CN104725455A - 一种灵芝酸t的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种灵芝酸T的制备方法，该方法包括步骤；(1)提取和富集灵芝酸T：将灵芝菌丝体加入85-99％乙醇溶液浸泡提取，提取液浓缩；浓缩液加入石油醚震荡萃取，萃取液进行减压浓缩，获得富含灵芝酸T的萃取物；(2)高速逆流色谱法分离灵芝酸T：用高速逆流色谱仪进行灵芝酸T分离；然后用高效液相色谱法分析检测，收集、浓缩、干燥，分离得到灵芝酸T。本发明的一种灵芝酸T的制备方法操作简单，污染小，成本低，灵芝酸T的得率、纯度高。

Description

一种灵芝酸T的制备方法
技术领域
本发明属于天然药物化学领域，具体的说涉及一种灵芝酸T的制备方法。
背景技术
灵芝酸T为三萜类化合物，CAS号103992-91-2，分子式C36H52O8，分子量612.802，分子结构式如下：
灵芝酸是灵芝的次级代谢产物，具有多种药理活性。其中，灵芝酸T经文献报道，在体外细胞实验和小鼠体内实验中都具有良好的抗肿瘤效果，药理学研究证明灵芝酸T能诱导癌细胞凋亡、抑制癌细胞转移。
通过文献检索，现有的灵芝酸T的制备方法有柱层析法和色谱法，但由于其制备量小，成本高，不适合规模化高纯度灵芝酸T的制备。
发明内容
本发明的目的在于提供一种灵芝酸T的制备方法，该方法包括如下步骤：
(1)提取和富集灵芝酸T：将灵芝菌丝体加入85-99％乙醇溶液浸泡提取，提取液浓缩；浓缩液加入石油醚震荡萃取，萃取液进行减压浓缩，获得富含灵芝酸T的萃取物；
(2)高速逆流色谱法分离灵芝酸T：用高速逆流色谱仪进行灵芝酸T分离；然后用高效液相色谱法分析检测，收集、浓缩、干燥，分离得到灵芝酸T。
具体的说，本发明的一种灵芝酸T的制备方法，包括如下步骤：
(1)提取和富集灵芝酸T：将灵芝菌丝体加入5-10倍体积的85-99％乙醇溶液浸泡提取3-5次，每次40-60小时，然后将提取液浓缩；浓缩液加入1-5倍体积的石油醚震荡萃取3-5次，每次静置2-8小时，将石油醚萃取液合并，减压浓缩，获得富含灵芝酸T的萃取物；
(2)高速逆流色谱法分离灵芝酸T：溶剂体系由正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水组成，按10-14：22-26：14-18：7-11体积比混合，取上相做固定相，下相为流动相，萃取物用下相溶解并进样，转速700-1000rmp，流速为1-3ml/min，每4～10mL收集为一个馏分；然后用高效液相色谱法分析检测各试管收集液成分，并与灵芝酸T标准品作对比，按不同成分收集、浓缩、干燥，分离得到灵芝酸T。
高速逆流色谱是一种无固相载体的连续液-液分配色谱技术，与传统的色谱技术相比具有很多优势，利用该种色谱技术来制备灵芝酸化合物，不需固态支持物作载体，不存在不可逆吸附，灵芝酸的分离效率高、回收率高、分离时间短，此外，在制备过程中，样品分解率较低；溶剂流失也较少，是一种经济实用获得灵芝酸化合物的方法。
采用本发明的方法制备灵芝酸T，成本低，污染小，操作简单，且得率、纯度高。
附图说明：
图1为实施例1的高速逆流分离谱图
图2为实施例1中获得的灵芝酸T的高效液相谱图
图3为实施例2的高速逆流分离谱图
图4为实施例2中获得的灵芝酸T的高效液相谱图
具体实施方式
灵芝菌株为沪农灵芝1号Ganoderma lucidum，上海市农业科学院。
高速逆流色谱仪购自上海同田生物技术股份有限公司，仪器型号为：TBE-300B。
高效液相色谱仪为Waters公司产品，仪器型号为2695-717-600E。
灵芝酸T标准品购自国家标准物质标准样品信息中心。
实施例1：
取两阶段发酵的灵芝菌丝体8.9kg，加入7倍体积的95％乙醇溶液浸泡提取3次，每次48小时，然后将提取液减压浓缩；浓缩液加入2倍石油醚震荡萃取3次，每次静置2小时，将石油醚萃取液减压浓缩得到固体萃取物125.2g。取正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水，按12：24：16：9的体积比混合，充分分层后，取上相注满高速逆流色谱管做固定相，开转主机，转速907rpm/min，同时泵入下相做流动相，流速为2ml/min，用流动相溶解样品450mg，由进样阀进样，紫外检测器在线监测，每8ml收集为一个馏分。HPLC分析检测分离情况，并与灵芝酸T标准品作对比，收集合并灵芝酸T的馏分，浓缩干燥，用高效液相面积归一化法测得纯度为92％的灵芝酸T 41mg。
实施例2：
取两阶段发酵培养的灵芝菌丝体8.9kg，加入6倍体积的93％乙醇溶液浸泡提取3次，每次50小时，然后将提取液减压浓缩；浓缩液加入2倍石油醚震荡萃取3次，每次静置2小时，将石油醚萃取液减压浓缩得到固体萃取物125.2g。取正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水，按12：24：16：9的体积比混合，充分分层后，取上相注满高速逆流色谱管做固定相，开转主机，转速899rpm/min，同时泵入下相做流动相，流速为2ml/min，用流动相溶解样品150mg，由进样阀进样，紫外检测器在线监测，每6ml收集为一个馏分。HPLC分析检测分离情况，并与灵芝酸T标准品作对比，收集合并灵芝酸T的馏分，浓缩干燥，用高效液相面积归一化法测得纯度为92％的灵芝酸T 15mg。

Claims (2)

1.一种灵芝酸T的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
(1)提取和富集灵芝酸T：将灵芝菌丝体加入85-99％乙醇溶液浸泡提取，提取液浓缩；浓缩液加入石油醚震荡萃取，萃取液进行减压浓缩，获得富含灵芝酸T的萃取物；
(2)高速逆流色谱法分离灵芝酸T：用高速逆流色谱仪进行灵芝酸T分离；然后用高效液相色谱法分析检测，收集、浓缩、干燥，得到灵芝酸T。
2.根据权利要求1所述的灵芝酸T的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
(1)提取和富集灵芝酸T：将灵芝菌丝体加入5-10倍85-99％乙醇溶液浸泡提取3-5次，每次40-60小时，然后将提取液浓缩；浓缩液加入1-5倍石油醚震荡萃取3-5次，每次静置2-8小时，将石油醚萃取液合并，减压浓缩，获得富含灵芝酸T的萃取物；
(2)高速逆流色谱法分离灵芝酸T：溶剂体系由正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水组成，按10-14：22-26：14-18：7-11体积比混合，取上相做固定相，下相为流动相，萃取物用下相溶解并进样，转速700-1000rmp，流速为1-3ml/min，每4～10mL收集为一个馏分；然后用高效液相色谱法分析检测各试管收集液成分，并与灵芝酸T标准品作对比，按不同成分收集、浓缩、干燥，分离得到灵芝酸T。
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