PT652219E - Novo processo extractivo para a recuperacao de macrolidos de origem natural - Google Patents

Description

kbZ ZL°) _ i _ C— DESCRIÇÃO "NOVO PROCESSO EXRACTIVO PARA A RECUPERAÇÃO DE MACRÓLIDOS DE ORIGEM NATURAL”

Esta invenção refere-se a um processo extractivo para a recuperação de macrólidos de origem natural, mais particularmente a um processo para separar um macrólido neutro que é a rapamicina ou um homólogo ou análogo da mesma como 32-desmetil-rapamicina e 15-desoxo-rapamicina, a partir de outros componentes de origem natural que sejam obtidos por processos de fermentação. Mais especificamente, esta invenção refere-se a um processo para recuperar a rapamicina de macrólido tricíclico a partir de concentrado de extracto de caldo de fermentação e a partir de concentrado de líquido-mãe.

Os macrólidos tricíclicos exemplificados por rapamicina têm actividade imuno-supressora bem como outras actividades antibióticas e farmacológicas e são úteis no tratamento de rejeições de enxertos e de transplantes, doenças de inflamação e doenças auto-imunes como lúpus, artrite reumatóide, diabetes mellitus e esclerose múltipla.

Os macrólidos tricíclicos rapamicina, 32-desmetil-rapamicina e 15-desoxo-rapamicina são produzidos por fermentação de várias estirpes de Streptomyces sob condições apropriadas e são neutros pois não têm presentes nem um grupo amino básico nem grupos de ácido fenólico ou carboxílico. A rapamicina é produzida pela cultura de S. hygroscopicus NRRL 5491 num meio aquoso. Os micélios contendo o macrólido tricíclico são recuperados a partir do meio de desenvolvimento e extraídos com um solvente orgânico como metanol -2-para obter uma mistura contendo o desejado macrólido tricíclico, compostos relacionados compostos aeídices como ácidos gordos, compostos básicus ixuuu alcaloides e péptidos, e compostos lipofílicos neutros como gorduras. Tipicamente, o extracto de caldo de fermentação é concentrado para facilitar o transporte e/ou armazenamento até o macrólido poder ser isolado. O isolamento e a purificação dos macrólidos tricíclicos a partir do extracto de caldo de fermentação foi, antes desta invenção, um dispendioso processo laborioso utilizando várias técnicas químicas e cromatográficas para obter material purificado. [U.S. 5.091.389; U.S. 3.993.749; WO 93/11130; Sehgal, “J. of Antibiotics” 28(10)727(1975)]. O concentrado de extracto de caldo de fermentação para a rapamicina contém apenas 5 a 15% de rapamicina e até cerca de 50% de componentes acídicos, por exemplo, e a rapamicina deve ser separada dos outros componentes. Tipicamente, os processos para recuperar os macrólidos tricíclicos a partir de extractos de caldo de fermentação envolvem a adsorção e a dessorção a partir de carvão activado, processos de solubilidade selectiva, e um ou mais processos cromatográficos que são morosos e dispendiosos usando cromatografia de coluna e/ou cromatografía líquida de alta pressão. No presente contexto, evitaram-se as condições acídicas ou básicas porque os macrólidos tricíclicos como a rapamicina são considerados instáveis sob condições acídicas ou básicas. A rapamicina, em solução miscível em água, i.e., em metanol ou tetra-hidrofurano, degrada-se por meio de bases inorgânicas como hidróxido de sódio aquoso, bases orgânicas como 4-dimetilaminopiridina (DMAP) ou 1,8-diazobiciclo[5.4.0]undec-7-eno (DBU) ou ácidos minerais aquosos como ácido clorídrico e ácidos de Lewis como cloreto de zinco [Steffan et al., “Tetrahedron Letters” 34(23, 3699-3702 (1993). D. Yohanes e SJ. Danishefsky, Tetrahedron Letters 33(49), 7469-7472 (1992); Luengo et al., Tetrahedron Letters 34(6). 991-994 (1993) e D. Yohannes et al., Tetrahedron Letters 34(13), 2075-2078 (1993)].

Esta invenção proporciona um processo relativamente rápido e eficiente para a recuperação da rapamicina ou de um homólogo ou análogo da -3- mesma de origem natural, a partir de concentrados de extracto de caldo de fermentação e líquidos-mãe ou concentrados dos mesmos obtido» a partir ue solventes de recristalização, triturações e lavagens de produto e evita as morosas e dispendiosas separações cromatográficas exemplificadas em U.S. 5.091.389; U.S. 3.993.749; WO 93/11130; Sehgal, “J. of Antibiotics” 28(10)727(1975).

Em conformidade, esta invenção proporciona um processo para separar um macrólido neutro que é rapamicina ou um homólogo ou análogo da mesma de origem natural a partir de impurezas neutras acídicas, básicas e não polares presentes num concentrado de extractos de caldo de fermentação ou líquidos-mãe contendo o referido macrólido neutro que compreende em qualquer ordem, o passo de extraeção (a) e, opcionalmente, um ou ambos os passos (b) e (c), como segue: (a) uma solução do referido concentrado num solvente imiscível em água é extraída a uma temperatura entre cerca de -5°C e cerca de 45°C com uma base aquosa para, substancialmente, remover todas as impurezas acídicas; (b) uma solução do referido concentrado num solvente imiscível em água é extraída a uma temperatura entre cerca de -5°C e cerca de 45°C com ácido aquoso para, substancialmente, remover todas as impurezas básicas; (c) uma solução do referido concentrado é submetida a um ou mais dos seguintes passos para remover impurezas neutras não polares: (i) extraeção com um hidrocarboneto não aromático no qual o macrólido é insolúvel, (ii) tratamento com uma quantidade suficiente de um macrólido miscível não solvente para fazer com que o macrólido se tome insolúvel na -4- h*.Yfr resultante mistura de solvente e, assim, separá-lo da solução pela qual o macrólido pode ser separado a partir da mistura de sol·. (iii) triturar com um solvente de cristalização de macrólidos.

Num aspecto, o processo compreende a separação dos componentes acídicos e opcionalmente básicos a partir dos componentes neutros, pela dissolução do concentrado contendo macrólido num solvente imiscível em água adequado e extraindo os componentes acídicos e opcionalmente básicos numa base aquosa e, se se desejar, ácida, respectivamente, e utilizando técnicas selectivas de solubilidade ou de extracção para separar o macrólido a partir de materiais neutros não polares presentes no concentrado. Enquanto o processo aqui descrito é particularmente adequado para concentrados de extractos de caldo de fermentação ou líquidos-mãe, a solução de extracto completo ou as soluções de líquido-mãe podem ser usadas no processo desta invenção desde que o solvente ou mistura de solventes usados para a extracção do caldo de fermentação ou recristalização, trituração ou lavagens sejam convenientes ao processo e o volume do solvente não seja incómodo. O volume do solvente pode ser reduzido por concentração parcial. Qualquer das soluções a que se pode aplicar o processo desta invenção pode ser referida como uma solução ou concentrado contendo macrólido. O produto obtido pelo referido processo pode ser purificado até pureza aceitável por procedimentos “Standard” conhecidos dos especialistas na técnica.

Tal como aqui é usado, um solvente não polar é um solvente de hidrocarboneto não aromático como ciclo-hexano, ciclo-hexeno, hexano, heptano, pentano. Solventes que são imiscíveis com o solvente de hidrocarboneto não aromático incluem, mas não se limitam a acetonitrilo e dimetilformamida. O termo extracção refere-se ao processo de misturar -5- completamente uma solução com outra solução imiscível, permitindo que as soluções imiscíveis se senarem uma Ha nutra p. mmnypr fisicamente uma camada ou fase da outra, e, se necessário, repetir. O termo lavar, quando se referir a uma solução, refere-se ao processo de extracção e quando se referir a um sólido, significa enxaguar o sólido com um solvente em que o sólido seja substancialmente insolúvel. O termo líquido-mãe refere-se às soluções de solvente orgânico obtidos a partir de filtrados de cristalização, lavagens e extracções repetidas de extractos aquosos e lavagens e triturações de sólidos recolhidos. Um solvente de macrólido é um solvente ou mistura de solventes que dissolverá o macrólido e impurezas que o acompanham como os componentes acídicos ou básicos. Um não solvente de macrólido é um solvente ou mistura de solventes em que o macrólido é substancialmente insolúvel mas em que os componentes neutros como gorduras são solúveis. Um solvente de cristalização de macrólido é um solvente ou mistura de solventes a partir dos quais o macrólido pode ser recristalizado ou cristalizado a partir de um estado amorfo depois de triturado. Quando o processo exige a concentração de uma solução, é preferido que o solvente ou mistura de solventes tenha volatilidade suficiente de maneira a destilar, sob condições de temperatura e pressão que não se degradem.

Esta invenção também proporciona um passo opcional onde os componentes neutros não polares do concentrado de extracto de caldo de fermentação contendo macrólido ou concentrado de líquido-mãe são removidos por extracção de uma solução do referido concentrado num primeiro solvente (por exemplo, acetonitrilo, DMF) com um segundo solvente de hidrocarboneto não aromático imiscível com o primeiro solvente e no qual o macrólido é insolúvel (por exemplo, ciclo-hexano, ciclo-hexeno, hexano, heptano ou pentano).

Proporciona-se também o passo opcional onde a solução imiscível em água contendo o macrólido após extracção dos componentes ácidos e opcionalmente básicos é

(í) vjUci li aiauvj Cuiu uillct i{UilUÍlUÍl(lc SUIlcicniC Q6 UH1 IlâO solvente de macrólido miscível que faça com que o macrólido se tome insolúvel na mistura de solvente resultante e se separe, assim, da solução pelo qual o macrólido pode ser separado a partir da mistura de solvente, (ii) quer concentrado e o resíduo cistalizado pela sua mistura com um solvente de cristalização ou mistura de solventes. A solução imiscível em água contendo o macrólido após extracção de componentes ácidos e, se se desejar, básicos, pode também ser concentrada e o resíduo dissolvido num primeiro solvente e extraído com um segundo solvente de hidrocarboneto não aromático imiscível com o primeiro solvente e no qual o macrólido é insolúvel para remover as impurezas neutras não polares.

Um processo preferido desta invenção é delineado no Esquema 1 que se segue:

Esquema 1 componentes acídicos concentrado de macrólido tríciclico em bruto dissolvido em solvente imiscível em água

macrólido tríciclico neutros não polares -7-

U <UA

Dc «cordo CGiii G pi\jucsãu, u uDiiucxiiraclu contendo o macroiido, quer a partir de concentrado de extracto de caldo de fermentação ou de concentrados a partir de recristalização e/ou solventes de lavagem, é dissolvido num solvente imiscível em água ou mistura de solventes seleccionados para ser possível dissolver o concentrado e facilitar a remoção, incluindo, mas não se limitando a diclorometano, éter t-butil-metílico, acetato de etilo, tolueno, 1-butanol, uma mistura de acetato de etilo/tolueno, uma mistura de heptano/acetato de etilo, ou uma mistura de hexano/cloreto de metileno. Soluções aquosas de base, incluindo hidróxido de sódio, bicarbonato de sódio, carbonato de sódio, hidróxido de amónio, preferivelmente hidróxido de sódio, em concentrações na gama dos 0,1 a 5 N, preferivelmente entre cerca de 0,1 e 1,0 N, mais preferivelmente 0,1 a 0,5 N, são úteis para extrair os componentes acídicos. Bases orgânicas como trietilamina não são tão eficazes como as bases inorgânicas aquosas mais fortes na remoção dos componentes acídicos. Soluções aquosas de ácido mineral, incluindo ácido clorídrico, fosfato de mono-potássio, sulfato monossódico, preferivelmente ácido clorídrico, em concentrações de 0,1 a 5 N, são úteis para extrair os componentes básicos. Ácidos orgânicos, como o ácido trifluoroacético, não são tão eficazes como os ácidos minerais na remoção dos componentes básicos. As extracções de componentes acídicos e, se se desejar, básicos, a partir da solução contendo o macrólido são convenientemente efectuadas entre -5°C e 45°C, preferivelmente -5°C e 30°C, mais preferivelmente na gama dos -5 a 10°C. Para evitar a possível degradação do macrólido pelo ácido ou pela base, o processo de extracção deveria completar-se sem demora. Dependendo das quantidades dos componentes básicos presentes, a extracção de bases pode não ser necessária e a extracção dos componentes acídicos pode, por si só, ser suficiente para remover da solução contendo o macrólido impurezas em quantidade suficiente para permitir o isolamento do macrólido tricíclico. -8- Μ É vantajoso remover os componentes acídicos (ou, se se desejar, básicos) da solução dc concentrado coincuuo uracróiido num único passo de extração. A quantidade de base aquosa (ou ácido) necessária para disponibilizar a base (ou ácido) em excesso no processo de extraeção pode ser determinada extraindo uma parte alíquota da solução do concentrado contendo macrólido com uma base aquosa (ou ácida) e determinar o volume da base aquosa (ou ácida) necessária para produzir um extracto da parte alíquota tendo um pH tal que disponibilize um excesso estequiométrico de base (ou de ácido). O excesso de ácido ou de base é determinado pelo uso de um medidor de pH ou por outro meio de determinar o pH. O volume de base aquosa (ou ácida) necessária para extrair a solução a partir do qual era retirada a parte alíquota é, então, proporcional à razão dos volumes de solução contendo o macrólido neutro a ser extraída e de onde se retirou a parte alíquota. Assim, a extraeção de componentes acídicos (ou básicos) pode ser efectuada numa operação em vez de se efectuarem extraeções múltiplas com quantidades menos que suficientes de base aquosa (ou ácida). Obviamente, onde quer os componentes acídicos quer os básicos tiverem de ser removidos da solução do concentrado contendo macrólido, terão de se efectuar extraeções separadas com base aquosa e ácido aquoso, respectivamente. Com soluções de concentrado contendo rapamicina, por exemplo, uma extraeção com uma solução de hidróxido de sódio aquoso, suficiente para ter um pH final de 12, é suficiente para remover substancialmente todos os componentes acídicos. O macrólido recuperado a partir de solução utilizando os processos atrás referidos, pode ser purificado até ao grau de pureza desejado por técnicas de purificação convencionais conhecidas dos especialistas na técnica. Os filtrados e águas de lavagem podem voltar a ser trabalhados para recuperar macrólido adicional, se se desejar.

Depois de efectuar os processos de extraeção para remover os -9-componentes acídicos e, se se desejar, básicos, a partir da solução de solvente imiscível cm água contendo υ maurúiido, esie pode ser separado dos componentes neutros não polares por um dos métodos que se seguem: (1) Um macrólido não solvente (ou mistura de solvente), miscível com a referida solução de solvente imiscível em água contendo macrólido, a partir do qual foram extraídos os componentes acídicos e, se se desejar, básicos, é adicionado à solução contendo macrólido em quantidade suficiente de modo a fazer com que o macrólido, e talvez os produtos relacionados com o macrólido insolúveis na solução resultante, forme uma fase separada, quer um óleo ou um sólido, que pode então ser separado por técnicas de separação comuns conhecidas dos especialistas na técnica. (2) A solução de solvente imiscível em água contendo o macrólido neutro a partir do qual os componentes acídicos e/ou polares foram extraídos é concentrada e o material residual contendo o macrólido é dissolvido num solvente que dissolva o macrólido, como acetonitrilo ou dimetilformamida e extraído com um solvente de hidrocarboneto não aromático como ciclo-hexano, hexano, heptano ou ciclo-hexeno. A camada de solvente capaz de dissolver o macrólido é separada e concentrada. O resíduo contendo o macrólido é então triturado com um solvente de cristalização para obter o macrólido se o referido macrólido for um sólido ou for purificado por técnicas conhecidas dos especialistas na técnica, como a cromatografia, se o macrólido for um óleo. Altemativamene, o solvente capaz de dissolver o macrólido, após extracção com o solvente de hidrocarboneto não aromático pode ser tratado com um solvente miscível que não dissolva o macrólido como no processo (1) atrás referido. (3) A solução de solvente imiscível em água contendo macrólido, a partir do qual foram extraídos os componentes acídicos e, se se desejar, básicos, é concentrada e o material residual é triturado com um solvente de cristalização dc macrólido Cumu cícr dieiíiico, éter di-isopropilico ou éter t-butil-metílico.

Altemativamente, o concentrado contendo macrólido pode ser extraído primeiro de acordo com um dos métodos (1) a (3) atrás referidos para remover os componentes não polares e, então, o resíduo contendo o macrólido dissolvido num solvente imiscível em água, se já não estiver nesse solvente, e extraído com uma base aquosa ou base e ácido, em qualquer ordem, para remover os componentes acídicos ou acídicos e básicos. O processo atrás referido tira vantagem da inesperada descoberta de que os macrólidos como o macrólido tricíclico rapamicina não se decompõem quando são submetidos a processos de extracção de ácido ou base aquosos sob condições de temperatura apropriada a partir de soluções de solvente imiscível em água de concentrados contendo macrólido. Anteriormente, pensava-se que a degradação ocorreria, baseada na observada degradação da rapamicina que resulta da exposição ao ácido ou base em solução.

Este processo de extracção diminui grandemente o tempo necessário para recuperar macrólidos a partir dos referidos concentrados e evita os morosos e dispendiosos processos cromatográficos. O macrólido tricíclico rapamicina é um sólido cristalino solúvel em metanol, acetona, dimetilformamida, ligeiramente solúvel em éter dietílico e pouco solúvel em hexano ou éter de petróleo e é insolúvel em água. A rapamicina tem a estrutura abaixo indicada. O sistema de numeração atómica é o que é usado pelos “Chemical Abstracts”. - 11 - --- \

OH 44

As estruturas de 32-desmetil-rapamicina e 15-desoxo-rapamicina pode facilmente ser discernidos a partir da estrutura de rapamicina atrás referida.

Os exemplos que se seguem são meramente ilustrativos do processo da presente invenção para isolar a rapamicina a partir de concentrados de caldo de fermentação e de líquido-mãe e não devem, de maneira alguma, ser considerados como limitando o âmbito desta invenção. Nos exemplos que se seguem, a identidade do produto isolado foi confirmada como rapamicina através da comparação de propriedades físicas, espectrais e cromatográficas com as da rapamicina autêntica. A pureza do produto (não recristalizado) foi determinada por análise cromatográfica líquida de alta pressão.

Exemplo 1

Uma solução de extracto de caldo de fermentação concentrado (157,0 g, 10,4% de teor em rapamicina) em cloreto de metileno (600 mL) foi -12-lavada com três porções de 150 mL de solução de NaOH 0,5 N a 0-5°C, lavada cum água aic a lavagem ílear ncuira e, cniãu, lavada com solução salina. À solução de cloreto de metileno foi concentrada e o resíduo (70,5 g) triturado com éter dietílico (140 mL). O sólido cristalino foi recolhido, lavado com éter dietílico e seco para obter rapamicina (6,3 g, 91,7% de pureza, 35,4% de rendimento). A concentração dos filtrados de éter dietílico produziu 63,5 g de óleo tendo um teor em rapamicina de 13,1%.

Exemplo 2

Uma solução de extracto de caldo de fermentação concentrado (206,0 g, 11,8% de teor em rapamicina) foi recolhida em éter t-butil-metílico (800 mL) e lavada com três porções de 400 mL de solução de NaOH 0,5 NaO-5°C e foi então lavada com água até a lavagem ficar neutra. A solução de éter t-butil-metílico foi concentrada e o resíduo (75,0 g) triturado com éter dietílico (150 mL). O sólido cristalino foi recolhido, lavado com éter dietílico e seco para obter rapamicina (11,4 g, 92,2% de pureza, 43,3% de rendimento). A concentração dos filtrados de éter dietílico produziu 58,7 g de óleo tendo um teor em rapamicina de 11,3%.

Exemplo 3

Uma solução de extracto de caldo de fermentação concentrado (10,58 g, 10,4% de teor em rapamicina) em acetonitrilo (23 mL) foi lavada com duas porções de 23 mL de ciclo-hexano e foi então concentrada. O resíduo foi dissolvido em diclorometano e lavado sequencialmente com três porções de 23 mL de solução de NaOH 0,5 N a 0-5°C, duas porções de 23 mL de 0,5 N de HCL a 0-5°C e, então, com água até a lavagem ficar neutra. A solução de ciclorometano foi concentrada e o resíduo (4,07 g) foi triturado com éter dietílico.

-13- O sólido cristalino foi recolhido, lavado com éter dietílico e seco para produzir rapamir.in« (0,64 g, 89,5% ds pureza, 5S,2% Jc icnuimenio). Os filtrados de éter dietílico foram concentrados para obter 3,36 g de óleo tendo um teor em rapamicina de 9,8%.

Exemplo 4

Uma solução de extracto de caldo de fermentação concentrado (100,0 g, 11,8% de teor em rapamicina) em acetato de etilo (400 mL) foi lavada com uma porção de 200 mL e duas porções de 100 mL de solução de NaOH 0,5 N a 0-5°C e, então, lavada com duas porções de 200 mL de solução de ácido clorídrico 0,5 N a 0-5°C e, finalmente, lavada com água até a lavagem ficar neutra. As águas de lavagem foram novamente extraídas com acetato de etilo (100 mL) e as soluções de acetato de etilo foram combinadas. A solução de acetato de etilo foi concentrada e o resíduo (43,2 g) foi triturado com éter di-isopropílico (45 mL). O sólido cristalino foi recolhido, lavado com éter di-isopropílico e seco para produzir 9,5 g de rapamicina (85,3% de pureza, 68,7% de rendimento). Os filtrados de éter di-isopropílico foram concentrados para produzir um óleo (31,6 g) com um teor em rapamicina de 6,6%.

Exemplo 5

Uma solução de extracto de caldo de fermentação concentrado (25,2 g, 10,4% de teor em rapamicina) numa mistura de tolueno (120 mL) e acetato de etilo (25 mL) foi lavada sequencialmente com três porções de 50 mL de solução de NaOH 0,5N a 0-5°C, por duas vezes, com duas porções de 50 mL de ácido clorídrico 0,5 N a 0-5°C e, então, com água até a lavagem ficar neutra. A solução de tolueno/acetato de etilo (128 mL) foi dividida em duas porções iguais para tratamento posterior pelos métodos que se seguem: - 14-

Mcicdc Λ. A solução uc iulucno/aceiato de etiio (64 mL) foi concentrada e o resíduo (5,7 g) triturado com éter dietílico (11 mL). O sólido cristalino foi recolhido, lavado com éter dietílico adicional e seco para produzir 0,84 g de rapamicina (92,7% de pureza, 64,1% de rendimento). A concentração dos filtrados de éter dietílico produziu 4,3 g de um óleo tendo um teor em rapamicina de 6,8%. Método B. A solução de tolueno/acetato de etilo foi concentrada e o resíduo foi dissolvido em acetonitrilo (50 mL). A solução de acetonitrilo foi lavada com duas porções de 25 mL de ciclo-hexano. A solução de acetonitrilo foi então concentrada e o resíduo (4,3 g) foi triturado com éter dietílico (11 mL). O sólido cristalino foi recolhido, lavado com éter dietílico, e seco para produzir 0,81 g de rapamicina (94,6% de pureza, 61,8% de rendimento). Concentrações dos filtrados de éter dietílico produziram 3,0 g de um óleo tendo um teor em rapamicina de 5,9%.

Exemplo 6

Triturou-se concentrado de líquido-mãe (996,0 g, 21,6% de teor em rapamicina) com éter t-butil-metílico (4000 mL). Os sólidos cristalinos foram recolhidos, lavados com éter t-butil-metílico (500 mL), e secos para produzir 36,2 g de rapamicina (95,1% de pureza, 13,8% de rendimento). Os filtrados foram lavados com uma porção de 2000 mL e duas porções de 1000 mL de solução de hidróxido de sódio 0,5 N a 0-5°C. O extracto de base combinado foi lavado uma vez com éter t-butil-metílico (500 mL). O filtrado de éter t-butil-metílico e o extracto foram combinados e lavados com água áté esta ficar neutra. Os extractos aquosos foram combinados e extraídos com éter t-butil-metílico (500 mL). As soluções de éter t-butil-metílico foram combinadas, concentradas e o - 15-

Af- b^rb C—‘-i resíduo (377,1 g) triturado com éter di-isopropílico (350 mL). Os sólidos cristalinos foram recolhidos, lavados com ciei di-isuprupíiico, e secos para produzirem 126,7 g de rapamicina (82,4% de pureza, 58,9% de rendimento). Assim, a recuperação total de rapamicina a partir do concentrado de líquido-mãe era de 162,9 g (72,7%). A concentração dos filtrados de éter di-isopropílico produziu 157,9 g de óleo tendo um teor em rapamicina de 20,9%.

Exemplo 7

Uma solução de concentrado de líquido-mãe (562,1 g, 21,6% de teor em rapamicina) em diclorometano (2000 mL) foi lavada com três porções de 500 ml de solução de hidróxido de sódio 0,5 N a 0-5°C e os extractos aquosos básicos combinados foram extraídos com uma porção de 200 mL de diclorometano. As soluções orgânicas foram combinadas e lavadas com duas porções de 500 mL de solução de ácido clorídrico 0,5 N a 0-5°C. Os extractos aquosos ácidos combinados foram extraídos com uma porção de 200 mL de dilorometano. Os extractos orgânicos combinados foram lavados com água até a lavagem ficar neutra. A solução orgânica foi concentrada e o resíduo (255,0 g) foi triturado com éter di-isopropílico (250 mL). Os sólidos cristalinos foram recolhidos, lavados com éter di-isopropílico e secos para produzirem 108,6 g de rapamicina (86,6% de pureza, 77,4% de recuperação). A concentração dos filtrados de éter di-isopropílico produziu 100,2 g de óleo tendo um teor em rapamicina de 23,1%.

Exemplo 8

Adicionou-se hidróxido de sódio aquoso 0,5 N (400 mL) a 0-5°C a uma solução gelada (0-5°C) vigorosamente agitada de extracto de caldo de fermentação concentrado (198,5 g, 8,3% de teor em rapamicina) em 800 mL de - 16-éter t-butil-metílico a uma velocidade que permitisse manter a temperatura a 0-5°C. Após vigorosa agitação durante 5 minutos, a camada básica aquosa inferior foi removida e armazenada a 0-5°C. A camada orgânica foi novamente extraída com duas porções de 200 mL de solução de hidróxido de sódio 0,5 N a 0-5°C. Os extractos básicos aquosos foram combinados e novamente extraídos com éter t-butil-metílico (200 mL). As soluções de éter t-butil-metílico foram combinadas e lavadas com água até a lavagem ficar neutra (pH=7). As águas de lavagem foram combinadas e extraídas com éter t-butil-metílico (100 mL). As soluções de éter t-butil-metílico foram combinadas, lavadas com solução de cloreto de sódio aquoso saturado e concentradas sob vácuo a 40°C. O resíduo foi triturado com éter di-isopropílico (85 mL) a 20-25°C durante um mínimo de uma hora e a mistura foi arrefecida até 0-5°C durante a noite. O sólido cristalino foi recolhido usando um funil de Buchner em vidro sinterizado e lavado com uma mistura de éter di-isopropílico - éter t-butil-metílico a 4:1, a 20-25°C, (5 x 20 mL ou até o filtrado ficar sem cor). O sólido cristalino é seco até atingir um peso constante para produzir 12,0 g de rapamicina (91,2% de pureza, 66,4% de recuperação). A concentração dos filtrados de éter t-butil-metílico e da água de lavagem produziu 63,9 g de uma borracha tendo um teor em rapamicina de 3,63%.

Exemplo 9

Dissolveu-se concentrado de líquido-mãe (200 g, 25% de teor em rapamicina), com agitação, em éter t-butil-metílico (800 mL) a temperatura ambiente. A solução agitada foi arrefecida até 0-5°C e extraída sem demora com 270 mL de solução de hidróxido de sódio 0,65 N, pré-arrefecida até 0-5°C, enquanto se mantinha a temperatura da mistura a 0-5°C. (A quantidade de hidróxido de sódio aquoso necessário para ter um pH final de 12 no extracto foi determinado numa parte alíquota do líquido-mãe concentrado). - 17- A camada aquosa de base foi armazenada a 0-5°C enquanto a pottio/ío ArrTomno Í/m Imrn/ín λAtv» (ι/>1ιιλ?»λ /1 λ λ1 λ»·λ+λ Jλ λ<λ μ ^0/ .... — —

.«ι»Μ«ν. νχ^ν*Λΐινν. 1.V* MWW wwiii íjwxwyuv wv viviviv UV JUU1V U «; /U) Wll^uauiu OW mantinha a mistura a 0-5°C. O extracto básico aquoso foi novamente extraído com éter t-butil-metílico (100 mL). As camadas orgânicas foram combinadas e lavadas com três porções de 200 mL de solução de cloreto de sódio a 5% (o pH da solução final de lavagem era de 7,4). A solução orgânica foi concentrada sob pressão reduzida (60-130 mmHg) a uma temperatura de 25-40°C. Ao longo de 30 minutos adicionou-se ciclo-hexeno (80 mL) ao resíduo, lentamente, com agitação a temperatura ambiente e agitou-se até a cristalização estar completa (3 horas). A mistura foi agitada a temperatura ambiente durante mais uma hora e a mistura foi gelada até 0-5°C e agitada durante a noite. O sólido cristalino esbranquiçado foi então recolhido num funil de Buchner em frita de vidro. O sólido foi lavado cinco vezes com porções de 40 mL de uma mistura de éter t-butil-metílico a 2:3 e ciclo-hexeno. O sólido foi seco até peso constante num forno de vácuo a 35-40°C para se obterem 22,7 g de rapamicina (90,6% pura, 41,4% recuperação). A concentração dos filtrados e águas de lavagem (éter t-butil-metílico e ciclo-hexeno) produziu 60,1 g de um óleo tendo um teor em rapamicina de 37,5%.

Lisboa, 29 de Junho de 2001

L

ALBERTO CANELAS Agente Oficia! da Propriedade industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA

Claims (12)

1. - 1 - REIVINDICAÇÕES 1. Um processo para separar um macrólido neutro que é rapamicina ou um homólogo ou análogo da mesma de origem natural, a partir de impurezas neutras acídicas, básicas e não polares presentes num concentrado de extractos de caldo de fermentação ou líquidos-mãe contendo o referido macrólido neutro, que compreende, em qualquer ordem, o passo de extracção (a) e, opcionalmente, um ou ambos os passos (b) e (c) como segue: (a) uma solução do referido concentrado num solvente imiscível em água é extraída a uma temperatura entre cerca de -5°C e cerca de 45°C com uma base aquosa para remover substancialmente todas as impurezas acídicas; (b) uma solução do referido concentrado num solvente imiscível em água é extraída a uma temperatura entre cerca de -5°C e cerca de 45°C com ácido aquoso para substancialmente remover todas as impurezas básicas; (c) uma solução do referido concentrado é submetida a um ou mais dos passos que se seguem para remover impurezas neutras não polares: (i) extracção, com um solvente de hidrocarboneto não aromático em que o macrólido é insolúvel, (ii) tratamento com uma quantidade suficiente de um macrólido miscível não-solvente para fazer com que o macrólido se tome insolúvel na resultante mistura de solvente e separá-lo, assim, da solução pela qual o macrólido pode ser separado da mistura de solvente, -2- CL——»-l (iii) triturar com um solvente de cristalização de macrólido.
2. 2. Um processo, de acordo com a Reivindicação 1, em que no passo (c) a solução do referido macrólido é uma solução num solvente imiscível em água.
3. 3. Um processo, de acordo com a Reivindicação 1 ou Reivindicação 2, em que a extracção de impurezas acídicas e/ou básicas é efectuada a uma temperatura entre cerca de -5°C e cerca de 10°C.
4. 4. Um processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, onde os componentes neutros não polares do concentrado de extracto de caldo de fermentação contendo macrólido neutro ou concentrado de líquido-mãe são removidos por extracção de uma solução do referido concentrado num primeiro solvente com um segundo solvente de hidrocarboneto não aromático imiscível com o primeiro solvente e em que o macrólido neutro é insolúvel.
5. 5. Um processo de acordo com a Reivindicação 1 ou Reivindicação 2, onde a solução imiscível em água contendo o macrólido neutro após extracção dos componentes ácidos e, se se desejar, básicos, é tratada com uma quantidade suficiente de um macrólido miscível não solvente para fazer com que o macrólido se tome insolúvel na resultante mistura de solvente e se separe, assim, da solução pela qual o macrólido neutro pode ser separado a partir da mistura de solvente.
6. 6. Um processo de acordo com a Reivindicação 1 ou Reivindicação 2, onde a solução imiscível em água contendo o macrólido neutro C_Λ -3- após extracção dos componentes acídicos e, se se desejar, básicos, é concentrada e o resíduo cristalizado por mistura com nm solvente de cristalização ou mistura de solvente.
7. 7. Um processo, de acordo com a Reivindicação 1, onde o concentrado de extracto de caldo de fermentação ou concentrado de líquido-mãe é primeiro dissolvido num primeiro solvente e extraído com um segundo solvente de hidrocarboneto não-aromático imiscível com o referido primeiro solvente, para remover as impurezas neutras não polares, sendo então a solução no primeiro solvente concentrada e o resíduo dissolvido num solvente imiscível em água e extraído com uma base aquosa ou ácido e base em qualquer ordem, para remover impurezas acídicas ou acídicas e básicas.
8. 8. Um processo de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 7, onde o solvente de hidrocarboneto não aromático é ciclo-hexano, ciclo-hexeno, hexano, heptano ou pentano ou uma mistura dos mesmos.
9. 9. Um processo de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 8, em que o solvente imiscível em água é diclorometano, éter t-butil-metílico, acetato de etilo, tolueno, 1-butanol, uma mistura de acetato de etilo/tolueno, uma mistura de heptano/acetato de etilo, ou um mistura de hexano/cloreto de metileno.
10. 10. Um processo, de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 9, em que a base aquosa é hidróxido de sódio, bicarbonato de sódio, carbonato de sódio ou hidróxido de amónio.
11. 11. Um processo, de acordo com qualquer uma das Reivindica- -4- ções 1 a 10, em que o ácido aquoso é ácido clorídrico, fosfato monopotássico ou sulfato monossódico.
12. 12. Um processo, de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 11, onde o macrólido é rapamicina, 32-desmetil-rapamicina ou 15-desoxo-rapamicina. Lisboa, 29 de Junho de 2001 /fcL/k c—-L) ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA