kobber, mangan, jernsalte) og desuden vitaminer og antiskumningsmidler.

35 I henhold til en foretrukken udførelsesform for frem gangsmåden ifølge opfindelsen podes et flydende medium med en suspension af conidier og mycelier fremstillet ud fra en 8 DK 174719 B1 agar-skråkultur af Tolypocladium varium sp. nov. CY/93. Efter dyrkning i 3 dage bruges den opnåede forkultur til podning af det medium der skal bruges til antibiotikumproduktionen og derefter inkuberes der ved 25-30°C, fortrinsvis 5 25°C, i 5-7 dage. Under gæringens forløb holdes pH-værdien i området 6,0 til 2,5, fortrinsvis på 5,2. Gæringen udføres under aerobe betingelser under kraftig omrøring (750-1000 opm) og luftning i en mængde på 300 liter/time.

Under gæringsprocessen overvåges cyklosporinindholdet 10 i gæringssuppen ved mikrobiel bestemmelse og højtryks-væ-skekromatografering. Så snart den maksimale mængde antibiotika er produceret udvindes de fra dyrkningsvæsken på kendt måde ved ekstraktions- og/eller adsorptionsmetoder.

Cyklosporinkoncentrationen i suppen måles på basis af 15 cyklosporiners antifungale aktivitet ved en pladediffusionsprøve. Aspergillus niger, Aspergillus japonicus og Curvu-laria lunata kan bruges med fordel som testorganismer (M.Dreyfuss et al., European J. Appl. Microbiol. 3., 125-133, 1976). HPLC-analysen af cyklosporinkoncentrationen i dyrk-20 ningssuppen udførtes fra prøver af suppen fortyndet 10 gange med metanol i henhold til F. Kreuzig (J. Chromat. 290, 181, 1984). Ved forsøg der ligger til grund for nærværende opfindelse produceres cyklosporin-antibiotikumkomplekset indeholdende cyklosporin A som hovedprodukt og cyklosporin B og 25 cyklosporin C som mindre andele, i højt udbytte (950 ) af den nye stamme Tolypocladium varium sp. nov. CY/93.

Der kan med fordel bruges ekstraktionsmetoder til i-solering af cyklosporinkomplekset fra gæringssuppen. Før ekstraktionen fraskilles myceliet enten ved filtrering eller 30 ved centrifugering. Antibiotika som er produceret under gæringen kan med fordel udvaskes fra mikroorganismecellerne med lavtkogende alkanoler, fortrinsvis med metanol, eller med organiske ketoner, fortrinsvis med acetone, mens cyklo-sporinerne i suppefiltratet kan ekstraheres med vandubland-35 bare organiske opløsningsmidler såsom ætylacetat, n-butyla-cetat, diklormetan, 1,2-diklorætan eller kloroform, fortrinsvis med n-butylacetat. Det ved ekstraktionen vundne 9 DK 174719 B1 råprodukt er forurenet med røde og violette pigmenter produceret af svampen, og de kan fjernes ved adsorption på aktivt kul eller silikagel. Eventuelle lipid-forureninger {fx an-tiskumningsmiddel) kan fraskilles ved fordeling i et system 5 med petroleumsæter og metanol indeholdende 10% vand, i hvilket urenhederne overføres til petroleumsæterfasen.

Den vandige metanolfase koncentreres ved nedsat tryk hvorefter den vandige remanens ekstraheres med diklormetan som afdampes til frembringelse af renset cyklosporin, Cy-10 klosporin A kan skilles fra de kvantitativt mindre cyklospo-rinkomponenter ved søjlekromatografering og omkrystallisering.

Strukturen af de isolerede produkter blev belyst ved 1 13 UV, IR, H NMR, C NMR, massespektroskopi og aminosyreana-15 lyse.

De følgende eksempler tjener til nærmere belysning af fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Eksempel 1 20 ----------

En suspension af conidier og mycelium opnået fra en skråkultur af Tolypocladium varium nov. sp. CY/93 på maltekstrakt -gærekstrakt -agar blev tilberedt med 5 ml af en 0,9%s natriumkloridopløsning. 1 ml af denne suspension bru-25 ges til podning af 100 ml sterilt IC-podningsmedium i en 500 ml stor Erlenmeyer-kolbe.

10 DK 174719 B1

Sammensætning af IC-mediet Glukose 40 g

Kasein-pepton 5 g

Natriumnitrat 3 g 5 Kaliumdihydrogenfosfat 2 g

Kaliumklorid 0,5 g

Magnesiumsulfat, 7 Η2<0 0,5 g

Jern(II)sulfat, 7 H20 0,01 g i 1000 ml postevand 10 Næringsmediets pH-værdi reguleres til 5,2 før sterilisering og blandingen steriliseres ved 121°C i 25 minutter. Kulturen inkuberes ved 25°C på en roterende ryster (340 opm) hvorefter der bruges portioner på 5 ml af dette podningsme-15 dium til podning af femten 500 ml store Erlenmeyer-kolber indeholdende hver 100 ml FC1 sterilt medium.

Sammensætning af FC^-mediet Glukose 80 g 20 Trypton 40 g

Urinstof 2 g

Ammoniumsulfat 12 g

Natriumnitrat 3 g

Kaliumdihydrogenfosfat _ 2 g 25 Kaliumklorid 0,5 g

Magnesiumsulfat, 7 H2<0 0,5 g

Jern(II)sulfat, 7 H20 0,0l g i 1000 ml postevand * 30 Næringsmediets pH-værdi reguleres til 5,2 før steri lisering og blandingen steriliseres ved 121°C i 25 minutter.

Kolberne inkuberes på en roterende ryster (340 opm (omdrejninger pr. minut)) ved 25°C. Under gæringen overvåges antibiotikumkoncentrationen i suppen ved en pladediffusi-35 onsprøve. Aspergillus niger anvendes som testorganisme. Koncentrationen af cyklosporin-antibiotikumkomplekset i suppen bestemmes under anvendelse af cyklosporin A som standard.

11 DK 174719 B1 Gæringen fortsættes i 168 timer hvorefter suppen indeholder 400 μο/τηΐ cyklosporin-antibiotikumkompleks. Cyklo-sporinkomplekset isoleres på følgende måde.

Cellerne i en liter af suppen filtreres og de antibi-5 otiske stoffer udvaskes to gange med 200 ml metanol. Den vandige metanolopløsning koncentreres under nedsat tryk hvorefter antibiotikumkomplekset ekstraheres fra det vandige koncentrat med 2 x 50 ml n-butylacetat. Indholdet af cyklo-sporin i suppefiltratet ekstraheres med 200 ml n-butylace-10 tat. n-Butylacetatekstrakterne forenes, tørres over vandfrit natriumsulfat og inddampes derefter ved nedsat tryk ved 40°C. Det derved vundne 3,7 g råprodukt opløses i 10 ml metanol og overføres til toppen af en gelkolonne af "Sepha-dex" LH-20 {kolonnens længde 40 cm, dens diameter 2,5 cm) 15 tilberedt med metanol. Derefter fraskilles lipid-urenhederne ved eluering med metanol. De fraktioner som indeholder cy-klosporinkomplekset inddampes under nedsat tryk ved 40°C.

Fraskilleisen af de vundne komponenter af cyklosporinkom-plekset {1,05 g) udføres ved kromatografering på en silika-20 gelkolonne tilberedt af 20 g kiselgel 40 (Reanal, Budapest) ved eluering med opløsningsmiddelblandinger af kloroform og metanol indeholdende gradvis stigende rumfang af metanol. Elueringen begyndes med 100 ml kloroform og fortsættes derefter med blandinger af kloroform og metanol i hvilke meta-25 nolindholdet i hver 100 ml stor portion forøges med 0)5%. Cyklosporinindholdet i fraktionerne overvåges ved tyndlags-kromatografering (plade: kiselgel 60 F254, Dc "Alufoil" (Merck) under fremkaldelse med ætylacetat/isopropanol 95:5 og detektering med joddampe). Cyklosporinerne A, B og C elu-30 eres fra kolonnen med blandinger af metanol og kloroform indeholdende henholdsvis 2,0%, 2,5% og 3,0% metanol. De fraktioner som indeholder de rene komponenter inddampes under nedsat tryk og der vindes 225 mg cyklosporin A {smp. 137-140°C, åaÅ^ = -189° (metanol)), 25 mg cyklosporin B (smp, 35 149-151°C) og 52 mg cyklosporin C (smp. 150-152°C).

12 DK 174719 B1

Eksempel 2

Fem liter IC-podningsmedium, steriliseret ved 121°C i 45 minutter i en 10 liter stor laboratoriefermentor podes 5 med 200 ml af en pode-rystekultur tilberedt som beskrevet i eksempel 1 og inkuberes derefter ved 25°C under omrøring med 750 opm og luftning med 300 liter luft i timen.

Gæringen fortsættes i 72 timer hvorefter 500 ml af dette podningsmedium bruges til podning af 5 liter FC2~medi-10 um steriliseret ved 12l°C i 45 minutter i en 10 liter stor laboratoriefermentor.

Sammensætning af FC2-medium Glukose 80 g 15 Trypton 40 g

Urinstof 2 g

Ammoniumsulfat 12 g

Natriumnitrat 3 g

Kaliumdihydrogenfosfat 2 g 20 Kaliumklorid 0,5 g

Magnesiumsulfat, 7 H20 0,5 g

Kobber(II)sulfat, 5 H20 0,01 g

Mangan(II)sulfat, 7 H20 0,01 g

Jern(II)sulfat, 7 H20 0,01 g 25 ilOOOml postevand

Mediets pH-værdi reguleredes til 5,2 før sterilisering. Den podede kultur inkuberes ved 25°C under omrøring med 750 opm og luftning med 300 liter/time.

30 Gæringen fortsættes under de netop nævnte betingelser i 144 timer indtil der er opnået top-titere af cyklosporin hvorpå suppen indhøstes.

Cyklosporin A isoleres ved nedenstående metode fra de 4,8 liter af gæringssuppen, indeholdende 500 /^g/ml af cy-35 klosporinkomplekset.

Cellerne af mikroorganismen centrifugeres og cyklo-sporinkomplekset udvaskes fra cellerne med 2 x 1 ml metanol.

13 DK 174719 B1

Den vandige metanolopløsning koncentreres under nedsat tryk hvorefter antibiotikumkomplekset ekstraheres fra den vandige koncentration med 2 x 250 ml n-butylacetat.

Cyklosporinkomplekset ekstraheres fra filtratet af 5 gæringssuppen med 2 x 500 ml n-butylacetat. Alle n-butylace-tatekstrakterne forenes, og tørres over vandfrit natriumsulfat hvorpå opløsningen inddampes under nedsat tryk ved 40°C.

Den foreløbige rensning af det opnåede råprodukt (19,2 g) udføres ved kromatografering på en kolonne tilberedt ud fra 10 100 g kiselgel 60 {partikelstørrelse 0,063-0,2 mm) med et

fremkaldelsesopløsningsmiddel af kloroform/metanol/acetone 92:4:4. De fraktioner som indeholder cyklosporinkomplekset (tyndlagskromatografisk analyse; plade: kiselgel 60 F254' DC "Alufoil" (Merck); fremkaldelse-opløsningsmiddel hexan/ace-15 tone 2:1; detektering: klor/tolidin-reagens) inddampes til tørhed. Inddampningsresten (5,28 g) underkastes søjlekroma-tografering til frembringelse af cyklosporin A. Kolonnen tilberedes på 115 g kiselgel 60 (partikelstørrelse 0,063-0,2 mm) og den elueres med blandinger af hexan og acetone inde-20 holdende gradvist stigende rumfang acetone. Cyklosporin A

elueres fra kolonnen med en blanding indeholdende 23% acetone. Ved inddampning af de fraktioner som indeholder cyklosporin A vindes der 1,46 g cyklosporin A.

25 Eksempel 3

Der tilberedes en suspension af conidier og mycelium med 5 ml af en 0,9%s natriumkloridopløsning og ud fra en skråkultur på maltekstrakt-gærekstrakt-agar af Tolypocladium 30 varium nov. sp. CY/93, og den bruges til podning af 800 ml af det i eksempel 1 beskrevne IC-podningsmedium hvorpå der steriliseres i en 3 liter stor Erlenmeyer-kolbe. Kolben inkuberes på en roterende ryster (340 opm) ved 25°C i 2,5 dage og derefter podes dens indhold over i 5 liter af et FC^-me-35 dium steriliseret i en 10 liter stor laboratorietermentor ved 121°C i 45 minutter.

14 DK 174719 B1

Sammensætning af FC^-mediet Sorbose 60 g

Trypton 40 g

Urinstof 2 g 5 Ammoniumsulfat 12 g

Natriumnitrat 3 g kaliumdihydrogenfosfat 2 g

Kaliumklorid 0,5 g

Magnesiumsulfat, 7 H20 0,5 g 10 Mangan(II) sulfat, 7 Η2<0 0,01 g

Jern(II)sulfat, 7 Η,,Ο 0,01 g i 1000 ml postevand.

Mediets pH-værdi reguleres til 5,2 før sterilisering.

15 Den podede kultur inkuberes ved 25°C under omrøring med 1000 opm og luftning med 300 liter/time.

Gæringen udføres i 168 timer hvorefter gæringssuppen i henhold til mikrobiel bestemmelse indeholder 600 /zg/ml af cyklosporinkomplekset.

20 Ved isolering som beskrevet i eksempel 2 vindes der 310 mg cyklosporin A fra 1 liter af suppen.

Eksempel 4 25 Der tilberedes en suspension med 5 ml 0,9%s natrium kloridopløsning af conidier og mycelium fra en 5 til 7 dage gammel skråkultur på maltekstrakt-gærekstrakt-agar af Toly-pocladium varium nov. sp. CY/93 (NCAIM(P)F 001005) og suspensionen bruges til podning af 500 ml'IC-podningsmedium som 30 beskrevet i eksempel 1 hvorefter der steriliseres i en 3 liter stor Erlenmeyerkolbe. Kolben inkuberes på en roterende ryster (340 opm) ved 25°C i 3 dage og derefter podes 5 liter af et FC^-medium, steriliseret i en 10 liter stor laborato-riefermentor ved 121°C i 45 minutter, dermed.

35 15 DK 174719 B1

Sammensætning af FC^-mediet Maltose 80 g

Trypton 40 g

Urinstof 2 g 5 Ammoniumsulfat 12 g

Natriumnitrat 3 g

Kaliumdihydrogenfosfat 2 g

Kaliumklorid 0,5 g

Magnesiumsulfat, 7 H20 0,5 g 10 Mangan(II)sulfat, 7 H^O 0,01 g

Kobber(II)sulfat, 5 Η2<5 0,01 g

Jern(II)sulfat, 7 H20 0,01 g i 1000 ml postevand 15 Mediets pH-værdi reguleres til 5,2 før sterilisering.

Efter podning inkuberes gæringssuppen ved 25°C under omrøring med 1000 opm og luftning med 300 liter/time.

Gæringen gennemføres i 144 timer hvorefter gæringssuppen i henhold til mikrobiel bestemmelse indeholder 620 20 /^g/ml af cyklosporinkomplekset.

Isolering foretages ved den fremgangsmåde der er beskrevet i eksempel l. På denne måde vandtes der 305 mg cyklosporin A fra 1 liter gæringssuppe.

25 Eksempel 5 I 5 ml 0,9%s natriumkloridopløsning tilberedes der en suspension af conidier og mycelium fra en 5 til 7 dage gammel skråkultur på maltekstrakt-gærekstrakt-agar af Tolypo-30 cladium varium nov. sp. CY/93 (NCAIM(P)F 001005), og suspensionen bruges til podning af 500 ml af det i eksempel 1 beskrevne IC-podningsmedium og der steriliseres i en 3 liter stor Erlenmeyer-kolbe. Kolben inkuberes på en roterende ryster (340 opm) ved 25°C i 2 dage, hvorefter 5 liter af et 35 FC^-medium, steriliseret i en 10 liter stor laboratoriefer-mentor ved 121°C i 45 minutter, podes dermed. Efter podningen omrøres gæringssuppen med 750 opm ved 25°C og luftes med 16 DK 174719 B1 300 liter/time. Efter dyrkning i 96 timer tilsættes der en steriliseret vandig opløsning af 100 g maltose og gæringen fortsættes indtil den 144. time på hvilket tidspunkt suppen i henhold til mikrobiel bestemmelse indeholder 950 μg/ml af 5 cyklosporinkomplekset. Ialt indhøstes der 4,8 liter af suppen. Isolering udført ved den metode som er beskrevet i eksempel 2 gav 2,75 g cyklosporin A.

Claims (3)

17 DK 174719 B1

1. Mikrobiel fremgangsmåde til fremstilling af et cyk-1osporinkompleks eller dets komponenter cyklosporin A, cyk- 5 losporin B og cyklosporin C ved aerob gæring af en trådformet svampestamme som biosyntetiserer ovennævnte antibiotikum eller antibiotika, i et næringsmedium indeholdende udnyttelige kilder til kulstof og nitrogen såvel som mineralsalte og påfølgende isolering af de dannede produkter, kende -10 tegnet ved at man dyrker en stamme af den hidtil u-kendte svampeart Tolypocladium varium som producerer cyklo-sporin-antibiotikumkomplekset, nemlig Topypocladium varium sp. nov. CY/93, som er deponeret hos National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest, Ungarn 15 under accessionsnummeret NCAIM(P)F 001005, på et næringsmedium indeholdende kilder til kulstof, kilder til organisk og uorganisk bundet nitrogen såvel som mineralsalte, under aerobe betingelser ved 25-30°C og om ønsket påfølgende isolerer og renser det producerede cyklosporin-antibioti-20 kumkompleks eller dets komponenter.

2. Fremgangsmåde ifølge krav l, kendetegnet ved at gæringen udføres i et dyrkningsmedium indeholdende pepton, ammoniumsulfat og trypton som nitrogenkilder og glukose, maltose og sorbitol som kulstofkilder.

3. Tolypocladium varium sp. nov. CY/93, deponeret hos National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest, Ungarn under accessionsnummeret NCAIM(P)F 001005, til anvendelse ved fremstilling af et cyklosporinkompleks eller dets komponenter, cyklosporin A, 30 cyklosporin B og cyklosporin C.