CN104031013B - 一种利用高速逆流色谱分离纯化制备丹酚酸b和迷迭香酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用高速逆流色谱分离纯化制备丹酚酸B和迷迭香酸的方法，将丹参药材粉碎、乙醇提取后，经大孔吸附树脂富集得到粗提物，粗提物进行高速逆流色谱分离，以体积比为1‑5:5‑10:1‑5:1‑10的溶剂A、溶剂B、溶剂C、溶剂D组成高速逆流溶剂体系，溶剂A为甲醇、乙醇、正己烷或异己烷，溶剂B为乙酸乙酯、乙酸丙酯或乙酸正丁酯，溶剂C为甲醇、乙醇或丙酮，溶剂D为水，上相为固定相，下相为流动相，分别制得丹酚酸B、迷迭香酸。本发明采用采用高速逆流色谱法制备，不存在不可逆吸附，避免了样品的损耗，具有分离效果好，溶剂用量少，无污染，高效、快速的特点。
Description
技术领域
本发明属于天然药物分离领域，涉及一种分离纯化丹酚酸B和迷迭香酸的方法，尤其涉及一种利用高速逆流色谱分离纯化高纯度丹酚酸B和迷迭香酸的方法。
背景技术
丹参为唇形科植物Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根，具有活血通经、祛瘀止痛、清心除烦的药效。丹参的化学成分主要为水溶性的丹酚酸类与脂溶性的丹参酮类。丹酚酸B具有强烈的抗氧化和清除氧自由基的活性。迷迭香酸是一种天然抗氧化剂，具有抗炎抗氧化等活性。
丹酚酸B分子结构式如下：
迷迭香酸分子结构式如下：
现有技术一般采用普通色谱柱法、重结晶等传统的分离方法分离植物中的有效单体，不仅费时费力、污染环境，且所有固定相对样品有不可逆性吸附作用。高速逆流色谱(HSCCC)是近年来发展起来的一种连续的无需固体支撑物的高效、快速的液液分配色谱分离技术，具有分离量大、样品无损失、回收率高、分离环境缓和、节约溶剂等特点，已经广泛应用于生物、医药、环保等领域化学物质的制备分离和纯化。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用高速逆流色谱分离纯化制备丹酚酸B和迷迭香酸的方法，该方法能够从丹参药材药材中提取纯的丹酚酸B和迷迭香酸。
本发明通过以下技术方案实现：
一种利用高速逆流色谱分离纯化制备丹酚酸B和迷迭香酸的方法，由粗提物的制备和粗提物的分离纯化两部分组成，其特征在于粗提物的分离纯化应用高速逆流色谱来进行，具体的，所述方法包括以下步骤：
(1)将丹参药材粉碎成粗粉，加入体积分数10％-95％的乙醇溶剂中，加热至回流提取数次，提取液趁热过滤，冷却，滤液减压除去溶剂，得到乙醇提取物；
(2)丹酚酸B、迷迭香酸的富集：将乙醇提取物加入填充有大孔吸附树脂的色谱柱中，用水和甲醇或乙醇的混合溶剂梯度洗脱，收集含有丹酚酸B、迷迭香酸的洗脱液，减压回收乙醇，干燥、得到丹酚酸B、迷迭香酸混合粗提物；
水和甲醇或乙醇的混合溶剂指的是水和甲醇的混合溶剂或者水和乙醇的混合溶剂，优选为水和乙醇的混合溶剂；此外，作为特别的说明，在梯度洗脱中，所述的混合溶剂包括甲醇或者乙醇的浓度为0的溶剂体系；
(3)丹酚酸B、迷迭香酸的纯化：以体积比为1-5:5-10:1-5:1-10的溶剂A、溶剂B、溶剂C、溶剂D组成高速逆流溶剂体系，将所述高速逆流溶剂体系混合充分后静置，按上下两相分开，取上相为固定相，下相为流动相，将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，设定高速逆流色谱仪，在500～1000r/min转速(优选800r/min转速)下，以0.5～5ml/min(优选1.8ml/min)的流速注入流动相，取步骤(2)得到的丹酚酸B和迷迭香酸的混合粗提物，用上相、下相体积比1：1的混合溶剂溶解后进样，分别收集丹酚酸B的流出液和迷迭香酸的流出液，浓缩、干燥，得到丹酚酸B、迷迭香酸；
所述溶剂A为甲醇、乙醇、正己烷或异己烷，所述溶剂B为乙酸乙酯、乙酸丙酯或乙酸正丁酯，所述溶剂C为甲醇、乙醇或丙酮，所述溶剂D为水。
作为优选，步骤(1)中，乙醇溶剂的体积用量以粗粉的质量计为5～20L/kg，每次回流提取的时间为30-60min，提取次数为1-3次。
步骤(1)中，所述乙醇溶剂优选体积分数50％的乙醇溶剂。
作为优选，所述步骤(2)中，所述大孔吸附树脂为非极性、弱极性或中极性的大孔吸附树脂，进一步优选为D101、AB-8、HPD300等大孔吸附树脂，更优选HPD300大孔吸附树脂。
作为优选，步骤(2)中，所述梯度洗脱条件为先用2-6倍柱体积的水洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数10％-30％乙醇或甲醇的水溶液(优选乙醇水溶液)洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数20％-40％乙醇或甲醇水溶液(优选乙醇水溶液)洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数30％-50％乙醇或甲醇水溶液(优选乙醇水溶液)洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数40％-60％乙醇或甲醇水溶液(优选乙醇水溶液)洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数50％-95％乙醇或甲醇水溶液(优选乙醇水溶液)洗脱。
进一步，所述梯度洗脱优选为：
先用2-6倍柱体积的水洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数10％乙醇的水溶液洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数30％乙醇水溶液洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数50％乙醇水溶液洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数60％乙醇水溶液洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数95％乙醇水溶液洗脱。
步骤(3)中，所述的高速逆流色谱仪中采用波长190-380nm的紫外检测器检测，根据紫外检测器光谱图的峰形对流出液进行区分；作为优选，所述紫外检测器的波长为254～300nm。
本发明的有益效果在于：
(1)本分离过程可连续进行，操作简便，效率高；
(2)采用高速逆流色谱法制备，不存在不可逆吸附，避免了样品的损耗，具有分离效果好，溶剂用量少，无污染，高效、快速的特点。
附图说明
图1为实施例1制得的乙醇提取物的高效液相色谱图。
图2为实施例1制得的丹酚酸B、迷迭香酸的混合粗提物的HPLC图谱。
图3为实施例1的高速逆流色谱(HSCCC)图。
图4为实施例1制得的化合物1丹酚酸B的HPLC图谱。
图5为实施例1制得的化合物2迷迭香酸的HPLC图谱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。
实施例1：
1、取100g丹参药材粉碎成粗粉，加入1000mL的体积分数50％乙醇加热回流提取2次，每次提取1h，合并提取液后过滤，冷却至常温，滤液用旋转蒸发仪减压至无醇，得到乙醇提取物62g，其高效液相色谱图如图1所示。
2、将3.6g乙醇提取物加30mL水分散后，加入到HPD300大孔吸附树脂柱层析，吸附结束后，依次用5倍柱体积水→5倍柱体积10％乙醇→5倍柱体积30％乙醇→5倍柱体积50％乙醇→5倍柱体积60％乙醇→5倍柱体积95％乙醇溶液洗脱，收集含有目标产物丹酚酸B、迷迭香酸的乙醇洗脱液，减压浓缩至无醇，干燥得到丹酚酸B、迷迭香酸的混合粗提物，HPLC图见图2。(％均指体积分数)
3、应用高速逆流色谱分离纯化粗提物：取正己烷、乙酸乙酯、乙醇、水，按体积比3:7:1:9混合，混合充分后静置，按上下两相分开，取上相为固定相，下相为流动相，将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，开启高速逆流色谱仪，调整转速800r·min-1，注入流动相，流动相流速1.8mL·min-1,当明显有流动相流出时，取丹酚酸B、迷迭香酸混合粗提物161mg，溶于10mL的上相、下相体积比1：1的混合液后进样，以波长280nm的紫外检测器检测流出液，根据紫外检测器光谱图，见图3，对125min到144min，165min到193min对应的流出液分别进行合并收集，减压干燥，分别得到化合物1丹酚酸B52.3mg和化合物2迷迭香酸14.5mg。(高速逆流色谱图见图3)
4、使用高效液相色谱仪对得到的化合物1和2的纯度进行检测。色谱柱C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为甲醇-乙睛-甲酸-水(30:10:1:59，v/v/v/v)；柱温40℃，体积流量0.5mL·min-1，检测波长282nm。测得化合物1和2的纯度分别达到98.4％和95.0％。(图4和图5)
5、目标化合物的结构鉴定。对化合物1和2进行1H-NMR和13C-NMR分析，经结构解析并与文献数据比对，可确定化合物1和2分别为丹酚酸B和迷迭香酸。
具体数据如下：
化合物1，(CD3OD，500MHz，δ)ppm：6.85(1H，d，J＝8.4Hz，H-5)，7.17(1H，d，J＝8.5Hz，H-6)，7.53(1H，d，J＝15.9Hz，H-7)，6.22(1H，d，J＝15.9Hz，H-8)，6.78(1H，d，J＝2.0Hz，H-2')，6.76(1H，d，J＝3.5Hz，H-5')，6.65-6.62(1H，m，H-6')，5.87(1H，d，J＝4.8Hz，H-7')，4.37(1H，d，J＝4.8Hz，H-8″)，6.75(1H，d，J＝2.7Hz，H-2")，6.72(1H，d，J＝8.0Hz，H-5")，6.67(1H，dd，J＝2.1，8.2Hz，H-6")，2.84(1H，dd，J＝9.6，14.3Hz，H-7"a)，3.03(2H，dd，J＝4.5，14.3Hz，H-7"b，H-7"'a)，5.19(2H，dd，J＝5.8，12.9Hz，H-8"，H-8"')，6.53(1H，d，J＝1.9Hz，H-2"')，6.56(1H，d，J＝8.0Hz，H-5"')，6.35-6.30(1H，m，H-6"')，3.09(1H，dd，J＝4.1，14.3Hz，H-7"'b)。13C NMR(CD3OD，125MHz，δ)ppm：121.9(C-1)，124.8(C-2)，146.2(C-3)，149.2(C-4)，122.2(C-5)，122.4(C-6)，143.7(C-7)，118.5(C-8)，168.2(C-9)，129.4(C-1′)，117.7(C-2′)，145.4(C-3′)，145.2(C-4′)，117.5(C-5′)，126.5(C-6′)，37.6(C-7′)，74.9(C-8′)，172.4(C-9′)，133.8(C-1″)，118.5(C-2″)，118.5(C-3″)，146.2(C-4″)，146.1(C-5″)，113.5(C-6″)，88.4(C-7″)，58.1(C-8″)，172.4(C-9″)，129.1(C-1″′)，116.8(C-2″′)，146.9(C-3″′)，146.7(C-4″′)，116.6(C-5″′)，122.2(C-6″′)，38.0(C-7″′)，75.8(C-8″′)，172.4(C-9″′)。
化合物2，1H NMR(CD3OD，500MHz，δ)ppm：7.06(1H，d，J＝1.7Hz，H-2)，6.96(1H，dd，J＝8.2，1.7Hz，H-5)，6.81-6.76(2H，m，H-6，2′)，7.56(1H，d，J＝15.9Hz，H-7)，6.28(1H，d，J＝15.9Hz，H-8)，6.71(1H，d，J＝8.0Hz，H-5′)，6.63(1H，br d，J＝8.0Hz，H-6′)，3.14-2.96(2H，m，H-7′)，5.18(1H，s，H-8′)；13C NMR(CD3OD，125MHz，δ)ppm：127.9(C-1)，114.8(C-2)，146.3(C-3)，149.8(C-4)，115.4(C-5)，123.2(C-6)，147.7(C-7)，116.6(C-8)，168.7(C-9)，129.8(C-1′)，117.7(C-2′)，146.9(C-3′)，145.3(C-4′)，116.4(C-5′)，121.9(C-6′)，38.2(C-7)，75.7(C-8′)，168.7(C-9′)。
实施例2：
1、丹参药材提取、大孔树脂层析分离同实施例1。
2、应用高速逆流色谱分离纯化粗提物：取正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水，按体积比3:7:1:9混合，混合充分后静置，按上下两相分开，取上相为固定相，下相为流动相，将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，开启高速逆流色谱仪，调整转速800r·min-1，注入流动相，流动相流速1.8mL·min-1,当明显有流动相流出时，取丹酚酸B、迷迭香酸混合粗提物172mg，溶于10mL的上相、下相体积比1：1的混合液后进样，以波长280nm的紫外检测器检测流出液，根据紫外检测器光谱图，对流出液分别进行合并收集，减压干燥，分别得到化合物1丹酚酸B和化合物2迷迭香酸。
3、采用HPLC按照实施例1的色谱条件，丹酚酸B和迷迭香酸的纯度分别达到92.1％和91.7％.
实施例3：
1、丹参药材提取、大孔树脂层析分离同实施例1。
2、应用高速逆流色谱分离纯化粗提物：取正己烷、乙酸乙酯、丙酮、水，按体积比3:7:1:9混合，混合充分后静置，按上下两相分开，取上相为固定相，下相为流动相，将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，开启高速逆流色谱仪，调整转速800r·min-1，注入流动相，流动相流速1.8mL·min-1,当明显有流动相流出时，取丹酚酸B、迷迭香酸混合粗提物156mg，溶于10mL的上相、下相体积比1：1的混合液后进样，以波长280nm的紫外检测器检测流出液，根据紫外检测器光谱图，对流出液分别进行合并收集，减压干燥，分别得到化合物1丹酚酸B和化合物2迷迭香酸。
3、采用HPLC按照实施例1的色谱条件，丹酚酸B和迷迭香酸的纯度分别达到91.6％和90.3％。
实施例4：
1、丹参药材提取、大孔树脂层析分离同实施例1。
2、应用高速逆流色谱分离纯化粗提物：取正己烷、乙酸乙酯、乙醇、水，按体积比3:7:1:9混合，混合充分后静置，按上下两相分开，取上相为固定相，下相为流动相，将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，开启高速逆流色谱仪，调整转速800r·min-1，注入流动相，流动相流速1.8mL·min-1,当明显有流动相流出时，取丹酚酸B、迷迭香酸混合粗提物210mg，溶于10mL的下相后进样，以波长280nm的紫外检测器检测流出液，根据紫外检测器光谱图，对流出液分别进行合并收集，减压干燥，分别得到化合物1丹酚酸B和化合物2迷迭香酸。
3、采用HPLC按照实施例1的色谱条件，丹酚酸B和迷迭香酸的纯度分别达到98.1％和94.8％。
Claims (3)
1.一种利用高速逆流色谱分离纯化制备丹酚酸B和迷迭香酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将丹参药材粉碎成粗粉，加入体积分数10％-95％的乙醇水溶液中，加热至回流提取数次，提取液趁热过滤，冷却，滤液减压除去溶剂，得到乙醇提取物；
(2)丹酚酸B、迷迭香酸的富集：将步骤(1)得到的乙醇提取物加入填充有大孔吸附树脂的色谱柱中，用水和甲醇或乙醇的混合溶剂梯度洗脱，收集含有丹酚酸B和迷迭香酸的洗脱液，减压回收溶剂，干燥、得到丹酚酸B和迷迭香酸的混合粗提物；
(3)丹酚酸B、迷迭香酸的纯化：以体积比为3:7:1:9的溶剂A、溶剂B、溶剂C、溶剂D组成高速逆流溶剂体系，将所述高速逆流溶剂体系混合充分后静置，按上下两相分开，取上相为固定相，下相为流动相，将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，设定高速逆流色谱仪，在500～1000r/min转速下，以0.5～5ml/min的流速注入流动相，取步骤(2)得到的丹酚酸B和迷迭香酸的混合粗提物，用上相、下相体积比1：1的混合溶剂溶解后进样，分别收集丹酚酸B的流出液和迷迭香酸的流出液，浓缩、干燥，得到丹酚酸B、迷迭香酸；
所述溶剂A为正己烷，所述溶剂B为乙酸乙酯，所述溶剂C为乙醇，所述溶剂D为水；
步骤(1)中，乙醇溶剂的体积用量以粗粉的质量计为5～20L/kg，每次回流提取的时间为30-60min，提取次数为1-3次；
步骤(1)中，所述乙醇溶剂为体积分数50％的乙醇溶剂；
步骤(2)中，所述大孔吸附树脂为D101、AB-8或HPD300大孔吸附树脂；
步骤(2)中，所述梯度洗脱条件为先用2-6倍柱体积的水洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数10％-30％乙醇或甲醇的水溶液洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数20％-40％乙醇或甲醇水溶液洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数30％-50％乙醇或甲醇水溶液洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数40％-60％乙醇或甲醇水溶液洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数50％-95％乙醇或甲醇水溶液洗脱。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的高速逆流色谱仪中采用波长190-380nm的紫外检测器检测，根据紫外检测器光谱图的峰形对流出液进行区分。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(3)中，所述紫外检测器的波长为254～300nm。
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