CN103965276A - 从野马追中快速分离纯化单体化合物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从野马追中快速分离纯化单体化合物的方法，包括以下步骤：取干燥粉碎的野马追药材，加入乙醇溶液中加热回流或常温浸提，除去色素等成分，药渣再用水煎煮，煎煮液减压浓缩得野马追提取物；提取物再用高速逆流色谱仪分离，根据色谱图收集相应峰组分，减压浓缩干燥，得到高纯度尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶。本方法效率高，操作简单，制备量大，具有很好的推广使用价值。

Description

从野马追中快速分离纯化单体化合物的方法

技术领域

本发明属于天然药物化学领域，具体涉及一种从中药野马追中快速分离纯化尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶的方法。

背景技术

野马追又名白鼓钉、化食草等，是菊科泽兰属植物轮叶泽兰（Eupatorium lindleyanum DC.）的干燥地上部分。中医药理认为野马追味苦、性平，具有清热解毒、定喘祛痰和降血压等功效，江苏苏北民间广泛用其作为清热解毒药，在临床上也常用于治疗支气管炎、气管炎、劳伤咳嗽、吐血咯血等病。

现未有文献报道从野马追中分离纯化尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶的方法。现有文献报道从其它中草药中分离纯化尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶等的方法常采用柱层析方法。邹峥嵘等[海地瓜化学成分研究，中国天然药物, 2005年第6期]采用85%浸提，大孔树脂分离和反复硅胶柱层析的方法分离纯化，根据化合物的理化特征和光谱数据鉴定其结构，从海地瓜中分离到尿嘧啶、胸腺嘧啶等化合物。马荣等[忍冬藤正丁醇萃取部位的化学成分,中国药科大学学报, 2010年第4期] 以70%乙醇回流提取，溶剂萃取和硅胶柱分离的方法，从忍冬藤的醇提物的正丁醇萃取部位分离出尿嘧啶核苷。陈泉等[中药淡竹叶的化学成分研究(II)，沈阳药科大学学报，2005年第4期] 利用硅胶柱、大孔吸附树脂柱、Sephadex LH-20柱和制备薄层色谱法等分离手段,从淡竹叶的降血脂活性部位中分离得到4个化合物，经理化常数和光谱分析分别鉴定为胸腺嘧啶等化合物。

上述方法大多需要反复的柱层析，操作复杂，耗时长，溶剂消耗量大，而且样品损失大。

高速逆流色谱（High-Speed Counter-Current Chromatography，HSCCC）HSCCC是上世纪80年代出现的一种新型的、连续高效的液-液分配色谱，是建立在一种特殊的动力学平衡现象——单向性流体动力平衡（HDES）体系之上的一种分离方法。由于HSCCC不需任何固体支撑体作为固定相，因此避免了样品的吸附、污染、变性和峰形拖尾等问题，具有制备效率高、制备量大、费用低等优点，因而近年来日益受到人们的关注，已经广泛应用于生物医药、天然产物、环境分析、食品和化妆品等领域， 特别在天然产物行业中已被认为是一种有效的新型分离技术。

发明内容

本发明的目的在于：克服现有技术的不足，提供一种操作简便、综合成本低、分离量大、产品纯度高、样品损失小的高效快速从野马追中分离纯化尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶的方法。

本发明的技术解决方案是：从野马追中分离纯化尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶的方法包括以下工艺步骤：

（1）野马追提取物的制备：取干燥粉碎的野马追药材，以体积浓度80%-95%乙醇为提取溶剂，固液比为1：8-12加热回流提取1-3h或常温浸泡2-3天，过滤，滤渣重复处理3-4次，以去除色素等成分；固液分离后，药渣以固液比(以原药计算)为1:5-10用水煎煮0.5-1h，过滤并收集滤液，滤渣重复煎煮2-3次，合并滤液并真空浓缩得野马追提取物；

(2)提取物的纯化：采用体积比8:5-7:2-5的氯仿-甲醇-水为溶剂体系，上相为固定相，下相为流动相，流动相流速为1-3 mL/min，分离柱转速为700-900 rpm，对野马追提取物进行HSCCC分离，紫外检测器在线监测，分别收集不同馏分并减压干燥，得尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶。

本发明的优点是：野马追提取物分离后馏分经HPLC检测纯度可达95％以上，各馏分进一步提纯可得到99％以上的纯品尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶，该方法适用于从野马追中一步纯化制备高纯度的尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶，重现性好，操作简便。

附图说明

图1是实施例1采用氯仿-甲醇-水（V:V:V=8:7:3）为溶剂体系时的高速逆流色谱分离纯化野马追提取物的色谱图。

图2是实施例1分离纯化得到的尿嘧啶核苷的高效液相色谱图。

图3是实施例1分离纯化得到的胸腺嘧啶的高效液相色谱图。

图4是实施例1分离纯化得到的腺嘌呤的高效液相色谱图。

图5是实施例1分离纯化得到的尿嘧啶的高效液相色谱图。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，这些实施例不能理解为是对技术方案的限制。

实施例1：取干燥的野马追10.0 kg，粉碎后用100 L 体积浓度95％的乙醇于室温下浸泡3天，过滤，滤渣重复浸泡4次；药渣用80 L水煮沸30 min，过滤并收集滤液，滤渣重复煎煮3次，合并滤液并真空浓缩，得野马追提取物；以氯仿-甲醇-水（V:V:V=8:7:3）为溶剂体系，流动相（下相）流速为2 mL/min，分离柱转速为900 rpm，上相为固定相，对野马追提取物进行HSCCC分离，紫外检测器在线监测，收集目标成分，馏分经减压浓缩干燥，得到相应高纯度化合物。

经¹H-NMR、¹³C-NMR鉴定，所得单体化合物分别为尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶，以色谱峰面积归一化法计算，尿嘧啶核苷纯度为98.7%，胸腺嘧啶纯度为96.5%，腺嘌呤纯度为97.3%，尿嘧啶纯度为98.7%。

实施例2：取干燥的野马追1.0 kg，粉碎后用12 L 体积浓度90％的乙醇于室温下浸泡2天，过滤，滤渣重复浸泡3次；药渣用10 L水煮沸1 h，过滤并收集滤液，滤渣重复煎煮2次，合并滤液并真空浓缩，得野马追提取物；以氯仿-甲醇-水（V:V:V=4:3:2）为溶剂体系，流动相（下相）流速为3 mL/min，分离柱转速为700 rpm，上相为固定相，对野马追提取物进行HSCCC分离，紫外检测器在线监测，收集目标成分，馏分经减压浓缩干燥，得到相应高纯度化合物。

经¹H-NMR、¹³C-NMR鉴定，所得单体化合物分别为尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶，以色谱峰面积归一化法计算，尿嘧啶核苷纯度为96.8%，胸腺嘧啶纯度为95.4%，腺嘌呤纯度为96.1%，尿嘧啶纯度为97.5%。

实施例3：取干燥的野马追500 g，粉碎后用4 L 体积浓度80％的乙醇于室温下浸泡3天，过滤，滤渣重复浸泡3次；药渣用2.5 L水煮沸30 min，过滤并收集滤液，滤渣重复煎煮3次，合并滤液并真空浓缩，得野马追提取物；以氯仿-甲醇-水（V:V:V=8:5:2）为溶剂体系，流动相（下相）流速为1 mL/min，分离柱转速为800 rpm，上相为固定相，对野马追提取物进行HSCCC分离，紫外检测器在线监测，收集目标成分，馏分经减压浓缩干燥，得到相应高纯度化合物。

经¹H-NMR、¹³C-NMR鉴定，所得单体化合物分别为尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶，以色谱峰面积归一化法计算，尿嘧啶核苷纯度为97. 7%，胸腺嘧啶纯度为96.2%，腺嘌呤纯度为97.6%，尿嘧啶纯度为96.3%。

实施例4：取干燥粉碎的野马追500 g，加人6 L 体积浓度90%的乙醇，加热回流90 min，分离药渣和溶液，将药渣再重复回流提取3次，分离出药渣；药渣用5 L水煮沸30 min，过滤并收集滤液，滤渣重复煎煮3次，合并滤液并真空浓缩，得野马追提取物；以氯仿-甲醇-水（V:V:V=8:7:5）为溶剂体系，流动相（下相）流速为3 mL/min，分离柱转速为800 rpm，上相为固定相，对野马追提取物进行HSCCC分离，根据色谱图收集相应峰组分，减压浓缩干燥，得到相应高纯度化合物。

经¹H-NMR、¹³C-NMR鉴定，所得单体化合物分别为尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶，以色谱峰面积归一化法计算，尿嘧啶核苷纯度为98.3%，胸腺嘧啶纯度为97.8%，腺嘌呤纯度为97.6%，尿嘧啶纯度为97.1%。

实施例5：取干燥粉碎的野马追2 kg，加人20 L 体积浓度85%的乙醇，加热回流3 h，分离药渣和溶液，将药渣再重复回流提取3次，分离出药渣；药渣用10 L水煮沸45 min，过滤并收集滤液，滤渣重复煎煮3次，合并滤液并真空浓缩，得野马追提取物；以氯仿-甲醇-水（V:V:V=8:6:5）为溶剂体系，流动相（下相）流速为2 mL/min，分离柱转速为900 rpm，上相为固定相，对野马追提取物进行HSCCC分离，根据色谱图收集相应峰组分，减压浓缩干燥，得到相应高纯度化合物。

经¹H-NMR、¹³C-NMR鉴定，所得单体化合物分别为尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶，以色谱峰面积归一化法计算，尿嘧啶核苷纯度为96.8%，胸腺嘧啶纯度为97.4%，腺嘌呤纯度为96.1%，尿嘧啶纯度为98.2%。

实施例6：取干燥粉碎的野马追1 kg，加人8 L 体积浓度95%的乙醇，加热回流1 h，分离药渣和溶液，将药渣再重复回流提取4次，分离出药渣；药渣用8 L水煮沸1 h，过滤并收集滤液，滤渣重复煎煮2次，合并滤液并真空浓缩，得野马追提取物；以氯仿-甲醇-水（V:V:V=8:7:4）为溶剂体系，流动相（下相）流速为1 mL/min，分离柱转速为700 rpm，上相为固定相，对野马追提取物进行HSCCC分离，根据色谱图收集相应峰组分，减压浓缩干燥，得相应高纯度化合物。

经¹H-NMR、¹³C-NMR鉴定，所得单体化合物分别为尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶，以色谱峰面积归一化法计算，尿嘧啶核苷纯度为97.1%，胸腺嘧啶纯度为98.3%，腺嘌呤纯度为97.6%，尿嘧啶纯度为96.9%。

Claims (1)

1.从野马追中快速分离纯化单体化合物的方法，其特征是该方法包括以下工艺步骤：

（1）野马追提取物的制备：取干燥粉碎的野马追药材，以体积浓度80%-95%乙醇为提取溶剂，固液比为1：8-12常温浸泡2-3天或加热回流提取1-3h，过滤，滤渣重复处理3-4次；固液分离后，药渣以固液比(以原药计算)为1:5-10用水煎煮0.5-1h，过滤并收集滤液，滤渣重复煎煮2-3次，合并滤液并真空浓缩得野马追提取物；

(2)提取物的纯化：采用体积比8:5-7:2-5的氯仿-甲醇-水为溶剂体系，上相为固定相，下相为流动相，流动相流速为1-3 mL/min，分离柱转速为700-900 rpm，对野马追提取物进行HSCCC分离，紫外检测器在线监测，分别收集不同馏分并减压干燥，得尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶。