KR100341355B1 - 사이클로스포린a의제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명에 따르면, 톨리포클라디움 인플라튬 변이주의 배양액에 저급 알칸올 용매를 가하여 추출하고, 이 추출액을 저급 할로겐화 탄화수소 용매로 전이시킨 다음, 수득된 용액을 수세 및 활성탄 처리하고 건고시킨 다음, 건고분에 케톤 용매를 가하여 결정화시키는 것을 특징으로 하는 사이클로스포린 A의 제조 방법이 제공된다.

본 발명의 결정화 용매로 사용되는 케톤 용매로서는 부탄온, 아세토페논 또는 아세톤의 단일 용매가 사용될 수 있다.

본 발명의 방법은 종래의 기술에 비하여, 배양액을 여과함이 없이 바로 용매 추출하고, 특히 크로마토그래피 메디아를 사용하는 과정이 생략되므로 공정 경제 및 환경보호 측면에서 매우 유리하다.

Description

사이클로스포린 A의 제조 방법

본 발명은 하기 일반식(I)로 표시되는 사이클로스포린 A를 제조하는 새로운 방법에 관한 것이다.

상기식의 사이클로스포린 A는 생산균주인 톨리포클라디움 인플라튬(Tolypocladium inflatum)의 배양액으로부터 얻어지며, 11개의 아미노산으로 구성된, 분자량 1201, 조성식 C₆₂H₁₁₁N₁₁O₁₂의 환형 펩타이드로서 아미노산의 종류에 따라 25개의 유도체가 있다[ Traber R., HELVETICA ACTA, 70, 13(1987) ].

사이클로스포린 A의 화학명은 사이클로[{(E)-(2S,3R,4R)-3-히드록시-4-메틸-2-(메틸아미노)-6-옥테노일}-L-2-아미노부티릴-N-메틸-글리실-N-메틸-L-로이실-L-발릴-N-메틸-L-로이실-L-알라닐-O-알라닐-N-메틸-L-로이실-N-메틸-L-로이실-N-메틸-L-발릴]로서 면역억제 능력이 매우 강하고, 장기 이식시 거부반응 억제 및 자가 면역증 치료에 사용되고 있으며, 항진균, 살충 및 소염 효과도 있는 것으로 알려져 있다 [ Borel J. F., Prog. Allergy, 38.9(1986) ].

사이클로스포린 A를 제조하는 방법에 관해서는 영국 특허 1,491,509와 미국 특허 4,117,118 호 및 동 4,215,199 호에 곰팡이균의 종인 신린드로 카폰 루시딤 또는 톨리포클라디움 인플라튬의 발효에 의한 방법이 각각 기재되어 있다. 또한 상기 특허에는 발효액으로부터 사이클로스포린 A를 회수하기 위한 여러가지 방법이 포함되어 있다.

상기 특허에 있어서 발효핵으로부터 사이클로스포린 A를 회수하기 위한 방법을 살펴보면, 먼저 발효액으로부터 분리된 마이셀리움을 용매추출한 다음, 추출물을 세파덱스, 알루미늄 옥사이드 및 실리카겔 등의 크로마토그래피 메디아를 순차적으로 사용하여 회수하는 기법을 사용하고 있다. 즉, 이러한 방법들은 발효액을 여과하여 분리된 고체물인 마이셀리움에 용매를 가한 다음, 원심분리 추출기에 의해 용매 추출하고, 이 추출용액을 물 및 헥산 등의 전처리를 거친 후, 세파덱스, 알루미늄 옥사이드 및 실라카겔 등의 크로마토그래피 메디아를 통해 정제함으로써 사이클로스포린 A를 수득한다. 그러나, 이러한 방법들은 배양액을 여과하여 분리된고체물인 마이셀리움을 용매추출하고, 고가의 세파덱스를 포함하여 2-3가지의 크로마토그래피 메디아를 사용함으로써 공정이 복잡할 뿐 아니라 각각의 크로마토그래피 메디아 사용시마다 별도의 전개 용매를 사용하여야 하므로, 공정 경제상의 문제 및 환경문제를 초래할 수 있다.

따라서, 이러한 공정의 복잡성 및 그로 인한 경제적 손실을 극복하기 위한 별도의 정제 방법이 연구되었다.

예를 들면, 미국 특허 5,256,547과 유럽 특허 057,968 A1에서는 배양액을 여과하여 분리된 고체물인 마이셀리움을 건조시킨 후, 건조된 마이셀리움으로부터 조 사이클로스포린 A를 용매 추출하고, 물 등의 세척과정이 생략된 전처리를 거쳐, 크로마토그래피 메디아도, 고가의 세파덱스 사용을 생략하고 알루미늄 옥사이드와 실리카겔을 이용하여 사이클로스포린 A를 수득한다. 또한 미국 특허 5,156,960에서는 배양액에 용매를 직접 가하여 추출한 다음 이 추출액을 용해성이 보다 좋은 용매로 전이시킨 후 이 용액을 무수 황산 마그네슘의 건조제로 건조시키고 세파덱스와 실리카겔 등의 크로마토그래피를 거쳐 사이크로스포린 A를 수득한다.

그러나, 상기 미국 특허 5,256,547에서는 건조 마이셀리움으로부터의 용매추출로 색소의 감소 및 용매 전처리 공정 및 크로마토그래피 메디아의 공정단축 등의 장점이 있으나, 마이셀리움을 건조시키는 공정이 추가되는 단점이 지적되며, 상기 미국 특허 5,156,960에서는 배양액을 여과한 다음 분리된 마이셀리움으로부터 용매추출하는 번거로움을 거치지 않고 배양액에 직접 용매를 가하여 용매추출함과 동시에 용매의 전처리 과정을 거치지 않고 크로마토그래피 메디아 공정을 수행한다는장점이 부각되나 이러한 공정의 단축으로 인하여 전이용매에 다량의 수분이 함유되고 이 수분을 제거하기 위하여 고가의 무수 황산 마그네슘으로 건조시키는 새로운 공정이 추가된다는 단점이 발생되고, 크로마토그래피 공정도 세파덱스와 실리카겔의 2가지 크로마토그래피 메디아를 사용하여 사이클로스포린 A를 수득하는 바, 이는 산업적으로 이용하기에 경제적으로 불리하다는 문제점이 내재되어 있다.

따라서, 본 발명자들은 크로마토그래피 메디아를 거치지 않고 사이클로스포린 A를 제조할 수 있는 보다 경제적인 방법을 개발하고자 더욱 연구에 주력하여 톨리포클라디움 인플라튬의 변이주 배양액에 알칸올 용매를 가하여 용매추출한 다음 이 추출액을 용해성이 보다 좋은 저급 염화탄화수소 용매로 전이시키고 이 용액을 수세 및 활성탄 처리한 후 건고시키고, 이 건고분에 케톤 용매를 가하여 사이클로스포린 A를 결정화시켜 고순도의 사이클로스포린 A를 수득하는 새로운 방법을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

상기의 배양액 추출 과정에서는 알칸올 용매가 사용된다. 알칸올 용매가 첨가되는 양은 배양액 부피의 약 2배 정도가 바람직하며, 추출은 30분 정도 교반하면서 수행하는 것이 바람직하다. 또한 이 추출 용매를 사이클로스포린 A에 대한 용해성이 좋은 또다른 용매로 전이시키는 과정에서 사용되는 저급 염화탄화수소 용매로는 염화메틸렌, 염화에틸렌, 클로로포름 등이 사용가능하며, 그중에서도 염화메틸렌을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 이 추출물을 수세 및 활성탄 처리후 건고시키고 건고물을 결정화하는 과정에서 사용하는 케톤 용매로서는 부탄온, 아세토페논, 아세톤 등을 들 수 있으며, 그중에서도 아세톤을 사용하는 것이 바람직하다.

종래의 사이클로스포린 A의 제법에서는 크로마토그래피 메디아(실리카겔)를 거친 후 결정화시 결정화 용매로 에틸 에테르와 메톡시메탄의 혼합 용매를 사용하여 사이클로스포린 A를 수득하였으나, 본 발명에서는 크로마토그래피 메디아 공정을 전혀 사용하지 않으며 결정화시 결정화 용매로서 단일 케톤 용매를 선택 사용함으로써 불순물인 유도체들을 모액으로 전량 배제시키고 순수한 사이클로스포린 A를 결정으로 얻을 수 있었다.

즉, 본 발명의 방법은 전이 용매로서 저급 염화탄화수소를 선택한 점과 수세, 활성탄 처리, 및 건고 공정으로 이어지는 개선된 처리 공정에 의해 크로마토그래피 메디아를 거치지 않은 상태에서도 사이클로스포린 A의 순도가 높아져 있으므로 직접 케톤 용매로 결정화함으로써 만족할 만한 순도의 사이클로스포린 A를 경제적으로 수득할 수 있게 한다.

따라서, 본 발명의 방법은 배양액을 여과함이 없이 바로 용매추출할 뿐만 아니라, 산업적으로 사용하기에 부적합하고 고가의 크로마토그래피 메디아가 요구되는 크로마토그래피 공정이 배제되고, 결정화 과정에서도 단일 용매를 사용하여 용매 회수가 용이하므로 경제적 측면 및 환경오염 방지의 측면에서 매우 유리하다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시 양태를 실시예를 들어 설명하나 본 발명은 이에 국한되는 것은 아니다.

실시예 1

사이클로스포린 A(7,215 μg/ml)를 함유한 배양액(1.5L)에 메탄올 3L를 가한 후, 혼합물을 여과하여 사이클로스포린 A를 추출해낸다. 상기 추출물에 염화메틸렌2L를 가하여 추출하고, 수용성 불순물을 제거하기 위해 3회에 걸쳐 수세한 후 건고시킨다.

수득된 건고물에 에틸 아세테이트 50ml를 가하여 용해시키고 유색 불순물을 제거하기 위해 활성탄 30g을 첨가한 다음 여과하고 건고시킨다. 이 건고물에 아세톤 20ml를 첨가하고 -5℃ 이하에서 30분간 교반한다. 생성된 침전물을 분리하여 사이클로스포린 A 6.5g을 수득한다.(함량:98-99%).

실시예 2

사이클로스포린 A의 결정화 단계에서 용매로서 아세톤 대신 아세토페논을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1 에서와 같은 과정을 반복하여 사이클로스포린 A 를 수득한다(함량:98-99%).

Claims (3)

1. 톨리포클라디움 인플라튬 변이주의 배양액에 메탄올, 에탄올, 프로판올 또는 부탄올 중에서 선택된 용매를 가하여 추출하고, 이 추출액을 염화메틸렌, 염화에틸렌 또는 클로로포름 중에서 선택된 용매로 전이시킨 다음, 수득된 용액을 수세 및 활성탄 처리하고 건고시킨 다음, 건고분에 케톤 용매를 가하여 결정화시키는 것을 특징으로 하는 사이클로스포린 A의 제조 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 케톤 용매가 부탄온, 아세토페논 및 아세톤에서 선택된 단일 용매임을 특징으로 하는 방법.
3. 제 2 항에 있어서, 케톤 용매가 아세톤임을 특징으로 하는 방법.