CN102351819B

CN102351819B - 一种高纯度丹参酚酸b的提取纯化制备方法

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Publication number: CN102351819B
Application number: CN201110330616.1A
Authority: CN
Inventors: 汪涛; 李金华; 刘忠云; 葛发欢; 许定舟; 黄裕; 杨丽; 钟鸣; 张聪琪
Original assignee: GUANGZHOU HANFANG PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: GUANGZHOU HANFANG PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2011-10-27
Filing date: 2011-10-27
Publication date: 2014-05-14
Anticipated expiration: 2031-10-27
Also published as: CN102351819A

Abstract

本发明公开了一种高纯度丹酚酸B的提取纯化方法，包括以下步骤：(1)将丹参药材粉碎成细粉，过20～60目筛；(2)加入乙醇溶液，在低于5℃下浸泡，超声提取，提取过程控制温度低于25℃；(3)提取液离心，过滤，减压回收乙醇至提取液无醇味，提取液浓缩，过滤；(4)澄清提取液，先经过大孔树脂富集，再进行色谱柱层析纯化，得到丹酚酸B流份；(5)真空干燥或冷冻干燥，即得提取物。本发明的新的工艺方法，成本低廉，只用到乙醇作为有机溶剂，能够提取分离纯化得到含量大于90%的丹酚酸B，适于工业化生产。

Description

一种高纯度丹参酚酸B的提取纯化制备方法

技术领域

本发明涉及一种高纯度丹参酚酸B提取分离的制备方法。

背景技术

丹参是唇形科植物丹参（Salvia miltionrrhiza Bge）的干燥根及根茎，主要有祛瘀止痛、活血调经、养血安神之功效，被广泛应用于心血管疾病的治疗。

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丹参的重要活性成分是水溶性的丹参酚酸类，丹参酚酸类主要以丹参酚酸B为代表。药理研究表明，丹酚酸B在清除氧自由基、保护心脑缺血再灌注损伤和抗脂质过氧化、减轻肝组织纤维化等方面具有较强的药理作用。其分子式是C₃₆H₂₈O₁₈，分子量是718，结构式如下：

从结构式看出，丹酚酸B是二分子丹参素与一分子原紫草酸缩合而成的四聚咖啡酸类化合物，其化学结构中存在的酚羟基和羧基，在水溶液中很不稳定。张军等（中国中药杂志，30（10）：789-790）发现丹酚酸B在提取液中的含量随加热时间的延长先增大后减少。毛声俊等（中国医药报，2003年6月10日）发现，随加热时间的延长，注射液中丹参素的含量升高，推测其原因是缩合酚酸（包括丹酚酸B）降解生成了丹参素。倪力军等（中药新药与临床药理，2006，17（1）：55～57）在研究加热方式对缩合酚酸的影响时发现，丹酚酸B对温度很敏感，加热方式不同，提取液中丹酚酸B的含量相差1倍以上。

目前专利报道的丹酚酸B的分离纯化路线主要是：药材提取—粗分离—柱层析纯化过程。不同提取分离纯化方法的区别在于提取所用方法及分离纯化精制所采用方法不同。黎莲娘等（中国专利CN1384090A）采用热水提取，乙醇沉淀后，使用大孔树脂柱分离，得到含40%丹酚酸B的提取物；王强等（中国专利CN1857403A）采用加水煎煮，乙醇沉淀后，酸化，乙酸乙酯萃取，得到含量大于55%的丹酚酸B提取物；冯鹤等（中国专利CN101270103A）采用30～60%乙醇溶液热提取1～4次，回收乙醇后，使用大孔树脂分离，获得含量大于60%的丹酚酸B提取物；齐葳等（中国专利CN101186572A）采用水提取，酸化加盐后，使用大孔树脂分离，分段收集得到含80%的丹酚酸B提取物；张国力等（中国专利CN1528756A）采用热水提取，壳聚糖絮凝沉淀，再用乙酸乙酯萃取，最后用硅胶柱层析获得纯度在50%～96%的丹酚酸B样品；张凤侠等（中国专利CN1425659A）采用热水2次浸提，再酸化后，采用多种填料类型的色谱柱获得纯度在90%以上的丹酚酸B；王晓等（中国专利CN1995027A）采用乙醇热回流提取，提取液浓缩后加水调节Ph值，用乙醚萃取后得到丹酚酸B粗提物，粗提物经半制备逆流色谱仪得到纯度大于95%的丹酚酸B；肖红斌等（中国专利CN101210002A）是以粗提物为原料，采用制备型高效液相色谱分离，获得纯度大于98%的丹酚酸B化学对照品。

丹酚酸B提取分离的现有技术存在的不足主要表现在：提取过程以热提取为主，受热的丹酚酸B易产生降解，造成丹酚酸B的提取率降低，同时杂质增多，加大纯化丹酚酸B的难度。除杂过程醇沉或絮凝剂的使用，会造成丹酚酸B的大量损失；使用有机溶剂萃取，容易产生乳化，有机溶剂用量大，不但提高成本，而且不可避免有机溶剂的残留。最后纯化精制部分，采用半制备逆流色谱和制备高效液相色谱分离技术，虽然得到了95%及以上含量的丹酚酸B，但是这两种技术上样量少，设备要求高，主要是在实验室阶段，难以实现工业化大生产。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种提取效率高，工艺简单，适于工业生产，且成本低的丹酚酸B的提取纯化方法。

本发明根据丹酚酸B化合物的性质，综合运用几种提取纯化方法，将其进行有机组合，开发出了一套适合分离纯化丹酚酸B的新方法。具体方法包括以下步骤：

(1) 将丹参药材粉碎成细粉，过20～60目筛；

(2) 加入乙醇溶液，在低于5℃下浸泡，超声提取，提取过程控制温度低于25℃。丹酚酸B是一个大极性的亲水化合物，其结构中既有大极性的酚羟基和羧基，又存在一定数量小极性苯环结构，含醇水溶液对药材的浸泡将有利于丹酚酸B物质的溶出，同时大大降低丹参脂溶性成分的溶出，为下一步的分离纯化提供便利；另外丹酚酸B不稳定，尤其低浓度丹酚酸B水溶液，30℃下放置1小时，有5%的降解，丹酚酸B在乙醇水溶液中的稳定性要大于纯水，低温状态下更有利于溶出的丹酚酸B的稳定。本发明利用此原理，采用低温冷浸结合超声提取，成功高效提取丹酚酸B；

(3) 提取液离心，过滤，减压回收乙醇至提取液无醇味，提取液浓缩，过滤；

(4) 澄清提取液，先经过大孔树脂富集，再进行色谱柱层析纯化，得到纯度大于90%的酚酸B流份；

(5) 冷冻干燥，即得提取物。

在上述提取纯化方法中，所述步骤(1)中细粉是采用生化的方法或机械破碎而成。

在上述提取纯化方法中，所述步骤(2)中，加入的乙醇溶液量是药材的10～15倍体积，所述乙醇溶液为体积百分比40%～80%乙醇溶液。

在上述提取纯化方法中，所述步骤(2)中，浸泡时间为12小时，超声提取时间为20～60min。

在上述提取纯化方法中，所述步骤(3)中的提取液除醇浓缩采用减压真空浓缩，浓缩时，控制提取液温度小于60℃。

在上述提取纯化方法中，所述步骤(4)中，所述大孔树脂富集所采用的大孔树脂为：非极性或弱极性大孔树脂。

在上述提取纯化方法中，所述非极性或弱极性大孔树脂为AB-8，D-101或HPD750。

在上述提取纯化方法中，所述步骤(4)中，所述色谱柱为动态轴向加压色谱柱，色谱柱填料是硅胶或聚酰胺。所述动态轴向加压色谱柱技术是通过活塞的上下运动来装柱，维持柱压和卸柱，活塞周边配备了特殊设计的密封圈，能容许活塞上下自由滑动，同时又能保持高的密封压。活塞运动和压力维持靠的是液压，液压动力比轴向压缩柱的弹簧动力更稳定、更均匀。这些技术使得它具有成本低、寿命长、柱效高、对称性和重复性好的特点，可以装填直径范围大（50mm～1000mm），且保持与分析柱相当的分离效果。

在上述提取纯化方法中，所述步骤（3）为：提取液离心，过滤，减压回收乙醇至提取液无醇味，提取液浓缩，经大孔树脂吸附分离：浓缩液上大孔吸附树脂，蒸馏水洗脱至洗脱液澄清后，再用20%～40%乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，富含丹酚酸B洗脱液流份浓缩，过滤。

在上述提取纯化方法中，所述步骤（4）为：澄清提取液，先经过大孔树脂富集，再进行色谱柱层析纯化，依次用1～3倍柱体积的水、3～5倍柱体积20%～50%的乙醇溶液洗脱除杂，然后再用60%～80%的乙醇溶液洗脱丹酚酸B，合并含有丹酚酸B的洗脱液，经浓缩干燥后，得纯度大于90%的酚酸B干粉。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、中药有效成分的溶出速度与药物粉碎程度有关，用破碎技术粉碎而成的细粉对有效成分破坏或损失少，同时又能最大限度的快速溶出有效成份。本发明采用破碎技术粉碎原药材，增加了药材与溶剂的接触面积，提高了丹参酚酸B的溶出率和提取效率。

2、本发明在丹酚酸B提取中采用低温冷浸与超声提取相结合的方法，充分考虑丹酚酸B的热不稳定性和易降解性，提取方式简单，能高效提取丹参药材中的丹酚酸B，一次提取率就能达到95%以上，最大限度的避免了丹参酚酸B的降解。

3、本发明采用大孔树脂吸附—聚酰胺加压工业色谱偶联技术，使得聚酰胺上样量增大，实现大量制备高纯度丹酚酸B；分离材料均为可重复利用材料，可降低生产成本，洗脱溶剂均采用乙醇—水体系，除了低毒性的乙醇溶剂，无需其他有机溶剂，便于产业化。

4、本发明重点在破碎超声低温提取—大孔树脂吸附分离—动态轴向加压柱层析的工艺集成创新，整个过程考虑丹酚酸B的溶解性、易降解性，从而大量、稳定制备高纯度丹酚酸B，实现产业化。

附图说明

图1为本发明实施例1制备的丹酚酸B的样品色谱图；

图2为丹参丹酚酸B标准品色谱图。

具体实施方式

下述乙醇的浓度为体积百分比浓度( V/V, % )。

丹参酚酸B含量测定方法：高效液相色谱法测定丹参总酚酸提取物中丹参酚酸B含量；色谱条件参照2010版中国药典一部374页丹参总酚酸提取物含量测定项。具体如下：Hypersil ODS2色谱柱(5μm，4.6㎜×250㎜)流动相以乙腈为流动相A，以0.05%磷酸溶液为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；检测波长为286nm；柱温30℃；流速为1.0ml/min。

表1 迷迭香酸HPLC梯度洗脱条件

时间（min）	流动相A（%）	流动相B(%)
			0~15	10→20	90→80
15~35	20→25	80→75
			35~45	25→30	75→70
45~55	30→90	70→10
			55~70	90	10

实施例1

1、提取：取破碎成细粉的丹参药材500g，加入10倍体积量(V/W)60%乙醇，于5℃浸泡24小时，再超声提取30min，提取过程用循环水冷却控制提取液温度不超过20℃，离心，提取液回收乙醇至无醇味。

2、大孔树脂吸附分离：澄清无醇味提取液上D-101型大孔树脂柱，上样样品（以原药材干重计算）与树脂量之比为1:2（W/V），先用2倍柱体积的水洗脱杂质，再用5倍柱体积浓度为30%的乙醇水溶液洗脱。

3、工业色谱柱层析：大孔树脂30%乙醇水溶液洗脱部分，浓缩除醇，上聚酰胺（200~400目）动态轴向加压色谱柱，先用酸水除杂，依次用3倍柱体积20%乙醇洗脱，5倍柱体积50%乙醇洗脱，最后用3倍柱体积70%乙醇洗脱。

4、70%乙醇洗脱液在温度60℃、真空度-0.1Mpa的条件下真空浓缩，浓缩液冷冻干燥后，得到纯度为91.7%的丹酚酸B。所得丹酚酸B的样品色谱图如图1所示。

实施例2

同实施例1，所不同的是药材加入药材12倍体积量(V/W)的乙醇水溶液，最后得到纯度为91.5%的丹酚酸B。

实施例3

同实施例1，所不同的是药材加入药材15倍体积量(V/W)的乙醇水溶液，最后得到纯度为92.5%的丹酚酸B。

实施例4

同实施例2，所不同的是大孔树脂除杂，所用的大孔树脂型号是HPD750，最后得到纯度为91.6%的丹酚酸B。

实施例5

同实施例2，所不同的是大孔树脂除杂，所用的大孔树脂型号是AB-8，最后得到纯度为90.9%的丹酚酸B。

实施例6

同实施例2，所不同的是动态轴向加压色谱柱层析，所用的填料是硅胶（200~400目），最后得到纯度为91.3%的丹酚酸B。

Claims

1.一种高纯度丹酚酸B的提取纯化方法，其特征在于：

（1）提取：取破碎成细粉的丹参药材500g，加入10倍体积量V/W 60%乙醇，于5℃浸泡24小时，再超声提取30min，提取过程用循环水冷却控制提取液温度不超过20℃，离心，提取液回收乙醇至无醇味；

（2）大孔树脂吸附分离：澄清无醇味提取液上D-101型大孔树脂柱，上样样品，以原药材干重计算，与树脂量之比为1:2 W/V，先用2倍柱体积的水洗脱杂质，再用5倍柱体积浓度为30%的乙醇水溶液洗脱；

（3）工业色谱柱层析：大孔树脂30%乙醇水溶液洗脱部分，浓缩除醇，上聚酰胺200~400目动态轴向加压色谱柱，先用酸水除杂，依次用3倍柱体积20%乙醇洗脱，5倍柱体积50%乙醇洗脱，最后用3倍柱体积70%乙醇洗脱；

（4）70%乙醇洗脱液在温度60℃、真空度-0.1MPa的条件下真空浓缩，浓缩液冷冻干燥后得到纯度为91.7%的丹酚酸B；所得丹酚酸B的样品色谱图如图1所示。