CN102070652B - 一种从发酵液中分离提取西罗莫司的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提出一种以逆流色谱为核心的西罗莫司快速分离提取方法，其提取流程如下：西罗莫司发酵菌丝体——萃取、脱色——高速逆流色谱分离——干燥。本发明采用逆流色谱分离技术，取代传统提取工艺的多次层析的步骤，采用萃取和逆流相结合，一次逆流分离可以得到纯度接近90%的雷帕霉素产品。相对复杂的雷帕霉素传统提取工艺相比，采用发酵菌丝体粗提后经高速逆流色谱方法具有分离路线简单，并且有利于工艺放大，适合于大规模从发酵液中快速分离制备高附加值雷帕霉素单体。本发明具有收率高，提取步骤简单、节省溶剂等优点，可应用于工业实际放大生产。

Description

一种从发酵液中分离提取西罗莫司的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种从发酵液中快速分离提取西罗莫司的方法。
背景技术
西罗莫司是含大环三稀内酯类化合物，分子结构如(I)，由吸水链霉菌发酵生产，是一种具有抗真菌、抗增殖和抗肿瘤活性的新型强效免疫抑制剂。
由于其特异性地结合并抑制哺乳动物类雷帕霉素靶蛋白（Manmalian target of rapamycin, mTOR）的作用，西罗莫司已被用为器官移植抗排斥药物、自身免疫性疾病治疗药物。现在以西罗莫司为基础开发的衍生物Temsirolimus(替西罗莫司)、Everolimus(依维莫司)、Deforolimus (AP23573，MK-8669)现已做为靶向、低毒的抗肿瘤癌药物进入临床。
目前影响西罗莫司产业化的主要关键问题为菌种发酵水平低下和生产提取路线复杂，由于雷帕霉素发酵过程存在多个杂质组分和同分异构体等现象，现阶段西罗莫司提取工艺为多步有机溶剂提取、吸附、柱层析等步骤，提取收率在40-50%左右，导致整个生产成本高居不下，因此探索高效分离提取技术及建立新型提取工艺用于西罗莫司生产具有迫切的现实意义。
高速逆流色谱技术（high-speed counter-current chromatography，HSCCC）是基于流体动力学原理而开发的一种新兴无固体载体的连续进行的高效液-液分配色谱技术，已成功应用在多种天然中药及活性成分分离，并逐渐开始在利用微生物发酵生产高附加值药物分离过程中应用。随着高速逆流色谱技术的发展，制备级（克级）工艺放大技术已成熟，适合高附加值西罗莫司产品的工业应用，本发明以雷帕霉素发酵粗提物为研究对象，对HSCCC的溶剂分配系统进行研究，确立适宜的快速分离雷帕霉素组分的溶剂系统，并对其主要杂质进行了初步的结构分析，为工业级放大奠定基础。  
发明内容
本发明的目的在于针对现有西罗莫司提取技术存在的不足，提出一种以逆流色谱为核心的西罗莫司快速分离提取方法，其提取流程如下：
1.  西罗莫司发酵菌丝体：取西罗莫司发酵液用框框过滤或离心分离，去除发酵上清液，得西罗莫司菌丝体；
2.   萃取、脱色：采用丙酮、甲醇或乙醇溶剂提取菌丝体1-3次，萃取液进一步用乙酸乙酯进行萃取1~3次，用活性炭脱色，减压浓缩后得到西罗莫司粗提物；
3.   高速逆流色谱分离：高速逆流色谱仪采用上海同田生物技术有限公司生产的TBE-300A型、TBE-1000A或TBE-5000A型。分离方法为以正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水按体积比例(4~9）-(3~6)-(4~8)-（3~7）为两相溶剂系统，上相为固定相，下相为流动相，在流速2~5 mL/min，转速600~1000 r/min, 检测波长为280 nm条件下，取西罗莫司粗提物50~250 mg溶解于下相中，进样，收集西罗莫司分离峰，得西罗莫司分离样品；
4.   干燥：将西罗莫司分离样品溶液进行减压浓缩后，冷冻干燥，得到纯度较高的白色西罗莫司样品粉末；
本发明所具有的优点：
本发明建立的从发酵液中快速分离纯化西罗莫司工艺，采用逆流色谱分离技术，取代传统提取工艺的多次层析的步骤，采用萃取和逆流相结合，一次逆流分离可以得到纯度接近90%的雷帕霉素产品。相对复杂的雷帕霉素传统提取工艺相比，采用发酵菌丝体粗提后经高速逆流色谱方法具有分离路线简单，并且有利于工艺放大，适合于大规模从发酵液中快速分离制备高附加值雷帕霉素单体。本发明具有收率高，提取步骤简单、节省溶剂等优点，可应用于工业实际放大生产。
附图说明
图1是本发明方法的流程框图。
具体实施方式
以下结合附图1详细说明本发明的工艺过程：
实施例1
1.西罗莫司发酵菌丝体：取西罗莫司发酵液用框框过滤机过滤，去除发酵上清液，得西罗莫司菌丝体。
2.萃取、脱色：采用丙酮溶剂对菌丝体提取3次，萃取液进一步用乙酸乙酯进行萃取2次，用活性炭脱色，减压浓缩后得到西罗莫司粗提物。
3.高速逆流色谱分离：高速逆流色谱仪采用上海同田生物技术有限公司生产的TBE-300A型。分离方法为以正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水按（7:5:5:5，v/v）比例混合为两相溶剂系统，上相为固定相，下相为流动相，在流速2 mL/min，转速800 r/min, 检测波长为280 nm条件下，取100 mg左右的西罗莫司粗提取溶解于10 mL下相中，进样，收集西罗莫司分离峰，得西罗莫司分离样品。
4.干燥：将西罗莫司分离样品溶液温度在40℃左右进行减压浓缩后，冷冻干燥，得到纯度较高的白色西罗莫司样品粉末。
实施例2
1.西罗莫司发酵菌丝体：取西罗莫司发酵液用离心机4000 r/min分离，去除发酵上清液，得西罗莫司菌丝体.
2.萃取、脱色：采用甲醇溶剂对菌丝体提取3次，萃取液进一步用乙酸乙酯进行萃取2次，用活性炭脱色，减压浓缩后得到西罗莫司粗提物。
3.高速逆流色谱分离：高速逆流色谱仪采用上海同田生物技术有限公司生产的TBE-300A型。分离方法为以正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水按（6:5:5:5，v/v）混合为两相溶剂系统，上相为固定相，下相为流动相，在流速3 mL/min，转速900 r/min, 检测波长为280 nm条件下，取100 mg左右的西罗莫司粗提取溶解于10 mL下相中，进样，收集西罗莫司分离峰，得西罗莫司分离样品。
4.干燥：将西罗莫司分离样品溶液在温度40℃左右条件进行减压浓缩后，冷冻干燥，得到纯度较高的白色西罗莫司样品粉末。
实施例3
1.西罗莫司发酵菌丝体：取西罗莫司发酵液用框框过滤分离，去除发酵上清液，得西罗莫司菌丝体。
2.萃取、脱色：采用乙醇溶剂对菌丝体提取3次，萃取液进一步用乙酸乙酯进行萃取2次，用活性炭脱色，减压浓缩后得到西罗莫司粗提物。
3.高速逆流色谱分离：高速逆流色谱仪采用上海同田生物技术有限公司生产的TBE-300A型。分离方法为以正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水按（5:5:5:5，v/v）混合为两相溶剂系统，上相为固定相，下相为流动相，在流速2 mL/min，转速900 r/min, 检测波长为280 nm条件下，取100 mg左右的西罗莫司粗提取溶解于10 mL下相中，进样，收集西罗莫司分离峰，得西罗莫司分离样品。
4.干燥：将西罗莫司分离样品溶液温度40℃左右进行减压浓缩后，冷冻干燥，得到纯度较高的白色西罗莫司样品粉末。

Claims (1)

1.一种从发酵液中分离提取西罗莫司的方法，其步骤如下：
（1）西罗莫司发酵菌丝体：取西罗莫司发酵液进行过滤或离心分离，去除发酵上清液，得西罗莫司菌丝体；
（2）萃取、脱色：采用丙酮、甲醇或乙醇溶剂提取菌丝体1-3次，萃取液进一步用乙酸乙酯进行萃取1~3次，用活性炭脱色，减压浓缩后得到西罗莫司粗提物；
（3）高速逆流色谱分离：高速逆流色谱仪采用上海同田生物技术有限公司生产的TBE-300A型、TBE-1000A或TBE-5000A型，分离方法为以正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水按体积比例 (4~9）-(3~6)-(4~8)-（3~7）混合为两相溶剂系统，上相为固定相，下相为流动相，在流速2~5 mL/min，转速600~1000 r/min, 检测波长为280 nm条件下，取西罗莫司粗提物50~250mg溶解于下相中，进样，收集西罗莫司分离峰，得西罗莫司分离样品溶液；
（4）干燥：将西罗莫司分离样品溶液进行减压浓缩后，冷冻干燥，得到纯度较高的白色西罗莫司样品粉末。
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