CN104327127B - 一种利用高速逆流色谱分离纯化制备安哥拉苷c、桃叶珊瑚苷和哈巴苷的方法 - Google Patents
一种利用高速逆流色谱分离纯化制备安哥拉苷c、桃叶珊瑚苷和哈巴苷的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种利用高速逆流色谱分离纯化制备安哥拉苷C、桃叶珊瑚苷和哈巴苷的方法，将玄参药材粉碎、乙醇提取后，经大孔吸附树脂富集得到安哥拉苷C粗提物、桃叶珊瑚苷和哈巴苷混合粗提物，安哥拉苷C粗提物进行高速逆流色谱分离得到安哥拉苷C粗品，然后通过中低压制备色谱制得安哥拉苷C；桃叶珊瑚苷和哈巴苷混合粗提物进行高速逆流色谱分离得到桃叶珊瑚苷粗品A和哈巴苷粗品，桃叶珊瑚苷粗品A通过中低压制备色谱结合制备液相色谱制得桃叶珊瑚苷，哈巴苷粗品通过制备色谱分离制得哈巴苷。本发明采用采用高速逆流色谱法制备，避免了样品的损耗，具有分离效果好，溶剂用量少，无污染，高效、快速的特点。
Description
(一)技术领域
本发明属于天然药物分离领域，涉及一种分离纯化安哥拉苷C、桃叶珊瑚苷和哈巴苷的方法，尤其涉及一种利用高速逆流色谱分离纯化高纯度安哥拉苷C、桃叶珊瑚苷和哈巴苷的方法。
(二)背景技术
玄参为玄参科植物玄参Scrophularia ningpoensis Hemsl的干燥根。中医认为玄参味甘、苦、咸，其性微寒，具有滋阴凉血、泻火解毒等功效，一般用于热病烦躁、发斑、夜寐不宁，自汗盗汗，喉咙肿痛等症，为临床常用中药。
现代医学表明，玄参中含萜类、苷类、生物碱等成分，具有抗炎、抗肿瘤、保肝作用。
安哥拉苷C分子结构式如下：
桃叶珊瑚苷分子结构式如下：
哈巴苷分子结构式如下：
现有技术一般采用普通色谱柱法、重结晶等传统的分离方法分离植物中的有效单体，不仅费时费力、污染环境，且所有固定相对样品有不可逆性吸附作用。高速逆流色谱(HSCCC)是近年来发展起来的一种连续的无需固体支撑物的高效、快速的液液分配色谱分离技术，具有分离量大、样品无损失、回收率高、分离环境缓和、节约溶剂等特点，已经广泛应用于生物、医药、环保等领域化学物质的制备分离和纯化。
(三)发明内容：
本发明的目的是提供利用高速逆流色谱制备安哥拉苷C、桃叶珊瑚苷和哈巴苷的方法，以克服现有技术中存在的上述问题。
本发明通过以下技术方案实现：
一种利用高速逆流色谱分离纯化制备安哥拉苷C、桃叶珊瑚苷和哈巴苷的方法，由粗提物的制备和粗提物的分离纯化两部分组成，其特征在于粗提物的分离纯化应用高速逆流色谱来进行，具体的，所述方法包括以下步骤：
(1)将玄参药材粉碎成粗粉，加入体积分数30％的乙醇溶剂中，加热至回流提取1-3次，提取液趁热过滤，冷却，滤液减压除去溶剂，得到乙醇提取物；
(2)将乙醇提取物加入填充有大孔吸附树脂的色谱柱中，用水和乙醇的混合溶剂梯度洗脱，分别收集含有安哥拉苷C的洗脱液、含有桃叶珊瑚苷和哈巴苷的洗脱液，减压回收乙醇，干燥、分别得到安哥拉苷C粗提物、桃叶珊瑚苷和哈巴苷混合粗提物；
(3)将安哥拉苷C粗提物进行高速逆流色谱分离，以体积比为4：6：10的正丁醇、乙酸乙酯、水组成高速逆流溶剂体系，将所述高速逆流溶剂体系混合充分后静置，按上下两相分开，取上相为固定相，下相为流动相，将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，设定高速逆流色谱仪，在500～1000r/min转速(优选800r/min转速)下，以0.5～5ml/min(优选1.8ml/min)的流速注入流动相，以波长190-380nm(优选210～240nm)的紫外检测器检测，当明显有流动相流出时，取安哥拉苷C粗提物，用上相、下相体积比1：1的混合溶剂溶解后进样，根据紫外检测器光谱图的峰形收集含安哥拉苷C的流出液，浓缩、干燥，制得安哥拉苷C粗品；
(4)将安哥拉苷C粗品用中低压制备色谱进行纯化，用水、甲醇体积比1：1的混合溶剂进行等度洗脱，流速35mL/min，根据波长210nm的紫外检测器的光谱图的峰形收集含安哥拉苷C的洗脱液、减压浓缩，冷冻干燥，制得安哥拉苷C纯品；
(5)将桃叶珊瑚苷和哈巴苷混合粗提物进行高速逆流色谱分离，以体积比为2:7:8:8的正丁醇、乙醇、硫酸铵饱和溶液、水组成高速逆流溶剂体系，将所述高速逆流溶剂体系混合充分后静置，按上下两相分开，取下相为固定相，上相为流动相，将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，设定高速逆流色谱仪，在500～1000r/min转速(优选800r/min转速)下，以0.5～5ml/min(优选1.5ml/min)的流速注入流动相，以波长190-380nm(优选210～240nm)的紫外检测器检测，当明显有流动相流出时，取桃叶珊瑚苷和哈巴苷混合粗提物，用上相、下相体积比1：1的混合溶剂溶解后进样，定时收集流出液，用HPLC检测，合并相同成分的流出液，分别得到含桃叶珊瑚苷的流出液和含哈巴苷的流出液，浓缩、干燥，分别制得桃叶珊瑚苷粗品A、哈巴苷粗品；
(6)将桃叶珊瑚苷粗品A通过中低压制备色谱分离，用水和甲醇的混合溶剂梯度洗脱，流速35mL/min，波长210nm的紫外检测器检测，定时收集洗脱液，用HPLC检测，合并相同成分的洗脱液，收集得到含桃叶珊瑚苷的洗脱液，浓缩，干燥，制得桃叶珊瑚苷粗品B；
(7)桃叶珊瑚苷粗品B再通过制备液相色谱进行纯化，以甲醇、水体积比5:95的混合溶剂等度洗脱，流速3mL/min，根据波长210nm的紫外检测器的光谱图的峰形收集含桃叶珊瑚苷的洗脱液，浓缩，干燥，制得桃叶珊瑚苷纯品；
(8)取步骤(5)得到的哈巴苷粗品，通过制备液相色谱进行纯化，以甲醇、水体积比12:88的混合溶剂等度洗脱，流速3mL/min，根据波长210nm的紫外检测器的光谱图的峰形收集含哈巴苷的洗脱液，浓缩，干燥，制得哈巴苷纯品。
所述步骤(1)中，乙醇溶剂的体积用量以粗粉的质量计为3～10L/kg，每次回流提取的时间为30-60min，提取次数为1-3次。
所述步骤(2)中，所述大孔吸附树脂为非极性、弱极性或中极性的大孔吸附树脂，优选D101、AB-8、DM301等大孔吸附树脂，更优选AB-8大孔吸附树脂。
所述步骤(2)中，所述梯度洗脱的程序为：
先用2-6倍柱体积的水洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数10％乙醇的水溶液洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数30％乙醇水溶液洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数50％乙醇水溶液洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数95％乙醇水溶液洗脱；
更优选步骤(2)中的梯度洗脱的程序为：先用5倍柱体积的水洗脱，再用5倍柱体积的体积分数10％乙醇的水溶液洗脱，再用5倍柱体积的体积分数30％乙醇水溶液洗脱，再用5倍柱体积的体积分数50％乙醇水溶液洗脱，再用5倍柱体积的体积分数95％乙醇水溶液洗脱。
所述步骤(6)中，将桃叶珊瑚苷粗品A通过中低压制备色谱分离，用水和甲醇的混合溶剂梯度洗脱，梯度洗脱的程序是：以甲醇为流动相A，水为流动相B，0min，流动相A的体积百分浓度为5％，设定0至10min，流动相A的体积百分浓度线性上升至10％，10至35min，流动相A的体积百分浓度线性上升至30％，35至60min，流动相A的体积百分浓度线性上升至50％。
本发明所述桃叶珊瑚苷粗品A、桃叶珊瑚苷粗品B仅用于区分不同步骤下的桃叶珊瑚苷粗品，A、B不具有化学意义。
本发明的有益效果在于：
(1)本分离过程可连续进行，操作简便，效率高；
(2)采用高速逆流色谱法制备得到了安哥拉苷C、桃叶珊瑚苷和哈巴苷，不存在不可逆吸附，避免了样品的损耗，具有分离效果好，溶剂用量少，无污染，高效、快速的特点。
(四)附图说明
图1为实施例1制得的乙醇提取物的高效液相色谱图，图中1为安哥拉苷C，2为桃叶珊瑚苷，3为哈巴苷。
图2为实施例1制得的安哥拉苷C粗提物的HPLC图谱。
图3为实施例1制得的桃叶珊瑚苷、哈巴苷混合粗提物的HPLC图谱。
图4为实施例1的安哥拉苷C粗提物的高速逆流色谱(HSCCC)图。
图5为实施例1的桃叶珊瑚苷和哈巴苷混合粗提物的高速逆流色谱(HSCCC)图。
图6为实施例1中安哥拉苷C粗品的低压制备色谱图。
图7为实施例1中桃叶珊瑚苷粗品A的低压制备色谱图。
图8为实施例1中桃叶珊瑚苷粗品B的制备液相色谱图。
图9为实施例1中哈巴苷粗品的制备液相色谱图。
图10为实施例1制得的化合物1安哥拉苷C的HPLC图谱。
图11为实施例1制得的化合物2桃叶珊瑚苷的HPLC图谱。
图12为实施例1制得的化合物3哈巴苷的HPLC图谱。
(五)具体实施方式：
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。
实施例1：
1.取50g玄参药材粉碎成粗粉，加入500mL的体积分数30％乙醇加热回流提取3次，每次提取1h，合并提取液后过滤，冷却至常温，滤液用旋转蒸发仪中减压至无醇，得到乙醇提取物，其高效液相色谱图如图1所示，图中1为安哥拉苷C，2为桃叶珊瑚苷，3为哈巴苷。
2.将4.1g乙醇提取物加30mL水分散后，加入到AB-8大孔吸附树脂柱层析，吸附结束后，依次用5倍柱体积水→10v％乙醇→30v％乙醇→50v％乙醇→95％乙醇溶液洗脱，分别收集含有目标产物安哥拉苷C、桃叶珊瑚苷和哈巴苷的乙醇洗脱液，减压浓缩至无醇，干燥得到安哥拉苷C粗提物、桃叶珊瑚苷和哈巴苷的混合粗提物，HPLC图见图2、图3。(％均指体积分数)
3.应用高速逆流色谱分离纯化安哥拉苷C粗提物。取正丁醇、乙酸乙酯、水，按体积比4：6：10混合，混合充分后静置，按上下两相分开，取上相为固定相，下相为流动相，将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，开启高速逆流色谱仪，调整转速800r·min-1，注入流动相，流动相流速1.8mL·min-1,当明显有流动相流出时，取安哥拉苷C粗提物216mg，溶于10mL的上相、下相体积比1：1的混合液后进样，以波长210nm的紫外检测器检测流出液，根据紫外检测器光谱图，见图4，对流出液进行合并收集，减压干燥，得到安哥拉苷C粗品。(高速逆流色谱图见图4)。
4.应用中低压制备色谱纯化安哥拉苷C粗品。取步骤3得到的安哥拉苷C粗品，采用YMC*GEL ODS-A C18色谱柱(49×230mm)，检测波长210nm，室温。流动相为甲醇-水(体积比50：50)，等度洗脱，流速35mL/min。根据紫外检测器光谱图，见图6，对洗脱液进行合并收集，减压干燥，得到化合物1(14.62mg)。(中低压制备色谱图见图6)。
5.应用高速逆流色谱分离纯化桃叶珊瑚苷和哈巴苷粗提物。取正丁醇、乙醇、硫酸铵饱和溶液、水，按体积比2:7:8:8混合，混合充分后静置，按上下两相分开，取下相为固定相，上相为流动相，将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，开启高速逆流色谱仪，调整转速800r·min-1，注入流动相，流动相流速1.5mL·min-1,当明显有流动相流出时，取桃叶珊瑚苷和哈巴苷混合粗提物286mg，溶于10mL的上相、下相体积比1：1的混合液后进样，以波长210nm的紫外检测器检测流出液，根据紫外检测器光谱图，见图5，定时收集流出液，用HPLC检测，合并相同成分的流出液，分别得到含桃叶珊瑚苷的流出液和含哈巴苷的流出液，减压干燥，分别得到桃叶珊瑚苷粗品A、哈巴苷粗品。(高速逆流色谱图见图5)。
6.应用中低压制备色谱纯化桃叶珊瑚苷粗品A。取步骤5得到的桃叶珊瑚苷粗品A，采用YMC*GEL ODS-A C18色谱柱(49×230mm)，检测波长210nm，室温。流动相为甲醇-水梯度洗脱，流速35mL/min，梯度洗脱的程序是：以甲醇为流动相A，水为流动相B，0min，流动相A的体积百分浓度为5％，设定0至10min，流动相A的体积百分浓度线性上升至10％，10至35min，流动相A的体积百分浓度线性上升至30％，35至60min，流动相A的体积百分浓度线性上升至50％。紫外检测器光谱图检测，定时收集洗脱液，用HPLC检测，合并相同成分的洗脱液，收集得到含桃叶珊瑚苷的洗脱液，减压干燥，得到桃叶珊瑚苷粗品B。(中低压制备色谱图见图7)。
7.应用制备液相色谱纯化桃叶珊瑚苷粗品B。取步骤6得到的桃叶珊瑚苷粗品B，采用Vemusil XBP-C18柱(10×250mm，10μm)，检测波长210nm，室温，流动相为甲醇-水(体积比5:95)，流速3mL/min。根据紫外检测器光谱图，见图8，对洗脱液进行合并收集，减压干燥，得到化合物2(17.46mg)。(制备液相色谱图见图8)。
8.应用制备液相色谱纯化哈巴苷粗品。取步骤5得到的哈巴苷粗品，采用VemusilXBP-C18柱(10×250mm，10μm)，检测波长210nm，室温，流动相为甲醇-水(体积比12:88)，流速3mL/min。根据紫外检测器光谱图，见图9，对洗脱液液进行合并收集，减压干燥，得到化合物3(34.42mg)。(制备液相色谱图见图9)。
9.使用高效液相色谱仪对得到的化合物1、2和3的纯度进行检测。色谱柱C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为乙腈(A)-0.03％磷酸水溶液(B)，梯度洗脱程序：0-10min，3％-10％A；10-20min，10％-33％A；20-25min，33％-50％A；25-30min，50％-80％A；30-35min，80％A；柱温30℃，体积流量1mL·min-1，检测波长210nm。测得化合物1、2和3的纯度分别达到98.5％、98.6％和99.0％。(图10、图11和图12)
10.目标化合物的结构鉴定。对化合物1、2和3进行1H-NMR和13C-NMR分析，经结构解析并与与文献数据比对，可确定化合物1、2和3分别为安哥拉苷C、桃叶珊瑚苷和哈巴苷。
具体数据如下：
化合物1，1H NMR(CH3OD，500MHz，δ)ppm：6.77(1H，d，J＝2.0Hz，H-2)，6.83(1H，d，J＝4.8Hz，H-5)，6.71(1H，dd，J＝8.2，2.0Hz，H-6)，2.83(2H，dd，J＝14.4，7.8Hz，H-β)，3.91(3H，s，OMe)，4.40(1H，d，J＝7.9Hz，glc-1)，4.25(1H，d，J＝6.8Hz，ara-1)，4.99(1H，t，J＝9.7Hz，glc-4)，5.21(d，J＝1.5Hz，rha-1)，1.11(3H，d，J＝6.2Hz，rha-6)，7.22(1H，d，J＝1.8Hz，acyl-2)，6.85(1H，d，J＝4.8Hz，acyl-5)，7.10(1H，dd，J＝8.2，1.8Hz，acyl-6)，6.40(1H，d，J＝15.9Hz，H-α′)，7.68(1H，d，J＝15.9Hz，H-β′)，3.83(3H，s，OMe)。13C NMR(CH3OD，125MHz，δ)ppm:132.01(C-1)，112.93(C-2)，147.54(C-3)，147.37(C-4)，117.09(C-5)，121.22(C-6)，72.18(C-α)，36.54(C-β)，56.53(OMe)，105.02(glc-1)，76.13(glc-2)，81.50(glc-3)，70.51(glc-4)，74.96(glc-5)，69.03(glc-6)，104.16(ara-1)，72.40(ara-2)，73.77(ara-3)，69.43(ara-4)，66.71(ara-5)，103.00(rha-1)，72.34(rha-2)，72.07(rha-3)，74.06(rha-4)，70.42(rha-5)，18.41(rha-6)，127.63(acyl-1)，111.88(acyl-2)，149.40(acyl-3)，150.88(acyl-4)，116.53(acyl-5)，124.39(acyl-6)，115.07(C-α′)，148.07(C-β′)，168.29(C＝O)，56.48(OMe)。
化合物2，1H NMR(500MHz，CD3OD，δ)ppm:5.11(1H，dd，J＝6.1，3.9Hz，H-1)，6.32(1H，dd，J＝6.1，1.9Hz，H-3)，4.97(1H，d，J＝7.1Hz，H-4)，2.67(1H，m，H-5)，4.69(1H，d，J＝7.9Hz，H-6)，5.77(1H，m，H-7)，2.91(1H，br，H-9)，4.19(1H，d，J＝15.8Hz，H-10)，4.36(1H，d，J＝15.3Hz，H-10)，4.43(1H，m，glc-1)，3.27～3.34(4H，m，glc2～5)，3.66(1H，dd，J＝12.0，5.4Hz，glc-6)，3.87(1H，d，J＝12.0，1.7Hz，glc-6)。13CNMR(CH3OD，125MHz，δ)ppm:97.76(C-1)，141.56(C-3)，105.72(C-4)，46.26(C-5)，82.84(C-6)，130.28(C-7)，148.01(C-8)，47.95(C-9)，61.40(C-10)，99.95(glc-l)，74.91(glc-2)，78.25(glc-3)，71.57(glc-4)，77.90(glc-5)，62.67(glc-6)。
化合物3，1H NMR(500MHz，CD3OD，δ)ppm:5.75(1H，d，J＝0.9Hz，H-1)，6.33(1H，d，J＝6.4Hz，H-3)，4.97(1H，dd，J＝6.4Hz，1.5Hz，H-4)，3.73～3.66(2H，m，H-6，glc-6a')，1.92(1H，dd，J＝13.6Hz，4.8Hz，H-7a)，1.81(1H，dd，J＝13.7Hz，0.7Hz，H-7b)，2.56(1H，s，H-9)，1.26(3H，s，H-10)，4.59(1H，d，J＝7.9Hz，glc-1')，3.23(1H，dd，J＝9.3，8.0Hz，glc-2')，3.34(2H，m，glc-3'，glc-4')，3.38(1H，m，glc-5')，3.92(1H，dd，J＝11.9Hz，1.8Hz，glc-6b')。13C NMR(CH3OD，125MHz，δ)ppm:93.22(C-1)，142.51(C-3)，108.41(C-4)，72.4(C-5)，77.5(C-6)，47.2(C-7)，78.2(C-8)，59.6(C-9)24.9(C-10)，99.3(glc-1)，74.5(glc-2)，78.2(glc-3)，71.75(glc-4)，78.19(glc-5)，62.8(glc-6)。
实施例2：
1.取50g玄参药材粉碎成粗粉，加入500mL体积分数30％乙醇加热回流提取3次，每次提取1h，合并提取液后过滤，冷却至常温。滤液用旋转蒸发仪减压至无醇，得到乙醇提取物醇提物。
2.将10.2g乙醇提取物加40mL水分散后，加入到AB-8大孔吸附树脂柱层析，吸附结束后，依次用5倍柱体积水→10％乙醇→30％乙醇→50％乙醇→95％乙醇溶液洗脱，分别收集含有目标产物安哥拉苷C、桃叶珊瑚苷和哈巴苷的乙醇洗脱液，减压浓缩至无醇，干燥得到安哥拉苷C粗提物、桃叶珊瑚苷和哈巴苷的混合粗提物。
3.应用高速逆流色谱分离纯化安哥拉苷C粗提物。取正丁醇、乙酸乙酯、水，按体积比4：6：10混合，混合充分后静置，按上下两相分开，取上相为固定相，下相为流动相，将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，开启高速逆流色谱仪，调整转速800r·min-1，注入流动相，流动相流速2.0mL·min-1,当明显有流动相流出时，取安哥拉苷C粗提物253mg，溶于10mL的上相、下相体积比1：1的混合液后进样，以波长210nm的紫外检测器检测流出液，根据紫外检测器光谱图，对流出液进行合并收集，减压干燥，得到安哥拉苷C粗品。
4.安哥拉苷C粗品中低压制备色谱纯化同实施例1中步骤4。
5.应用高速逆流色谱分离纯化桃叶珊瑚苷和哈巴苷混合粗提物。取正丁醇、乙醇、硫酸铵饱和溶液、水，按体积比2:7:8:8混合，混合充分后静置，按上下两相分开，取下相为固定相，上相为流动相，将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，开启高速逆流色谱仪，调整转速800r·min-1，注入流动相，流动相流速1.5mL·min-1,当明显有流动相流出时，取桃叶珊瑚苷和哈巴苷混合粗提物300mg，溶于10mL的上相、下相体积比1：1的混合液后进样，以波长210nm的紫外检测器检测流出液，根据紫外检测器光谱图，定时收集流出液，用HPLC检测，合并相同成分的流出液，分别得到含桃叶珊瑚苷的流出液和含哈巴苷的流出液，减压干燥，分别得到桃叶珊瑚苷粗品A、哈巴苷粗品。
6.应用中低压制备色谱分离桃叶珊瑚苷粗品A同实施例1中步骤6。
7.应用制备液相色谱纯化桃叶珊瑚苷粗品B同实施例1中步骤7。
8.应用制备液相色谱纯化哈巴苷粗品同实施例1中步骤8。
9.按上述条件得到的得到化合物1、2和3的纯度用HPLC进行检测，结果都≥98％。化合物1、2和3的产量分别为35.21mg、41.05mg、82.13mg。
HPLC分析条件同实施例1。
实施例3：
1.玄参药材提取同实施例1。
2.将10.3g乙醇提取物加40mL水分散后，加入到AB-8大孔吸附树脂柱层析，吸附结束后，依次用5倍柱体积水→10％乙醇→30％乙醇→50％乙醇→95％乙醇溶液洗脱，分别收集含有目标产物安哥拉苷C、桃叶珊瑚苷和哈巴苷的乙醇洗脱液，减压浓缩至无醇，干燥得到安哥拉苷C粗提物、桃叶珊瑚苷和哈巴苷的混合粗提物。
3.应用高速逆流色谱分离纯化安哥拉苷C粗提物。取正丁醇、乙酸乙酯、水，按体积比4：6：10混合，混合充分后静置，按上下两相分开，取上相为固定相，下相为流动相，将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，，开启高速逆流色谱仪，调整转速800r·min-1，注入流动相，流动相流速1.5mL·min-1,当明显有流动相流出时，取安哥拉苷C粗提物275mg，溶于10mL的上相、下相体积比1：1的混合液后进样，以波长210nm的紫外检测器检测流出液，根据紫外检测器光谱图，对流出液进行合并收集，减压干燥，得到安哥拉苷C粗品。
4.安哥拉苷C粗品中低压制备色谱纯化同实施例1中步骤4。
5.应用高速逆流色谱分离纯化桃叶珊瑚苷和哈巴苷混合粗提物。取正丁醇、乙醇、硫酸铵饱和溶液、水，按体积比2:7:8:8混合，混合充分后静置，按上下两相分开，取下相为固定相，上相为流动相，将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，开启高速逆流色谱仪，调整转速800r·min-1，注入流动相，流动相流速1.5mL·min-1,当明显有流动相流出时，取桃叶珊瑚苷和哈巴苷混合粗提物406mg，溶于10mL的上相、下相体积比1：1的混合液后进样，以波长210nm的紫外检测器检测流出液，根据紫外检测器光谱图，定时收集流出液，用HPLC检测，合并相同成分的流出液，分别得到含桃叶珊瑚苷的流出液和含哈巴苷的流出液，减压干燥，分别得到桃叶珊瑚苷粗品A、哈巴苷粗品。
6.应用中低压制备色谱分离桃叶珊瑚苷粗品A同实施例1中步骤6。
7.应用制备液相色谱纯化桃叶珊瑚苷粗品B同实施例1中步骤7。
8.应用制备液相色谱纯化哈巴苷粗品同实施例1中步骤8。
9.按上述条件得到的得到化合物1、2和3的纯度用HPLC进行检测，结果都≥98％。化合物1、2和3的产量分别为37.58mg、43.12mg、80.06mg。
HPLC分析条件同实施例1。
实施例4：
1.玄参药材提取同实施例1。
2.将20.1g乙醇提取物加40mL水分散后，加入到AB-8大孔吸附树脂柱层析，吸附结束后，依次用5倍柱体积水→10％乙醇→30％乙醇→50％乙醇→95％乙醇溶液洗脱，分别收集含有目标产物安哥拉苷C、桃叶珊瑚苷和哈巴苷的乙醇洗脱液，减压浓缩至无醇，干燥得到安哥拉苷C粗提物、桃叶珊瑚苷和哈巴苷的混合粗提物。
3.应用高速逆流色谱分离纯化安哥拉苷C粗提物。取正丁醇、乙酸乙酯、水，按体积比4：6：10混合，混合充分后静置，按上下两相分开，取上相为固定相，下相为流动相，将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，，开启高速逆流色谱仪，调整转速800r·min-1，注入流动相，流动相流速1.8mL·min-1,当明显有流动相流出时，取安哥拉苷C粗提物272mg，溶于10mL的下相后进样，以波长210nm的紫外检测器检测流出液，根据紫外检测器光谱图，对流出液进行合并收集，减压干燥，得到安哥拉苷C粗品。
4.安哥拉苷C粗品中低压制备色谱纯化同实施例1中步骤4。
5.应用高速逆流色谱分离纯化桃叶珊瑚苷和哈巴苷混合粗提物。取正丁醇、乙醇、硫酸铵饱和溶液、水，按体积比2:7:8:8混合，混合充分后静置，按上下两相分开，取下相为固定相，上相为流动相，将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，开启高速逆流色谱仪，调整转速800r·min-1，注入流动相，流动相流速1.5mL·min-1,当明显有流动相流出时，取桃叶珊瑚苷和哈巴苷混合粗提物298mg，溶于10mL的上相后进样，以波长210nm的紫外检测器检测流出液，根据紫外检测器光谱图，定时收集流出液，用HPLC检测，合并相同成分的流出液，分别得到含桃叶珊瑚苷的流出液和含哈巴苷的流出液，减压干燥，分别得到桃叶珊瑚苷粗品A、哈巴苷粗品。
6.应用中低压制备色谱分离桃叶珊瑚苷粗品A同实施例1中步骤6。
7.应用制备液相色谱纯化桃叶珊瑚苷粗品B同实施例1中步骤7。
8应用制备液相色谱纯化哈巴苷粗品同实施例1中步骤8。
9.按上述条件得到的得到化合物1、2和3的纯度用HPLC进行检测，结果都≥98％。化合物1、2和3的产量分别为80.25mg、88.33mg、175.48mg。
HPLC分析条件同实施例1。
Claims (10)
1.一种利用高速逆流色谱分离纯化制备安哥拉苷C、桃叶珊瑚苷和哈巴苷的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
(1)将玄参药材粉碎成粗粉，加入体积分数30％的乙醇溶剂中，加热至回流提取1-3次，提取液趁热过滤，冷却，滤液减压除去溶剂，得到乙醇提取物；
(2)将乙醇提取物加入填充有大孔吸附树脂的色谱柱中，用水和乙醇的混合溶剂梯度洗脱，分别收集含有安哥拉苷C的洗脱液、含有桃叶珊瑚苷和哈巴苷的洗脱液，减压回收乙醇，干燥、分别得到安哥拉苷C粗提物、桃叶珊瑚苷和哈巴苷混合粗提物；
(3)将安哥拉苷C粗提物进行高速逆流色谱分离，以体积比为4：6：10的正丁醇、乙酸乙酯、水组成高速逆流溶剂体系，将所述高速逆流溶剂体系混合充分后静置，按上下两相分开，取上相为固定相，下相为流动相，将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，设定高速逆流色谱仪，在500～1000r/min转速下，以0.5～5mL/min的流速注入流动相，以波长190-380nm的紫外检测器检测，当明显有流动相流出时，取安哥拉苷C粗提物，用上相、下相体积比1：1的混合溶剂溶解后进样，根据紫外检测器光谱图的峰形收集含安哥拉苷C的流出液，浓缩、干燥，制得安哥拉苷C粗品；
(4)将安哥拉苷C粗品用中低压制备色谱进行纯化，用水、甲醇体积比1：1的混合溶剂进行等度洗脱，流速35mL/min，根据波长210nm的紫外检测器的光谱图的峰形收集含安哥拉苷C的洗脱液、减压浓缩，冷冻干燥，制得安哥拉苷C纯品；
(5)将桃叶珊瑚苷和哈巴苷混合粗提物进行高速逆流色谱分离，以体积比为2:7:8:8的正丁醇、乙醇、硫酸铵饱和溶液、水组成高速逆流溶剂体系，将所述高速逆流溶剂体系混合充分后静置，按上下两相分开，取下相为固定相，上相为流动相，将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，设定高速逆流色谱仪，在500～1000r/min转速下，以0.5～5mL/min的流速注入流动相，以波长190-380nm的紫外检测器检测，当明显有流动相流出时，取桃叶珊瑚苷和哈巴苷混合粗提物，用上相、下相体积比1：1的混合溶剂溶解后进样，定时收集流出液，用HPLC检测，合并相同成分的流出液，分别得到含桃叶珊瑚苷的流出液和含哈巴苷的流出液，浓缩、干燥，分别制得桃叶珊瑚苷粗品A、哈巴苷粗品；
(6)将桃叶珊瑚苷粗品A通过中低压制备色谱分离，用水和甲醇的混合溶剂梯度洗脱，流速35mL/min，波长210nm的紫外检测器检测，定时收集洗脱液，用HPLC检测，合并相同成分的洗脱液，收集得到含桃叶珊瑚苷的洗脱液，浓缩，干燥，制得桃叶珊瑚苷粗品B；
(7)桃叶珊瑚苷粗品B再通过制备液相色谱进行纯化，以甲醇、水体积比5:95的混合溶剂等度洗脱，流速3mL/min，根据波长210nm的紫外检测器的光谱图的峰形收集含桃叶珊瑚苷的洗脱液，浓缩，干燥，制得桃叶珊瑚苷纯品；
(8)取步骤(5)得到的哈巴苷粗品，通过制备液相色谱进行纯化，以甲醇、水体积比12:88的混合溶剂等度洗脱，流速3mL/min，根据波长210nm的紫外检测器的光谱图的峰形收集含哈巴苷的洗脱液，浓缩，干燥，制得哈巴苷纯品。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，乙醇溶剂的体积用量以粗粉的质量计为3～10L/kg，每次回流提取的时间为30-60min，提取次数为1-3次。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中，所述大孔吸附树脂为非极性、弱极性或中极性的大孔吸附树脂。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中，所述大孔吸附树脂为D101、AB-8、DM301大孔吸附树脂。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中，所述大孔吸附树脂为AB-8大孔吸附树脂。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中，所述梯度洗脱的程序为：
先用2-6倍柱体积的水洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数10％乙醇的水溶液洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数30％乙醇水溶液洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数50％乙醇水溶液洗脱，再用2-6倍柱体积的体积分数95％乙醇水溶液洗脱。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中，所述梯度洗脱的程序为：
先用5倍柱体积的水洗脱，再用5倍柱体积的体积分数10％乙醇的水溶液洗脱，再用5倍柱体积的体积分数30％乙醇水溶液洗脱，再用5倍柱体积的体积分数50％乙醇水溶液洗脱，再用5倍柱体积的体积分数95％乙醇水溶液洗脱。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(6)中，梯度洗脱的程序是：以甲醇为流动相A，水为流动相B，0min，流动相A的体积百分浓度为5％，设定0至10min，流动相A的体积百分浓度线性上升至10％，10至35min，流动相A的体积百分浓度线性上升至30％，35至60min，流动相A的体积百分浓度线性上升至50％。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(3)或步骤(5)中，所述紫外检测器的波长为210～254nm。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(3)或步骤(5)中，高速逆流色谱仪的条件为：800r/min转速，流速1.5mL/min。
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