JP4202433B2 - 天然に存在するマクロライドを回収するための新規な抽出法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、天然に存在する中性のマクロライド、特に、ラパマイシン、３２-デスメチルラパマイシン、１５-デオキソラパマイシン、またはＦＫ-５０６などの三環式マクロライドを、発酵工程によって得られる天然に存在する他の成分から分離する方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、三環式マクロライドラパマイシンを、発酵ブロス抽出物や母液の濃縮物から回収する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
ラパマイシンやＦＫ-５０６によって例示される三環式マクロライドは、抗生物質としての活性や他の薬理学的活性だけでなく、免疫抑制活性を有することから、移植片や移植組織の拒絶反応、炎症の疾患、および、狼瘡、慢性関節リウマチ、真性糖尿病、多発性硬化症などの自己免疫疾患を治療または処置するのに有用である。
【０００３】
ラパマイシン、３２-デスメチルラパマイシン、１５-デオキソラパマイシンおよびＦＫ-５０６などの三環式マクロライドは、様々なストレプトマイセス（Streptomyces）株を適切な条件下で発酵することによって産生されるが、これらのマクロライドは、塩基性アミノ基やフェノール基、カルボン酸基を有しないので、中性である。例えば、ラパマイシンは、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス（S.hygroscopicus）ＮＲＲＬ５４９１を水性培地中で培養することによって産生される。三環式マクロライドを含有する菌糸は、増殖培地から回収し、メタノールなどの有機溶媒で抽出し、所望の三環式マクロライド、関連化合物、脂肪酸などの酸性化合物、アルカロイドやペプチドなどの塩基性化合物、および、脂肪などの中性親油性混合物からなる混合物を得る。典型的には、発酵ブロス抽出物は、運搬および／または貯蔵を容易にするために、マクロライドを単離することができるまで濃縮する。発酵ブロス抽出物から三環式マクロライドを単離精製することは、本発明の以前は、精製物を得るために様々な化学的方法やクロマトグラフィー技術を採用しており、面倒で費用の掛かる工程であった。（例えば、米国特許第5,091,398号；米国特許第3,993,749号；国際公開第93/11130号；セーガル（Sehgal)、ジャーナル・オブ・アンチバイオティクス（J．of Antibiotics）28巻(10)727頁(1975年)を参照）。ラパマイシン用の発酵ブロス抽出物の濃縮物は、例えば、わずか５〜１５％のラパマイシンと約５０％までの酸性成分とを含有しており、ラパマイシンは他の成分から分離しなければならない。典型的には、発酵ブロス抽出物から三環式マクロライドを回収する工程には、活性炭に対する吸着および脱着、選択的溶解度の手法、ならびに、カラムクロマトグラフィーおよび／または高性能液体クロマトグラフィーを用いた１回またはそれ以上の時間と費用の掛かるクロマトグラフィーの手法が必要である。ラパマイシンなどの三環式マクロライドは、酸性または塩基性条件下では不安定であると考えられるので、これまで、酸性または塩基性条件は回避されてきた。メタノールやテトラヒドロフランなどの水混和性溶液中におけるラパマイシンは、水酸化ナトリウム水溶液などの無機塩基、４-ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）や１,８-ジアザビシクロ［５.４.０］ウンデカ-７-エン（ＤＢＵ）などの有機塩基、あるいは、塩酸などの鉱酸水溶液や、塩化亜鉛などのルイス酸によって、分解を受ける。（例えば、ステファン（Steffan）ら、テトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Letters）（印刷中）、ディー・ヨハネス（D.Yohanes）およびエス・ジェイ・ダニシェフスキー（S.J.Danishefsky）、テトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Letters）33巻(49)7469-7472頁(1992年)；ルエンゴ（Luengo）ら、テトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Letters）34巻(6)991-994頁(1993年)およびディー・ヨハネス（D.Yohannes）ら、テトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Letters）34巻(13)2075-2078頁(1993年)を参照）。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、マクロライド、特に三環式マクロライド、より特定的にはラパマイシンを、発酵ブロス抽出物の濃縮物や、再結晶溶媒、すり砕きおよび産物の洗浄から得た母液またはその濃縮物から回収する比較的迅速で効率的な方法を提供する。発酵ブロス抽出物としては、マクロライドを産生するいかなる菌株の発酵工程で得られるものであってもよく、また、いかなる種類の培地を用いて得られるものであってもよい。かかる方法は、米国特許第5,091,389号；米国特許第3,993,749号；国際公開第93/11130号；およびセーガル（Sehgal）、ジャーナル・オブ・アンチバイオティクス（J．of Antibiotics）28巻(10)727頁(1975年)に例示されている時間と費用の掛かるクロマトグラフィー分離工程を回避するものである。この方法は、マクロライド含有濃縮物を適当な水不混和性溶媒に溶解し、酸性および／または塩基性成分をそれぞれ塩基または酸の水溶液中に抽出し、選択的溶解度の手法や抽出法を用いて、濃縮物中に存在する無極性で中性の物質から中性で極性の三環式マクロライドを分離することによって、中性成分から酸性および／または塩基性成分を分離することを包含する。ここで説明する方法は発酵ブロス抽出物や母液の濃縮物に言及しているが、全抽出物溶液や母液溶液は、発酵ブロスの抽出や再結晶、すり砕きや洗浄に用いた溶媒または溶媒混合物が本発明の方法に適していて、その溶媒の容量が厄介なものでなければ、本発明の方法に用いることができる。溶媒の容量は、部分的に濃縮することによって減少させてもよい。本発明の方法を適用しうる溶液は、いずれもマクロライド含有濃縮物と呼ばれる。
【０００５】
すなわち、本発明のマクロライド分離回収法は、マクロライドを含有する発酵ブロス抽出物または母液の濃縮物中に存在する酸性、塩基性および無極性中性の不純物からマクロライドを分離するにあたり、ａ）水不混和性の溶媒中における該濃縮物の溶液を塩基の水溶液で抽出して、実質的にすべての酸性不純物を除去する工程、ｂ）水不混和性の溶媒中における該濃縮物の溶液を酸の水溶液で抽出して、実質的にすべての塩基性不純物を除去する工程、およびｃ）該濃縮物の溶液を芳香族でない炭化水素溶媒で処理して、無極性中性の不純物を除去する工程の１またはそれ以上を任意の順番で包含することを特徴とする。
【０００６】
この方法によって得られた産物は、当業者に公知の標準的な手法によって、満足な純度まで精製することができる。
【０００７】
本発明方法の概略を図１に示す。本発明の方法に関する下記の説明において、無極性溶媒とは、シクロヘキサン、シクロヘキセン、ヘキサン、ヘプタン、ペンタンなどの芳香族でない炭化水素溶媒である。芳香族でない炭化水素溶媒と混和しない溶媒としては、アセトニトリルやジメチルホルムアミドなどが挙げられるが、これらに限定されることはない。抽出なる用語は、ある溶液を別の不混和性溶液と充分に混合し、不混和性溶液に一方を他方から分離させ、一方の層または相を他方から物理的に取り出す手法を意味する。洗浄なる用語は、溶液に言及する場合は、抽出の手法を意味し、固形物に言及する場合は、固形物を実質的に溶解しない溶媒で該固形物をすすぐことを意味する。母液なる用語は、水性抽出物の結晶化の際の濾液、洗浄液および逆抽出や、採取した固形物の洗浄およびすり砕きから得た有機溶媒溶液を意味する。マクロライド溶媒とは、マクロライドおよびそれに付随する酸性または塩基性成分などの不純物を溶解する溶媒または溶媒混合物である。マクロライド非溶媒とは、マクロライドを実質的に溶解しないが、脂肪などの中性成分は溶解する溶媒または溶媒混合物である。マクロライド結晶化溶媒とは、マクロライドを再結晶化できるか、あるいは、すり砕きによって非晶質状態から結晶化できる溶媒または溶媒混合物である。この方法が溶液の濃縮を必要とする場合、溶媒または溶媒混合物は、分解を生じない温度および圧力条件下で留去するのに充分な揮発性を有することが好ましい。
【０００８】
本発明の方法によれば、マクロライドを含有する濃縮物は、発酵ブロス抽出物の濃縮物からであろうと、再結晶および／または洗浄溶媒からの濃縮物であろうと、該濃縮物を溶解する能力や除去する容易さについて選択した水不混和性溶媒または溶媒混合物に溶解される。かかる溶媒および溶媒混合物の例としては、ジクロロメタン、ｔ-ブチルメチルエーテル、酢酸エチル、トルエン、１-ブタノール、酢酸エチル／トルエン混合物、ヘプタン／酢酸エチル混合物、およびヘキサン／塩化メチレン混合物などが挙げられるが、これらに限定されることはない。酸性成分を抽出するには、塩基の水溶液が有用である。かかる塩基としては、特に、水酸化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化アンモニウム（アンモニア水）などが挙げられ、水酸化ナトリウムが好ましい。塩基水溶液の濃度は、一般的には０.１〜５Ｎ、好ましくは約０.１〜１.０Ｎ、最も好ましくは約０.１〜約０.５Ｎの範囲内である。酸性成分を除去する際、トリエチルアミンなどの有機塩基は、無機強塩基の水溶液ほど効率的ではない。塩基性成分を抽出するには、鉱酸の水溶液が有用である。かかる鉱酸としては、特に、塩酸、リン酸一カリウム、硫酸一ナトリウムなどが挙げられ、塩酸が好ましい。鉱酸水溶液の濃度は、一般的には０.１〜５Ｎ、好ましくは約０.１〜１.０Ｎ、最も好ましくは約０.１〜約０.５Ｎの範囲内である。塩基性成分を除去する際、トリフルオロ酢酸などの有機酸は、鉱酸ほど効率的ではない。マクロライドを含有する溶液から酸性および／または塩基性成分を抽出する工程は、一般的には約−５℃〜約４５℃、好ましくは約−５℃〜約３０℃、最も好ましくは約−５℃〜約１０℃の範囲内の温度で都合よく実施される。酸や塩基によってマクロライドが分解するのを回避するために、抽出工程は直ちに完了させる必要がある。存在する酸性成分および／または塩基性成分の量によっては、必ずしも酸性成分および塩基性成分の両方を抽出する必要はなく、マクロライド含有溶液から充分な不純物を除去し、三環式マクロライドの単離を可能にするのに、酸性成分または塩基性成分のいずれか一方を抽出するだけで充分な場合もある。
【０００９】
時間の掛からない１回の抽出工程でマクロライド含有濃縮物の溶液から酸性（または塩基性）成分を除去するのが有利である。抽出工程で過剰の塩基（または酸）が利用可能になる塩基（または酸）水溶液の必要量は、マクロライド含有濃縮物の溶液から採取したアリコートを塩基（または酸）水溶液で抽出し、ｐＨメーターまたは他のｐＨ決定手段を用いて、化学量論的に過剰の塩基（または酸）が利用可能になるｐＨを有するアリコートの抽出物を与えるのに必要な塩基（または酸）水溶液の容量を測定することによって、決定することができる。このとき、アリコートを採取する溶液を抽出するのに必要な塩基（または酸）水溶液の容量は、抽出すべき溶液の容量とそれから採取したアリコートとの割合に比例する。かくして、酸性（塩基性）成分の抽出は、塩基（または酸）水溶液を用いて多数回の抽出を行うよりむしろ、１回の操作で実施することができる。マクロライド含有濃縮物の溶液から酸性成分および塩基性成分の両方を除去すべき場合には、明らかに、それぞれ塩基水溶液および酸水溶液を用いた別々の抽出を実施しなければならない。ラパマイシン含有濃縮物の溶液の場合、実質的にすべての酸性成分を除去するには、例えば、最終的にｐＨ１２を与えるのに充分な水酸化ナトリウム水溶液を用いた１回の抽出で充分である。
【００１０】
上記の工程を用いて溶液から回収したマクロライドは、当業者に公知の従来の精製技術によって、所望の純度まで精製することができる。
【００１１】
マクロライドを含有する水不混和性の溶媒溶液から酸性および／または塩基性成分を除去するために抽出法を実施した後、マクロライドは、下記の方法の１つによって、無極性中性成分から分離すればよい。
【００１２】
（１）酸性および／または塩基性成分を抽出した水不混和性の溶媒中にマクロライドを含有する溶液と混和するマクロライド非溶媒（または溶媒混合物）を、充分な量だけ、マクロライド含有溶液に添加し、得られた溶液にマクロライドおよびおそらくマクロライド関連産物が溶解しないようにし、分離層（すなわち、油状物または固形物のいずれか）を形成させる。かかる分離層は、次いで、当業者に公知の通常の分離技術によって分離すればよい。
【００１３】
（２）酸性および／または極性成分を抽出した水不混和性の溶媒中にマクロライドを含有する溶液を濃縮し、マクロライドを含有する残留物を、アセトニトリルまたはジメチルホルムアミドなどのマクロライドを溶解する溶媒に溶解し、シクロヘキサン、ヘキサン、ヘプタンまたはシクロヘキサンなどの芳香族でない炭化水素溶媒で抽出した。マクロライドを溶解する溶媒の層を分離し、濃縮する。マクロライドを含有する残渣は、次いで、マクロライドが固形物の場合は、結晶化溶媒と共にすり砕き、マクロライドを得るが、マクロライドが油状物の場合には、クロマトグラフィーなどの当業者に公知の技術によって精製する。あるいは、マクロライドを溶解する溶媒は、芳香族でない炭化水素溶媒で抽出した後、上記の方法（１）と同様に、マクロライドを溶解しない混和性の溶媒で処理してもよい。
【００１４】
（３）酸性および／または塩基性成分を抽出した水不混和性の溶媒中にマクロライドを含有する溶液を濃縮し、得られた残留物を、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテルまたはｔ-ブチルメチルエーテルなどのマクロライド結晶化溶媒と共にすり砕く。
【００１５】
あるいは、マクロライド含有濃縮物は、まず上記の方法（１）〜（３）の１つに従って抽出し、無極性成分を除去し、次いで、マクロライドを含有する残渣を、水不混和性溶媒に（かかる残渣がこのような溶媒中になければ）溶解し、塩基および／または酸水溶液を用いて抽出し、酸性および／または塩基性成分を除去することができる。
【００１６】
上記の方法は、マクロライド含有濃縮物の水不混和性溶媒溶液を酸または塩基水溶液で抽出する手法に供した場合に、ラパマイシンなどのマクロライドが分解しないという予期せぬ発見を利用するものである。これまでは、ラパマイシンが溶液状態で酸や塩基に曝露されると分解が観察されることから、分解が生じるものと考えられていた。
【００１７】
この抽出法は、かかる濃縮物からマクロライドを回収するのに必要な時間を大幅に短縮し、時間と費用が掛かるクロマトグラフィー工程を回避する。
【００１８】
三環式マクロライドのラパマイシンは、メタノールやアセトン、ジメチルホルムアミドなどには溶解し、ジエチルエーテルには少し溶解し、ヘキサンや石油エーテルにはわずかに溶解するが、水には溶解しない結晶性固体である。ラパマイシンは以下に示すような化学構造を有する。なお、各原子の番号付けは、ケミカル・アブストラクツ（Chemical Abstracts）で採用されているものである。
【００１９】
【化１】
【００２０】
以下の実施例は、発酵ブロスおよび母液の濃縮物からラパマイシンを単離する本発明の方法を単に例示するものであって、本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。以下の実施例において、単離した産物がラパマイシンであることは、その物理的性質、スペクトルやクロマトグラフィーの特性などを本物のラパマイシンと比較することによって、確認した。産物（非結晶状態）の純度は、高性能液体クロマトグラフィー分析によって決定した。
【００２１】
【実施例】
実施例１
塩化メチレン（６００ｍｌ）中に溶解した濃縮発酵ブロス抽出物（１５７.０ｇ、ラパマイシン含量１０.４％）の溶液を、０〜５℃にて、０.５Ｎ ＮａＯＨ溶液で各１５０ｍｌずつ３回洗浄した後、洗浄液が中性になるまで水で洗浄し、次いで、食塩水で洗浄した。この塩化メチレン溶液を濃縮し、残渣（７０.５ｇ）をジエチルエーテル（１４０ｍｌ）と共にすり砕いた。結晶性固体を採取し、ジエチルエーテルで洗浄し、乾燥させ、ラパマイシン（６.３ｇ、純度９１.７％、収率３５.４％）を得た。ジエチルエーテル濾液を濃縮し、ラパマイシン含量１３.１％の油状物６３.５ｇを得た。
【００２２】
実施例２
濃縮発酵ブロス抽出物（２０６.０ｇ、ラパマイシン含量１１.８％）の溶液を、ｔ-ブチルメチルエーテル（８００ｍｌ）中に溶解し、０〜５℃にて、０.５ＮＮａＯＨ溶液で各４００ｍｌずつ３回洗浄し、次いで、洗浄液が中性になるまで水で洗浄した。このｔ-ブチルメチルエーテル溶液を濃縮し、残渣（７５.０ｇ）をジエチルエーテル（１５０ｍｌ）と共にすり砕いた。結晶性固体を採取し、ジエチルエーテルで洗浄し、乾燥させ、ラパマイシン（１１.４ｇ、純度９２.２％、収率４３.３％）を得た。ジエチルエーテル濾液を濃縮し、ラパマイシン含量１１.３％の油状物５８.７ｇを得た。
【００２３】
実施例３
アセトニトリル（２３ｍｌ）中に溶解した濃縮発酵ブロス抽出物（１０.５８ｇ、ラパマイシン含量１０.４％）の溶液を、シクロヘキサンで各２３ｍｌずつ２回洗浄し、次いで、濃縮した。残渣をジクロロメタンに溶解し、０〜５℃にて、０.５Ｎ塩酸溶液で各２３ｍｌずつ２回、０〜５℃にて、０.５Ｎ ＮａＯＨ溶液で各２３ｍｌずつ３回、次いで、洗浄液が中性になるまで水で洗浄した。このジクロロメタン溶液を濃縮し、残渣（４.０７ｇ）をジエチルエーテルと共にすり砕いた。結晶性固体を採取し、ジエチルエーテルで洗浄し、乾燥させ、ラパマイシン（０.６４ｇ、純度８９.５％、収率５８.２％）を得た。ジエチルエーテル濾液を濃縮し、ラパマイシン含量９.８％の油状物３.３６ｇを得た。
【００２４】
実施例４
酢酸エチル（４００ｍｌ）中に溶解した濃縮発酵ブロス抽出物（１００.０ｇ、ラパマイシン含量１１.８％）の溶液を、０〜５℃にて、０.５Ｎ ＮａＯＨ溶液の２００ｍｌで１回、各１００ｍｌずつ２回洗浄し、次いで、０〜５℃にて、０.５Ｎ 塩酸溶液で各２００ｍｌずつ２回洗浄し、最後に、洗浄液が中性になるまで水で洗浄した。水性洗浄液を酢酸エチル（１００ｍｌ）で逆抽出し、得られた酢酸エチル溶液を合わせた。この酢酸エチル溶液を濃縮し、残渣（４３.２ｇ）をジイソプロピルエーテル（４５ｍｌ）と共にすり砕いた。結晶性固体を採取し、ジイソプロピルエーテルで洗浄し、乾燥させ、９.５ｇのラパマイシン（純度８５.３％、収率６８.７％）を得た。ジイソプロピルエーテル濾液を濃縮し、ラパマイシン含量６.６％の油状物（３１.６ｇ）を得た。
【００２５】
実施例５
トルエン（１２０ｍｌ）および酢酸エチル（２５ｍｌ）の混合物中に溶解した濃縮発酵ブロス抽出物（２５.２ｇ、ラパマイシン含量１０.４％）の溶液を、０〜５℃にて、０.５Ｎ ＮａＯＨ溶液で各５０ｍｌずつ３回、０〜５℃にて、０.５Ｎ塩酸で各５０ｍｌずつ２回、次いで、洗浄液が中性になるまで水で洗浄した。トルエン／酢酸エチル溶液（１２８ｍｌ）を２等分し、以下の方法によって、さらに処理した。
【００２６】
方法Ａ トルエン／酢酸エチル溶液（６４ｍｌ）を濃縮し、残渣（５.７ｇ）をジエチルエーテル（１１ｍｌ）と共にすり砕いた。結晶性固体を採取し、追加のジエチルエーテルで洗浄し、乾燥させ、０.８４ｇのラパマイシン（純度９２.７％、収率６４.１％）を得た。ジエチルエーテル濾液を濃縮し、ラパマイシン含量６.８％の油状物４.３ｇを得た。
【００２７】
方法Ｂ トルエン／酢酸エチル溶液（６４ｍｌ）を濃縮し、残渣（９.０ｇ）をアセトニトリル（５０ｍｌ）に溶解した。このアセトニトリル溶液をシクロヘキサンで各２５ｍｌずつ２回洗浄した。このアセトニトリル溶液を、次いで、濃縮し、残渣（４.３ｇ）をジエチルエーテル（１１ｍｌ）と共にすり砕いた。結晶性固体を採取し、ジエチルエーテルで洗浄し、乾燥させ、０.８１ｇのラパマイシン（純度９４.６％、収率６１.８％）を得た。ジエチルエーテル濾液を濃縮し、ラパマイシン含量５.９％の油状物３.０ｇを得た。
【００２８】
実施例６
母液濃縮物（９９６.０ｇ、ラパマイシン含量２１.６％）をｔ-ブチルメチルエーテル（４０００ｍｌ）と共にすり砕いた。結晶性固体を採取し、ｔ-ブチルメチルエーテル（５００ｍｌ）で洗浄し、乾燥させ、３６.２ｇのラパマイシン（純度９５.１％、収率１３.８％）を得た。濾液を、０〜５℃にて、０.５Ｎ水酸化ナトリウム溶液の２０００ｍｌで１回、各１０００ｍｌずつ２回洗浄した。合わせた塩基抽出物をｔ-ブチルメチルエーテル（５００ｍｌ）で１回洗浄した。このｔ-ブチルメチルエーテル濾液および抽出物を合わせ、洗浄液が中性になるまで水で洗浄した。水抽出物を合わせ、ｔ-ブチルメチルエーテル（５００ｍｌ）で抽出した。ｔ-ブチルメチルエーテル溶液を合わせ、濃縮し、残渣（３７７.１ｇ）をジイソプロピルエーテル（３５０ｍｌ）と共にすり砕いた。結晶性固体を採取し、ジイソプロピルエーテルで洗浄し、乾燥させ、１２６.７ｇのラパマイシン（純度８２.４％、収率５８.９％）を得た。かくして、母液濃縮物からのラパマイシンの全回収量は１６２.９ｇ（７２.７％）であった。ジイソプロピルエーテル濾液を濃縮し、ラパマイシン含量２０.９％の油状物１５７.９ｇを得た。
【００２９】
実施例７
ジクロロメタン（２０００ｍｌ）中に溶解した母液濃縮物（５６２.１ｇ、ラパマイシン含量２１.６％）の溶液を、０〜５℃にて、０.５Ｎ水酸化ナトリウム溶液で各５００ｍｌずつ３回洗浄し、合わせた塩基水溶液抽出物を２００ｍｌのジクロロメタンで１回抽出した。有機溶液を合わせて、０〜５℃にて、０.５Ｎ塩酸溶液で各５００ｍｌずつ２回洗浄した。合わせた酸水溶液抽出物を２００ｍｌのジクロロメタンで１回抽出した。合わせた有機抽出物を、洗浄液が中性になるまで水で洗浄した。有機溶液を濃縮し、残渣（２５５.０ｇ）をジイソプロピルエーテル（２５０ｍｌ）と共にすり砕いた。結晶性固体を採取し、ジイソプロピルエーテルで洗浄し、乾燥させ、ラパマイシン１０８.６ｇ（純度８６.６％、回収率７７.４％）を得た。ジイソプロピルエーテル濾液を濃縮し、ラパマイシン含量２３.１％の油状物１００.２ｇを得た。
【００３０】
実施例８
０〜５℃の０.５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（４００ｍｌ）を、８００ｍｌのｔ-ブチルメチルエーテル中に溶解した濃縮発酵ブロス抽出物（１９８.５ｇ、ラパマイシン含量８.３％）の激しく撹拌冷却した（０〜５℃）溶液に、温度が０〜５℃を維持し得るような割合で添加した。５分間激しく撹拌した後、下側の塩基水溶液層を取り出し、０〜５℃で保存した。有機層を、０〜５℃にて、０.５Ｎ水酸化ナトリウム溶液で各２００ｍｌずつ２回再抽出した。塩基水溶液抽出物を合わせ、ｔ-ブチルメチルエーテル（２００ｍｌ）で再抽出した。ｔ-ブチルメチルエーテル溶液を合わせ、洗浄液が中性（ｐＨ＝７）になるまで水で洗浄した。水性洗浄液を合わせ、ｔ-ブチルメチルエーテル（１００ｍｌ）で抽出した。ｔ-ブチルメチルエーテル溶液を合わせ、飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、真空下、４０℃で濃縮した。残渣を、２０〜２５℃にて、ジイソプロピルエーテル（８５ｍｌ）と共に、最低１時間すり砕き、この混合物を０〜５℃で一晩冷却した。焼結ガラス製ブフナー漏斗を用いて、結晶性固体を採取し、２０〜２５℃にて、ジイソプロピルエーテル−ｔ-ブチルメチルエーテルの４：１混合物で（５×２０ｍｌまたは濾液が無色になるまで）洗浄した。結晶性固体を一定重量になるまで乾燥させ、１２.０ｇのラパマイシン（純度９１.２％、回収率６６.４％）を得た。ｔ-ブチルメチルエーテル濾液を濃縮し、洗浄し、ラパマイシン含量３.６３％のガム質６３.９ｇを得た。
【００３１】
実施例９
母液濃縮物（２００ｇ、ラパマイシン含量２５％）を、室温でｔ-ブチルメチルエーテル（８００ｍｌ）に撹拌溶解した。撹拌溶液を０〜５℃に冷却し、直ちに、予め０〜５℃に冷却した２７０ｍｌの０.６５Ｎ水酸化ナトリウム溶液で、混合物の温度を０〜５℃に維持しながら、抽出した。（抽出物が最終的にｐＨ１２となるのに必要な水酸化ナトリウム水溶液の量は、濃縮母液のアリコートについて決定した。）
【００３２】
塩基水溶液層は０〜５℃で保存し、有機層は５％塩化ナトリウム溶液で、混合物を０〜５℃に維持しながら、洗浄した。塩基水溶液抽出物をｔ-ブチルメチルエーテル（１００ｍｌ）で逆抽出した。有機層を合わせ、５％塩化ナトリウム溶液で各２００ｍｌずつ３回洗浄した（最終洗浄溶液のｐＨは７.４）。有機溶液を、減圧（６０〜１３０ｍｍＨｇ）下、２５〜４０℃の温度で濃縮した。残渣にシクロヘキセン（８０ｍｌ）を、室温で３０分間かけて、撹拌しながら徐々に添加し、結晶化が完了するまで撹拌した（３時間）。この混合物を室温で１時間またはそれ以上撹拌し、０〜５℃に冷却し、一晩撹拌した。次いで、オフホワイト色の結晶性固体をガラス製ブフナー漏斗で採取した。得られた固形物をｔ-ブチルメチルエーテルおよびシクロヘキセンの２：３混合物で各４０ｍｌずつ５回洗浄した。この固形物を３５〜４０℃の真空オーブン中で一定重量になるまで乾燥させ、２２.７ｇのラパマイシン（純度９０.６％、回収率４１.１％）を得た。濾液および洗浄液（ｔ-ブチルメチルエーテルおよびシクロヘキセン）を濃縮し、ラパマイシン含量３７.５％の油状物６０.１ｇを得た。
【００３３】
【発明の効果】
本発明によれば、マクロライドを産生する菌株の発酵工程で得られる発酵ブロス抽出物や、その後の操作で得られた母液の濃縮物からマクロライドを回収する方法が提供される。かかる方法は、時間と費用の掛かるクロマトグラフィー技術を用いず、単純な抽出工程によってマクロライドを分離回収しているので、比較的迅速で効率的である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のマクロライド分離回収法の概略を示す図である。
【産業上の利用分野】
本発明は、天然に存在する中性のマクロライド、特に、ラパマイシン、３２-デスメチルラパマイシン、１５-デオキソラパマイシン、またはＦＫ-５０６などの三環式マクロライドを、発酵工程によって得られる天然に存在する他の成分から分離する方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、三環式マクロライドラパマイシンを、発酵ブロス抽出物や母液の濃縮物から回収する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
ラパマイシンやＦＫ-５０６によって例示される三環式マクロライドは、抗生物質としての活性や他の薬理学的活性だけでなく、免疫抑制活性を有することから、移植片や移植組織の拒絶反応、炎症の疾患、および、狼瘡、慢性関節リウマチ、真性糖尿病、多発性硬化症などの自己免疫疾患を治療または処置するのに有用である。
【０００３】
ラパマイシン、３２-デスメチルラパマイシン、１５-デオキソラパマイシンおよびＦＫ-５０６などの三環式マクロライドは、様々なストレプトマイセス（Streptomyces）株を適切な条件下で発酵することによって産生されるが、これらのマクロライドは、塩基性アミノ基やフェノール基、カルボン酸基を有しないので、中性である。例えば、ラパマイシンは、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス（S.hygroscopicus）ＮＲＲＬ５４９１を水性培地中で培養することによって産生される。三環式マクロライドを含有する菌糸は、増殖培地から回収し、メタノールなどの有機溶媒で抽出し、所望の三環式マクロライド、関連化合物、脂肪酸などの酸性化合物、アルカロイドやペプチドなどの塩基性化合物、および、脂肪などの中性親油性混合物からなる混合物を得る。典型的には、発酵ブロス抽出物は、運搬および／または貯蔵を容易にするために、マクロライドを単離することができるまで濃縮する。発酵ブロス抽出物から三環式マクロライドを単離精製することは、本発明の以前は、精製物を得るために様々な化学的方法やクロマトグラフィー技術を採用しており、面倒で費用の掛かる工程であった。（例えば、米国特許第5,091,398号；米国特許第3,993,749号；国際公開第93/11130号；セーガル（Sehgal)、ジャーナル・オブ・アンチバイオティクス（J．of Antibiotics）28巻(10)727頁(1975年)を参照）。ラパマイシン用の発酵ブロス抽出物の濃縮物は、例えば、わずか５〜１５％のラパマイシンと約５０％までの酸性成分とを含有しており、ラパマイシンは他の成分から分離しなければならない。典型的には、発酵ブロス抽出物から三環式マクロライドを回収する工程には、活性炭に対する吸着および脱着、選択的溶解度の手法、ならびに、カラムクロマトグラフィーおよび／または高性能液体クロマトグラフィーを用いた１回またはそれ以上の時間と費用の掛かるクロマトグラフィーの手法が必要である。ラパマイシンなどの三環式マクロライドは、酸性または塩基性条件下では不安定であると考えられるので、これまで、酸性または塩基性条件は回避されてきた。メタノールやテトラヒドロフランなどの水混和性溶液中におけるラパマイシンは、水酸化ナトリウム水溶液などの無機塩基、４-ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）や１,８-ジアザビシクロ［５.４.０］ウンデカ-７-エン（ＤＢＵ）などの有機塩基、あるいは、塩酸などの鉱酸水溶液や、塩化亜鉛などのルイス酸によって、分解を受ける。（例えば、ステファン（Steffan）ら、テトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Letters）（印刷中）、ディー・ヨハネス（D.Yohanes）およびエス・ジェイ・ダニシェフスキー（S.J.Danishefsky）、テトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Letters）33巻(49)7469-7472頁(1992年)；ルエンゴ（Luengo）ら、テトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Letters）34巻(6)991-994頁(1993年)およびディー・ヨハネス（D.Yohannes）ら、テトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Letters）34巻(13)2075-2078頁(1993年)を参照）。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、マクロライド、特に三環式マクロライド、より特定的にはラパマイシンを、発酵ブロス抽出物の濃縮物や、再結晶溶媒、すり砕きおよび産物の洗浄から得た母液またはその濃縮物から回収する比較的迅速で効率的な方法を提供する。発酵ブロス抽出物としては、マクロライドを産生するいかなる菌株の発酵工程で得られるものであってもよく、また、いかなる種類の培地を用いて得られるものであってもよい。かかる方法は、米国特許第5,091,389号；米国特許第3,993,749号；国際公開第93/11130号；およびセーガル（Sehgal）、ジャーナル・オブ・アンチバイオティクス（J．of Antibiotics）28巻(10)727頁(1975年)に例示されている時間と費用の掛かるクロマトグラフィー分離工程を回避するものである。この方法は、マクロライド含有濃縮物を適当な水不混和性溶媒に溶解し、酸性および／または塩基性成分をそれぞれ塩基または酸の水溶液中に抽出し、選択的溶解度の手法や抽出法を用いて、濃縮物中に存在する無極性で中性の物質から中性で極性の三環式マクロライドを分離することによって、中性成分から酸性および／または塩基性成分を分離することを包含する。ここで説明する方法は発酵ブロス抽出物や母液の濃縮物に言及しているが、全抽出物溶液や母液溶液は、発酵ブロスの抽出や再結晶、すり砕きや洗浄に用いた溶媒または溶媒混合物が本発明の方法に適していて、その溶媒の容量が厄介なものでなければ、本発明の方法に用いることができる。溶媒の容量は、部分的に濃縮することによって減少させてもよい。本発明の方法を適用しうる溶液は、いずれもマクロライド含有濃縮物と呼ばれる。
【０００５】
すなわち、本発明のマクロライド分離回収法は、マクロライドを含有する発酵ブロス抽出物または母液の濃縮物中に存在する酸性、塩基性および無極性中性の不純物からマクロライドを分離するにあたり、ａ）水不混和性の溶媒中における該濃縮物の溶液を塩基の水溶液で抽出して、実質的にすべての酸性不純物を除去する工程、ｂ）水不混和性の溶媒中における該濃縮物の溶液を酸の水溶液で抽出して、実質的にすべての塩基性不純物を除去する工程、およびｃ）該濃縮物の溶液を芳香族でない炭化水素溶媒で処理して、無極性中性の不純物を除去する工程の１またはそれ以上を任意の順番で包含することを特徴とする。
【０００６】
この方法によって得られた産物は、当業者に公知の標準的な手法によって、満足な純度まで精製することができる。
【０００７】
本発明方法の概略を図１に示す。本発明の方法に関する下記の説明において、無極性溶媒とは、シクロヘキサン、シクロヘキセン、ヘキサン、ヘプタン、ペンタンなどの芳香族でない炭化水素溶媒である。芳香族でない炭化水素溶媒と混和しない溶媒としては、アセトニトリルやジメチルホルムアミドなどが挙げられるが、これらに限定されることはない。抽出なる用語は、ある溶液を別の不混和性溶液と充分に混合し、不混和性溶液に一方を他方から分離させ、一方の層または相を他方から物理的に取り出す手法を意味する。洗浄なる用語は、溶液に言及する場合は、抽出の手法を意味し、固形物に言及する場合は、固形物を実質的に溶解しない溶媒で該固形物をすすぐことを意味する。母液なる用語は、水性抽出物の結晶化の際の濾液、洗浄液および逆抽出や、採取した固形物の洗浄およびすり砕きから得た有機溶媒溶液を意味する。マクロライド溶媒とは、マクロライドおよびそれに付随する酸性または塩基性成分などの不純物を溶解する溶媒または溶媒混合物である。マクロライド非溶媒とは、マクロライドを実質的に溶解しないが、脂肪などの中性成分は溶解する溶媒または溶媒混合物である。マクロライド結晶化溶媒とは、マクロライドを再結晶化できるか、あるいは、すり砕きによって非晶質状態から結晶化できる溶媒または溶媒混合物である。この方法が溶液の濃縮を必要とする場合、溶媒または溶媒混合物は、分解を生じない温度および圧力条件下で留去するのに充分な揮発性を有することが好ましい。
【０００８】
本発明の方法によれば、マクロライドを含有する濃縮物は、発酵ブロス抽出物の濃縮物からであろうと、再結晶および／または洗浄溶媒からの濃縮物であろうと、該濃縮物を溶解する能力や除去する容易さについて選択した水不混和性溶媒または溶媒混合物に溶解される。かかる溶媒および溶媒混合物の例としては、ジクロロメタン、ｔ-ブチルメチルエーテル、酢酸エチル、トルエン、１-ブタノール、酢酸エチル／トルエン混合物、ヘプタン／酢酸エチル混合物、およびヘキサン／塩化メチレン混合物などが挙げられるが、これらに限定されることはない。酸性成分を抽出するには、塩基の水溶液が有用である。かかる塩基としては、特に、水酸化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化アンモニウム（アンモニア水）などが挙げられ、水酸化ナトリウムが好ましい。塩基水溶液の濃度は、一般的には０.１〜５Ｎ、好ましくは約０.１〜１.０Ｎ、最も好ましくは約０.１〜約０.５Ｎの範囲内である。酸性成分を除去する際、トリエチルアミンなどの有機塩基は、無機強塩基の水溶液ほど効率的ではない。塩基性成分を抽出するには、鉱酸の水溶液が有用である。かかる鉱酸としては、特に、塩酸、リン酸一カリウム、硫酸一ナトリウムなどが挙げられ、塩酸が好ましい。鉱酸水溶液の濃度は、一般的には０.１〜５Ｎ、好ましくは約０.１〜１.０Ｎ、最も好ましくは約０.１〜約０.５Ｎの範囲内である。塩基性成分を除去する際、トリフルオロ酢酸などの有機酸は、鉱酸ほど効率的ではない。マクロライドを含有する溶液から酸性および／または塩基性成分を抽出する工程は、一般的には約−５℃〜約４５℃、好ましくは約−５℃〜約３０℃、最も好ましくは約−５℃〜約１０℃の範囲内の温度で都合よく実施される。酸や塩基によってマクロライドが分解するのを回避するために、抽出工程は直ちに完了させる必要がある。存在する酸性成分および／または塩基性成分の量によっては、必ずしも酸性成分および塩基性成分の両方を抽出する必要はなく、マクロライド含有溶液から充分な不純物を除去し、三環式マクロライドの単離を可能にするのに、酸性成分または塩基性成分のいずれか一方を抽出するだけで充分な場合もある。
【０００９】
時間の掛からない１回の抽出工程でマクロライド含有濃縮物の溶液から酸性（または塩基性）成分を除去するのが有利である。抽出工程で過剰の塩基（または酸）が利用可能になる塩基（または酸）水溶液の必要量は、マクロライド含有濃縮物の溶液から採取したアリコートを塩基（または酸）水溶液で抽出し、ｐＨメーターまたは他のｐＨ決定手段を用いて、化学量論的に過剰の塩基（または酸）が利用可能になるｐＨを有するアリコートの抽出物を与えるのに必要な塩基（または酸）水溶液の容量を測定することによって、決定することができる。このとき、アリコートを採取する溶液を抽出するのに必要な塩基（または酸）水溶液の容量は、抽出すべき溶液の容量とそれから採取したアリコートとの割合に比例する。かくして、酸性（塩基性）成分の抽出は、塩基（または酸）水溶液を用いて多数回の抽出を行うよりむしろ、１回の操作で実施することができる。マクロライド含有濃縮物の溶液から酸性成分および塩基性成分の両方を除去すべき場合には、明らかに、それぞれ塩基水溶液および酸水溶液を用いた別々の抽出を実施しなければならない。ラパマイシン含有濃縮物の溶液の場合、実質的にすべての酸性成分を除去するには、例えば、最終的にｐＨ１２を与えるのに充分な水酸化ナトリウム水溶液を用いた１回の抽出で充分である。
【００１０】
上記の工程を用いて溶液から回収したマクロライドは、当業者に公知の従来の精製技術によって、所望の純度まで精製することができる。
【００１１】
マクロライドを含有する水不混和性の溶媒溶液から酸性および／または塩基性成分を除去するために抽出法を実施した後、マクロライドは、下記の方法の１つによって、無極性中性成分から分離すればよい。
【００１２】
（１）酸性および／または塩基性成分を抽出した水不混和性の溶媒中にマクロライドを含有する溶液と混和するマクロライド非溶媒（または溶媒混合物）を、充分な量だけ、マクロライド含有溶液に添加し、得られた溶液にマクロライドおよびおそらくマクロライド関連産物が溶解しないようにし、分離層（すなわち、油状物または固形物のいずれか）を形成させる。かかる分離層は、次いで、当業者に公知の通常の分離技術によって分離すればよい。
【００１３】
（２）酸性および／または極性成分を抽出した水不混和性の溶媒中にマクロライドを含有する溶液を濃縮し、マクロライドを含有する残留物を、アセトニトリルまたはジメチルホルムアミドなどのマクロライドを溶解する溶媒に溶解し、シクロヘキサン、ヘキサン、ヘプタンまたはシクロヘキサンなどの芳香族でない炭化水素溶媒で抽出した。マクロライドを溶解する溶媒の層を分離し、濃縮する。マクロライドを含有する残渣は、次いで、マクロライドが固形物の場合は、結晶化溶媒と共にすり砕き、マクロライドを得るが、マクロライドが油状物の場合には、クロマトグラフィーなどの当業者に公知の技術によって精製する。あるいは、マクロライドを溶解する溶媒は、芳香族でない炭化水素溶媒で抽出した後、上記の方法（１）と同様に、マクロライドを溶解しない混和性の溶媒で処理してもよい。
【００１４】
（３）酸性および／または塩基性成分を抽出した水不混和性の溶媒中にマクロライドを含有する溶液を濃縮し、得られた残留物を、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテルまたはｔ-ブチルメチルエーテルなどのマクロライド結晶化溶媒と共にすり砕く。
【００１５】
あるいは、マクロライド含有濃縮物は、まず上記の方法（１）〜（３）の１つに従って抽出し、無極性成分を除去し、次いで、マクロライドを含有する残渣を、水不混和性溶媒に（かかる残渣がこのような溶媒中になければ）溶解し、塩基および／または酸水溶液を用いて抽出し、酸性および／または塩基性成分を除去することができる。
【００１６】
上記の方法は、マクロライド含有濃縮物の水不混和性溶媒溶液を酸または塩基水溶液で抽出する手法に供した場合に、ラパマイシンなどのマクロライドが分解しないという予期せぬ発見を利用するものである。これまでは、ラパマイシンが溶液状態で酸や塩基に曝露されると分解が観察されることから、分解が生じるものと考えられていた。
【００１７】
この抽出法は、かかる濃縮物からマクロライドを回収するのに必要な時間を大幅に短縮し、時間と費用が掛かるクロマトグラフィー工程を回避する。
【００１８】
三環式マクロライドのラパマイシンは、メタノールやアセトン、ジメチルホルムアミドなどには溶解し、ジエチルエーテルには少し溶解し、ヘキサンや石油エーテルにはわずかに溶解するが、水には溶解しない結晶性固体である。ラパマイシンは以下に示すような化学構造を有する。なお、各原子の番号付けは、ケミカル・アブストラクツ（Chemical Abstracts）で採用されているものである。
【００１９】
【化１】
以下の実施例は、発酵ブロスおよび母液の濃縮物からラパマイシンを単離する本発明の方法を単に例示するものであって、本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。以下の実施例において、単離した産物がラパマイシンであることは、その物理的性質、スペクトルやクロマトグラフィーの特性などを本物のラパマイシンと比較することによって、確認した。産物（非結晶状態）の純度は、高性能液体クロマトグラフィー分析によって決定した。
【００２１】
【実施例】
実施例１
塩化メチレン（６００ｍｌ）中に溶解した濃縮発酵ブロス抽出物（１５７.０ｇ、ラパマイシン含量１０.４％）の溶液を、０〜５℃にて、０.５Ｎ ＮａＯＨ溶液で各１５０ｍｌずつ３回洗浄した後、洗浄液が中性になるまで水で洗浄し、次いで、食塩水で洗浄した。この塩化メチレン溶液を濃縮し、残渣（７０.５ｇ）をジエチルエーテル（１４０ｍｌ）と共にすり砕いた。結晶性固体を採取し、ジエチルエーテルで洗浄し、乾燥させ、ラパマイシン（６.３ｇ、純度９１.７％、収率３５.４％）を得た。ジエチルエーテル濾液を濃縮し、ラパマイシン含量１３.１％の油状物６３.５ｇを得た。
【００２２】
実施例２
濃縮発酵ブロス抽出物（２０６.０ｇ、ラパマイシン含量１１.８％）の溶液を、ｔ-ブチルメチルエーテル（８００ｍｌ）中に溶解し、０〜５℃にて、０.５ＮＮａＯＨ溶液で各４００ｍｌずつ３回洗浄し、次いで、洗浄液が中性になるまで水で洗浄した。このｔ-ブチルメチルエーテル溶液を濃縮し、残渣（７５.０ｇ）をジエチルエーテル（１５０ｍｌ）と共にすり砕いた。結晶性固体を採取し、ジエチルエーテルで洗浄し、乾燥させ、ラパマイシン（１１.４ｇ、純度９２.２％、収率４３.３％）を得た。ジエチルエーテル濾液を濃縮し、ラパマイシン含量１１.３％の油状物５８.７ｇを得た。
【００２３】
実施例３
アセトニトリル（２３ｍｌ）中に溶解した濃縮発酵ブロス抽出物（１０.５８ｇ、ラパマイシン含量１０.４％）の溶液を、シクロヘキサンで各２３ｍｌずつ２回洗浄し、次いで、濃縮した。残渣をジクロロメタンに溶解し、０〜５℃にて、０.５Ｎ塩酸溶液で各２３ｍｌずつ２回、０〜５℃にて、０.５Ｎ ＮａＯＨ溶液で各２３ｍｌずつ３回、次いで、洗浄液が中性になるまで水で洗浄した。このジクロロメタン溶液を濃縮し、残渣（４.０７ｇ）をジエチルエーテルと共にすり砕いた。結晶性固体を採取し、ジエチルエーテルで洗浄し、乾燥させ、ラパマイシン（０.６４ｇ、純度８９.５％、収率５８.２％）を得た。ジエチルエーテル濾液を濃縮し、ラパマイシン含量９.８％の油状物３.３６ｇを得た。
【００２４】
実施例４
酢酸エチル（４００ｍｌ）中に溶解した濃縮発酵ブロス抽出物（１００.０ｇ、ラパマイシン含量１１.８％）の溶液を、０〜５℃にて、０.５Ｎ ＮａＯＨ溶液の２００ｍｌで１回、各１００ｍｌずつ２回洗浄し、次いで、０〜５℃にて、０.５Ｎ 塩酸溶液で各２００ｍｌずつ２回洗浄し、最後に、洗浄液が中性になるまで水で洗浄した。水性洗浄液を酢酸エチル（１００ｍｌ）で逆抽出し、得られた酢酸エチル溶液を合わせた。この酢酸エチル溶液を濃縮し、残渣（４３.２ｇ）をジイソプロピルエーテル（４５ｍｌ）と共にすり砕いた。結晶性固体を採取し、ジイソプロピルエーテルで洗浄し、乾燥させ、９.５ｇのラパマイシン（純度８５.３％、収率６８.７％）を得た。ジイソプロピルエーテル濾液を濃縮し、ラパマイシン含量６.６％の油状物（３１.６ｇ）を得た。
【００２５】
実施例５
トルエン（１２０ｍｌ）および酢酸エチル（２５ｍｌ）の混合物中に溶解した濃縮発酵ブロス抽出物（２５.２ｇ、ラパマイシン含量１０.４％）の溶液を、０〜５℃にて、０.５Ｎ ＮａＯＨ溶液で各５０ｍｌずつ３回、０〜５℃にて、０.５Ｎ塩酸で各５０ｍｌずつ２回、次いで、洗浄液が中性になるまで水で洗浄した。トルエン／酢酸エチル溶液（１２８ｍｌ）を２等分し、以下の方法によって、さらに処理した。
【００２６】
方法Ａ トルエン／酢酸エチル溶液（６４ｍｌ）を濃縮し、残渣（５.７ｇ）をジエチルエーテル（１１ｍｌ）と共にすり砕いた。結晶性固体を採取し、追加のジエチルエーテルで洗浄し、乾燥させ、０.８４ｇのラパマイシン（純度９２.７％、収率６４.１％）を得た。ジエチルエーテル濾液を濃縮し、ラパマイシン含量６.８％の油状物４.３ｇを得た。
【００２７】
方法Ｂ トルエン／酢酸エチル溶液（６４ｍｌ）を濃縮し、残渣（９.０ｇ）をアセトニトリル（５０ｍｌ）に溶解した。このアセトニトリル溶液をシクロヘキサンで各２５ｍｌずつ２回洗浄した。このアセトニトリル溶液を、次いで、濃縮し、残渣（４.３ｇ）をジエチルエーテル（１１ｍｌ）と共にすり砕いた。結晶性固体を採取し、ジエチルエーテルで洗浄し、乾燥させ、０.８１ｇのラパマイシン（純度９４.６％、収率６１.８％）を得た。ジエチルエーテル濾液を濃縮し、ラパマイシン含量５.９％の油状物３.０ｇを得た。
【００２８】
実施例６
母液濃縮物（９９６.０ｇ、ラパマイシン含量２１.６％）をｔ-ブチルメチルエーテル（４０００ｍｌ）と共にすり砕いた。結晶性固体を採取し、ｔ-ブチルメチルエーテル（５００ｍｌ）で洗浄し、乾燥させ、３６.２ｇのラパマイシン（純度９５.１％、収率１３.８％）を得た。濾液を、０〜５℃にて、０.５Ｎ水酸化ナトリウム溶液の２０００ｍｌで１回、各１０００ｍｌずつ２回洗浄した。合わせた塩基抽出物をｔ-ブチルメチルエーテル（５００ｍｌ）で１回洗浄した。このｔ-ブチルメチルエーテル濾液および抽出物を合わせ、洗浄液が中性になるまで水で洗浄した。水抽出物を合わせ、ｔ-ブチルメチルエーテル（５００ｍｌ）で抽出した。ｔ-ブチルメチルエーテル溶液を合わせ、濃縮し、残渣（３７７.１ｇ）をジイソプロピルエーテル（３５０ｍｌ）と共にすり砕いた。結晶性固体を採取し、ジイソプロピルエーテルで洗浄し、乾燥させ、１２６.７ｇのラパマイシン（純度８２.４％、収率５８.９％）を得た。かくして、母液濃縮物からのラパマイシンの全回収量は１６２.９ｇ（７２.７％）であった。ジイソプロピルエーテル濾液を濃縮し、ラパマイシン含量２０.９％の油状物１５７.９ｇを得た。
【００２９】
実施例７
ジクロロメタン（２０００ｍｌ）中に溶解した母液濃縮物（５６２.１ｇ、ラパマイシン含量２１.６％）の溶液を、０〜５℃にて、０.５Ｎ水酸化ナトリウム溶液で各５００ｍｌずつ３回洗浄し、合わせた塩基水溶液抽出物を２００ｍｌのジクロロメタンで１回抽出した。有機溶液を合わせて、０〜５℃にて、０.５Ｎ塩酸溶液で各５００ｍｌずつ２回洗浄した。合わせた酸水溶液抽出物を２００ｍｌのジクロロメタンで１回抽出した。合わせた有機抽出物を、洗浄液が中性になるまで水で洗浄した。有機溶液を濃縮し、残渣（２５５.０ｇ）をジイソプロピルエーテル（２５０ｍｌ）と共にすり砕いた。結晶性固体を採取し、ジイソプロピルエーテルで洗浄し、乾燥させ、ラパマイシン１０８.６ｇ（純度８６.６％、回収率７７.４％）を得た。ジイソプロピルエーテル濾液を濃縮し、ラパマイシン含量２３.１％の油状物１００.２ｇを得た。
【００３０】
実施例８
０〜５℃の０.５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（４００ｍｌ）を、８００ｍｌのｔ-ブチルメチルエーテル中に溶解した濃縮発酵ブロス抽出物（１９８.５ｇ、ラパマイシン含量８.３％）の激しく撹拌冷却した（０〜５℃）溶液に、温度が０〜５℃を維持し得るような割合で添加した。５分間激しく撹拌した後、下側の塩基水溶液層を取り出し、０〜５℃で保存した。有機層を、０〜５℃にて、０.５Ｎ水酸化ナトリウム溶液で各２００ｍｌずつ２回再抽出した。塩基水溶液抽出物を合わせ、ｔ-ブチルメチルエーテル（２００ｍｌ）で再抽出した。ｔ-ブチルメチルエーテル溶液を合わせ、洗浄液が中性（ｐＨ＝７）になるまで水で洗浄した。水性洗浄液を合わせ、ｔ-ブチルメチルエーテル（１００ｍｌ）で抽出した。ｔ-ブチルメチルエーテル溶液を合わせ、飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、真空下、４０℃で濃縮した。残渣を、２０〜２５℃にて、ジイソプロピルエーテル（８５ｍｌ）と共に、最低１時間すり砕き、この混合物を０〜５℃で一晩冷却した。焼結ガラス製ブフナー漏斗を用いて、結晶性固体を採取し、２０〜２５℃にて、ジイソプロピルエーテル−ｔ-ブチルメチルエーテルの４：１混合物で（５×２０ｍｌまたは濾液が無色になるまで）洗浄した。結晶性固体を一定重量になるまで乾燥させ、１２.０ｇのラパマイシン（純度９１.２％、回収率６６.４％）を得た。ｔ-ブチルメチルエーテル濾液を濃縮し、洗浄し、ラパマイシン含量３.６３％のガム質６３.９ｇを得た。
【００３１】
実施例９
母液濃縮物（２００ｇ、ラパマイシン含量２５％）を、室温でｔ-ブチルメチルエーテル（８００ｍｌ）に撹拌溶解した。撹拌溶液を０〜５℃に冷却し、直ちに、予め０〜５℃に冷却した２７０ｍｌの０.６５Ｎ水酸化ナトリウム溶液で、混合物の温度を０〜５℃に維持しながら、抽出した。（抽出物が最終的にｐＨ１２となるのに必要な水酸化ナトリウム水溶液の量は、濃縮母液のアリコートについて決定した。）
【００３２】
塩基水溶液層は０〜５℃で保存し、有機層は５％塩化ナトリウム溶液で、混合物を０〜５℃に維持しながら、洗浄した。塩基水溶液抽出物をｔ-ブチルメチルエーテル（１００ｍｌ）で逆抽出した。有機層を合わせ、５％塩化ナトリウム溶液で各２００ｍｌずつ３回洗浄した（最終洗浄溶液のｐＨは７.４）。有機溶液を、減圧（６０〜１３０ｍｍＨｇ）下、２５〜４０℃の温度で濃縮した。残渣にシクロヘキセン（８０ｍｌ）を、室温で３０分間かけて、撹拌しながら徐々に添加し、結晶化が完了するまで撹拌した（３時間）。この混合物を室温で１時間またはそれ以上撹拌し、０〜５℃に冷却し、一晩撹拌した。次いで、オフホワイト色の結晶性固体をガラス製ブフナー漏斗で採取した。得られた固形物をｔ-ブチルメチルエーテルおよびシクロヘキセンの２：３混合物で各４０ｍｌずつ５回洗浄した。この固形物を３５〜４０℃の真空オーブン中で一定重量になるまで乾燥させ、２２.７ｇのラパマイシン（純度９０.６％、回収率４１.１％）を得た。濾液および洗浄液（ｔ-ブチルメチルエーテルおよびシクロヘキセン）を濃縮し、ラパマイシン含量３７.５％の油状物６０.１ｇを得た。
【００３３】
【発明の効果】
本発明によれば、マクロライドを産生する菌株の発酵工程で得られる発酵ブロス抽出物や、その後の操作で得られた母液の濃縮物からマクロライドを回収する方法が提供される。かかる方法は、時間と費用の掛かるクロマトグラフィー技術を用いず、単純な抽出工程によってマクロライドを分離回収しているので、比較的迅速で効率的である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のマクロライド分離回収法の概略を示す図である。
Claims (12)
- ラパマイシン、３２−デスメチルラパマイシン、１５−デオキソラパマイシンまたはＦＫ−５０６である中性のマクロライドを、該中性マクロライドを含有する濃縮物中に存在する酸性、塩基性および非極性中性の不純物から分離する方法であって：
（ａ）中性のマクロライドを水不混和性溶媒中に溶解する工程（該中性マクロライドは、さらに１種またはそれ以上の酸性、塩基性および無極性中性の不純物を含有する発酵ブロス抽出物または母液の濃縮物中に存在する）；
および、いずれかの順序で、以下の抽出工程（ｂ）：
（ｂ）水不混和性の溶媒中における該濃縮物の溶液を、約−５℃から約４５℃の温度で、塩基の水溶液で抽出して、実質的にすべての酸性不純物を除去する工程；
と、任意の一方または両方の工程（ｃ）および工程（ｄ）：
（ｃ）水不混和性の溶媒中における該濃縮物の溶液を、約−５℃から約４５℃の温度で、酸の水溶液で抽出して、実質的にすべての塩基性不純物を除去する工程；
（ｄ）該濃縮物の溶液を無極性中性の不純物を除去するために１またはそれ以上の次の工程：
（ｉ）該マクロライドが不溶性であるところの、芳香族でない炭化水素溶媒で抽出する工程；
（ｉｉ）充分な量の、水、ヘキサンおよび石油エーテルからなる群から選択される混和性マクロライド非溶媒で処理し、得られた溶媒混合物にて該マクロライドが不溶性となるようにし、その溶液から分離し、それによりマクロライドをその溶媒混合物から分離することができる工程；
（ｉｉｉ）ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテルおよびｔ−ブチルメチルエーテルからなる群から選択されるマクロライド結晶化溶媒ですり砕く工程、
に付す工程、
を含み、これによりマクロライドを、濃縮物中の酸性、塩基性および／または無極性中性の不純物から単離することを特徴とする分離方法。 - 工程（ｄ）において、マクロライドの溶液が水不混和性溶媒の溶液である、請求項１記載の方法。
- 酸性および／または塩基性不純物の抽出が約−５℃ないし約１０℃の温度でなされる請求項１または２記載の方法。
- マクロライドを含有する発酵ブロス抽出物または母液の濃縮物中の無極性中性成分を除去するにあたり、第１の溶媒中における該濃縮物の溶液を、第１の溶媒と混和せずマクロライドを溶解しない第２の芳香族でない炭化水素溶媒で抽出する請求項１記載の方法。
- 酸性および／または塩基性成分を抽出した後、マクロライドを含有する水不混和性溶液を充分な量の混和性マクロライド非溶媒で処理し、得られた溶媒混合物にマクロライドが溶解しないようにし、溶液から分離する請求項１記載の方法。
- 酸性および／または塩基性成分を抽出した後、マクロライドを含有する水不混和性溶液を濃縮し、残渣を結晶化溶媒または溶媒混合物と混合することによって結晶化させる請求項１記載の方法。
- 発酵ブロス抽出物または母液の濃縮物を、まず第１の溶媒に溶解し、該第１の溶媒と混和しない第２の芳香族でない炭化水素溶媒で抽出して無極性中性不純物を除去し、次いで、第１の溶媒中における溶液を濃縮し、残渣を水混和性溶媒に溶解し、塩基および／または酸の水溶液で抽出し、酸性および／または塩基性不純物を除去する請求項１記載の方法。
- 芳香族でない炭化水素溶媒がシクロヘキサン、シクロヘキセン、ヘキサン、ヘプタンまたはペンタンまたはその混合物である、請求項１ないし７のいずれか一項記載の方法。
- 水不混和性溶媒がジクロロメタン、ｔ−ブチルメチルエーテル、酢酸エチル、トルエン、１−ブタノール、酢酸エチル／トルエン混合物、ヘプタン／酢酸エチル混合物またはヘキサン／塩化メチレン混合物である、請求項１ないし８のいずれか一項記載の方法。
- 水性塩基が水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウムまたは水酸化アンモニウムである、請求項１ないし９のいずれか一項記載の方法。
- 水性酸が塩酸、リン酸一カリウムまたは硫酸一ナトリウムである、請求項１ないし１０のいずれか一項記載の方法。
- マクロライドがラパマイシン、３２−デスメチルラパマイシンまたは１５−デオキソラパマイシンである、請求項１ないし１１のいずれか一項記載の方法。
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