CN109879919B - 一种从酸枣仁中分离制备三种黄酮苷的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从酸枣仁中分离制备三种黄酮苷的方法，属于中药成分分离技术领域。方法包括如下步骤：用乙醇水溶液超声提取酸枣仁得提取物；该提取物水溶液上样到大孔树脂柱上，以蒸馏水和乙醇水溶液洗脱，收集乙醇水溶液洗脱液蒸干得树脂纯化产物；树脂纯化产物用制备HPLC分离得流份1、2和3；流份1经重结晶得斯皮诺素，纯度大于98％；流份2和3经硅胶柱层析分离，分别得到6″′‑芥子酰斯皮诺素和6″′‑阿魏酰斯皮诺素，纯度均大于95％。本发明结合大孔树脂与制备HPLC技术，实现了酸枣仁中三种高纯度黄酮苷的同步分离；本发明建立的纯化方法简单、成本低、快速易行，适合规模化制备。
Description
技术领域
本发明属于中药有效成分分离技术领域，具体涉及一种从酸枣仁中分离制备三种黄酮苷的方法。
背景技术
酸枣仁为鼠李科植物酸枣Ziziphus jujuba Mill.Var.spinosa(Bunge)Hu exH.F.chou的干燥成熟种子，最早记载于汉代的《神农本草经》中，主要功效为安心养神、敛汗生津等，可用于治疗虚烦不眠，惊悸多梦，体虚多汗等症。酸枣仁是卫生部颁布的药食同源两用品，对人体有效且较为安全。
药理实验研究表明，黄酮化合物是酸枣仁发挥抗抑郁及镇静催眠作用的有效成分。其中，斯皮诺素和6”'-阿魏酰斯皮诺素是酸枣仁中含有的主要黄酮苷类活性物质。斯皮诺素具有抗焦虑、镇静催眠的作用，还可与6”'-阿魏酰斯皮诺素共同发挥镇静催眠作用，是《中华人民共和国药典》规定的含量测定指标之一。另外，酸枣仁中还含有6”'-芥子酰斯皮诺素、6″′-对香豆酰斯皮诺素、异斯皮诺素、葛根素等多种黄酮类化合物。鉴于黄酮化合物是酸枣仁中主要的有效成分和含量测定指标之一，从酸枣仁中获得高纯度的黄酮单体用于药理实验和含量测定是非常有必要的。
发明内容
本发明提供了一种工艺简单、易操作，成本低的从酸枣仁中分离制备三种黄酮苷的方法。
本发明包括以下具体步骤：
1.酸枣仁低温烘干、粉碎后，加入一定体积的乙醇水溶液，于室温下浸泡24h之后，使用超声法进行提取，提取完毕，合并提取液，减压蒸馏回收溶剂，得酸枣仁提取物；
2.所得提取物加水溶解，得酸枣仁提取物水溶液，以一定流速上样到大孔树脂柱，上样完毕后，先用蒸馏水洗脱，再用一定体积分数的乙醇水溶液洗脱，合并乙醇洗脱液，减压蒸馏回收溶剂至干得大孔树脂纯化产物；
3.大孔树脂纯化产物使用制备HPLC分离，获得流份1、流份2和流份3。流份1经重结晶后，得斯皮诺素，纯度大于98％；流份2上样到硅胶柱层析，以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂，得6″′-芥子酰斯皮诺素，纯度大于95％；流份3上样到硅胶柱层析，以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂，得6″′-阿魏酰斯皮诺素，纯度大于95％。
所述的步骤1中，所用的乙醇水溶液的体积分数为60％-90％，料液比为1：5-1：15，超声功率为80-100W，提取温度为30-60℃，提取时间为0.5-1.5h，提取次数为1-3次。
所述的步骤2中，酸枣仁提取物水溶液的浓度为60-100mg/mL，使用的大孔树脂为HPD-500树脂、HPD-300树脂和AB-8树脂中的任一种，上样流速为3-5BV/h，上样体积为6-12BV。
所述的步骤2中，洗脱方式为使用蒸馏水和30％-70％乙醇洗脱，用量分别为3-10BV，洗脱流速为3-5BV/h，收集30％-70％乙醇洗脱物，减压蒸馏回收溶剂至干得树脂纯化产物。
所述的步骤3中，制备HPLC色谱条件如下：色谱柱为YMC-pack ODS-A色谱柱(20×250mm，5μm)；流动相为乙腈(A)-0.1％醋酸水溶液(B)；梯度洗脱条件为：0-15min，20％-30％A；15-20min，30％-45％A；20-25min，45％-50％A；25-30min，50％-100％A；30-32min，100％-20％A；流速为10mL/min；波长为350nm。
所述的步骤3中，流份1重结晶所用的溶剂为二氯甲烷和甲醇的混合溶剂，体积比为1：1-1：3；流份2使用的柱层析硅胶为200-300目，所述的洗脱剂二氯甲烷-甲醇的体积比为5：1-3：1；流份3使用的柱层析硅胶为200-300目，所述的洗脱剂二氯甲烷-甲醇的体积比为5：1-3：1。
本发明的有益效果是：
(1)本发明创造性地结合大孔树脂与制备HPLC进行纯化，实现了酸枣仁中斯皮诺素、6″′-芥子酰斯皮诺素和6″′-阿魏酰斯皮诺素的同步分离，所得到的三种化合物纯度较高，斯皮诺素纯度大于98％，6″′-芥子酰斯皮诺素和6″′-阿魏酰斯皮诺素纯度大于95％。
(2)本发明建立的纯化方法简单、成本低、快速易行，适合斯皮诺素、6”'-芥子酰斯皮诺素和6″′-阿魏酰斯皮诺素的规模化制备。
附图说明
图1为纯化后得到的斯皮诺素单体的HPLC色谱图
图2为纯化后得到的6″′-芥子酰斯皮诺素单体的HPLC色谱图
图3为纯化后得到的6″′-阿魏酰斯皮诺素单体的HPLC色谱图
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不仅局限于下述的实施方式。
实施例一：
1.酸枣仁干燥、粉碎后，称取500g，加入4L体积分数为80％的乙醇溶液，室温浸泡24h，于50℃、100W下超声提取两次，每次1h，提取两次，提取完毕后滤除药渣，合并两次提取液，减压蒸馏回收溶剂，得酸枣仁提取物。
2.酸枣仁提取物加入蒸馏水，配成浓度为60mg/mL的水溶液，以5BV/h的流速上样到HPD-500大孔树脂柱上，上样体积为7BV。上样完毕后，先用蒸馏水(5BV)进行洗涤，再使用70％乙醇(5BV)进行洗脱，洗脱流速为5BV/h。收集70％乙醇洗脱物，减压蒸馏回收溶剂至干，得树脂纯化产物。
3.树脂纯化产物用50％甲醇溶解，使用制备HPLC分离，色谱柱为YMC-pack ODS-A色谱柱(20×250mm,5μm)；流动相为乙腈(A)-0.1％醋酸水溶液(B)；梯度洗脱条件为：0-15min，20％-30％A；15-20min，30％-45％A；20-25min，45％-50％A；25-30min，50％-100％A；30-32min，100％-20％A；流速为10mL/min；波长为350nm，分别收集得到流份1、流份2和流份3。流份1使用二氯甲烷-甲醇(1：1)进行重结晶，得到高纯度斯皮诺素，纯度大于98％，色谱图见图1；流份2使用200-300目柱层析硅胶进行分离，洗脱剂为二氯甲烷-甲醇(体积比为4：1)，得到6″′-芥子酰斯皮诺素，纯度大于95％，色谱图见图2；流份3使用200-300目柱层析硅胶进行分离，洗脱剂为二氯甲烷-甲醇(体积比为5：1)，得到6″′-阿魏酰斯皮诺素，纯度大于95％，色谱图见图3。
Claims (1)
1.一种从酸枣仁中分离制备三种黄酮苷的方法，其特征在于包括以下具体步骤：
(1)酸枣仁低温烘干、粉碎后，加入一定体积的乙醇水溶液，于室温下浸泡24h之后，使用超声法进行提取，提取完毕，合并提取液，减压蒸馏回收溶剂，得酸枣仁提取物；
(2)所得提取物加水溶解，得酸枣仁提取物水溶液，以一定流速上样到大孔树脂柱，上样完毕后，先用蒸馏水洗脱，再用一定体积分数的乙醇水溶液洗脱，合并乙醇洗脱液，减压蒸馏回收溶剂至干得大孔树脂纯化产物；
(3)大孔树脂纯化产物使用制备HPLC分离，获得流份1、流份2和流份3，流份1经重结晶后，得斯皮诺素，纯度大于98％；流份2上样到硅胶柱层析，以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂，得6″′-芥子酰斯皮诺素，纯度大于95％；流份3上样到硅胶柱层析，以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂，得6″′-阿魏酰斯皮诺素，纯度大于95％；
其中，所述的步骤(1)中，所用的乙醇水溶液的体积分数为60％-90％，料液比为1：5-1：15，超声功率为80-100W，提取温度为30-60℃，提取时间为0.5-1.5h，提取次数为1-3次；
所述的步骤(2)中，酸枣仁提取物水溶液的浓度为60-100mg/mL，使用的大孔树脂为HPD-500树脂、HPD-300树脂和AB-8树脂中的任一种，上样流速为3-5BV/h，上样体积为6-12BV；洗脱方式为使用3-10BV体积量的蒸馏水和3-10BV体积量的30％-70％乙醇洗脱，洗脱流速为3-5BV/h，收集30％-70％乙醇洗脱物，减压蒸馏回收溶剂至干得树脂纯化产物；
所述的步骤(3)中，制备HPLC色谱条件如下：色谱柱为YMC-pack ODS-A色谱柱，20×250mm,5μm；流动相为乙腈(A)-0.1％醋酸水溶液(B)；梯度洗脱条件为：0-15min，20％-30％A；15-20min，30％-45％A；20-25min，45％-50％A；25-30min，50％-100％A；30-32min，100％-20％A；流速为10mL/min；波长为350nm；流份1重结晶所用的溶剂为二氯甲烷和甲醇的混合溶剂，比例为1：1-1：3；流份2使用的柱层析硅胶为200-300目，所述的洗脱剂二氯甲烷-甲醇的体积比为5：1-3：1；流份3使用的柱层析硅胶为200-300目，所述的洗脱剂二氯甲烷-甲醇的体积比为5：1-3：1。
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