CN109939659A - 一种高效疏水相互作用色谱介质、制备方法及其在提取丹酚酸b中的应用 - Google Patents
一种高效疏水相互作用色谱介质、制备方法及其在提取丹酚酸b中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种高效疏水相互作用色谱介质，其结构式如下：，其中，R为或者。同时，还公开了所述色谱介质的制备方法及其在提取丹酚酸B中的应用。本发明所提供的高效疏水相互作用色谱介质，不但能降低丹酚酸B的分离成本，减少了有机溶剂的使用，对环境无污染，而且还可以从丹参中获得高纯度的丹酚酸B，并且丹酚酸B的质量回收率高。
Description
技术领域
本发明属于高效液相色谱技术领域，具体涉及一种高效疏水相互作用色谱介质、制备方法及其在提取丹酚酸B中的应用。
背景技术
以酚酸类为主的丹酚酸B（Salvianolia acid B）是丹参水溶性成分中重要的活性物质。研究发现，丹酚酸B具有很强的生物活性，对脂质过氧化引起的细胞膜损伤有明显的保护作用，有抗血小板聚集和抗血栓的作用，同时对肾功能不全和肝损伤均有一定保护作用等[Chinese Journal of Natural Medicines（中国天然药物），13 (2015) 163-182；Chinese Journal of Integrative Medicine（中国结合医学杂志），18 (2012) 316-320.]。其中，色谱技术对分离丹酚酸B具有很大的优势，采用流动相为盐-水的洗脱体系，实现了对环境无污染的要求，且操作简单。
高效疏水相互作用色谱法（High Performance Hydrophobic InteractionChromatography，简称HPHIC）是依据其固定相具有适当疏水性基团的疏水作用，在高盐浓度下保留，低盐浓度洗脱的分离机制，易于保持被分离成分的活性，在固定相组成上采用了一些疏水性基团作为配基，如芳基胺、酸酐、PEG（聚乙二醇）等分子，这些配基与活化的硅胶基质表面键合成具有疏水性的固定相。但是，现有的高效疏水相互作用色谱介质疏水强弱不同，丹酚酸B的质量回收率比较低。为了进一步提高目标物的含量，我们对这类介质进行改进。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明提供一种高效疏水相互作用色谱介质、制备方法及其在提取丹酚酸B中的应用，提取的丹酚酸B纯度高，操作简单。
一种高效疏水相互作用色谱介质，结构式如下：
，
其中，R为
或者。
所述高效疏水相互作用色谱介质的制备方法，包括以下步骤：
（1）硅胶活化；
（2）制备环氧化硅胶：按照1g：50mL将步骤（1）得到的活化硅胶加入无水甲苯中，超声处理3-5min，然后在搅拌条件下向其中缓慢加入硅烷偶联剂γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷，所述活化硅胶和硅烷偶联剂的质量体积比为1g:1mL~1g:2 mL，升温至90-120 ℃，回流并搅拌8-10h，然后用甲醇、水、甲醇洗涤抽滤，重复洗涤抽滤5次，在60℃下真空干燥12h，即得到环氧硅胶；
（3）环氧开环制备高效疏水相互作用色谱介质：将苯乙胺或者3-苯基丙胺与步骤（2）得到的环氧化硅胶加入1，4-二氧六环中，超声处理3-5min，80℃回流并搅拌7~8h，然后用甲醇、水、甲醇洗涤抽滤，重复5次，真空干燥，即可；其中，苯乙胺或者3-苯基丙胺、环氧化硅胶、1，4-二氧六环的比例为0.3mL：1g：50mL。
优选地，步骤（1）所述硅胶活化的步骤具体如下：将孔径为90-100Å，粒径为5～10μm的硅胶微球加入体积浓度为20%的盐酸溶液中，在120℃下回流4-6h，冷却后，用蒸馏水洗涤抽滤至中性，在100~150℃真空干燥箱中干燥12~24h，即得到活化硅胶。
所述高效疏水相互作用色谱介质的应用，具体为：将所述高效疏水相互作用色谱介质应用于高效液相色谱来从丹参中提取丹酚酸B。
所述从丹参中提取丹酚酸B的方法具体如下：
（1）丹酚酸B粗提样品的制备：将丹参切片，加入纯水中，在45-55℃下浸泡12-18h，然后搅拌2h，静置，用纱布过滤后，再将得到的滤液离心，所得上清液即为丹酚酸B粗提样品；
（2）色谱柱装填：采用湿法匀浆装柱，称取1.5-2.0 g所述高效疏水相互作用色谱介质，以甲醇为匀浆液超声5 min后，在30-40 MPa下，装填色谱柱，30 min后卸下，连接到色谱仪上，在流速1-2 mL/min下用水冲洗三次，每次冲洗1 h；
（3）高纯度丹酚酸B的制备：丹酚酸B粗提样品直接进样至步骤（2）所得的色谱柱中，收集色谱馏分，色谱条件如下：采用流动相A为2-3 mol/L (NH4)2SO4、10 mmol/L KH2PO4、pH7.0；流动相B为10 mmol/L KH2PO4或H2O，pH7.0；流速为1.5-2.0 mL/min；采用0-100% 流动相B线性梯度洗脱30 min，100% 流动相B延长10 min；检测波长286 nm；进样量为100-1000μL；
（4）丹酚酸B成品制备与鉴定：将步骤（3）收集的色谱馏分冷冻干燥，得到丹酚酸B成品。
优选地，步骤（1）中所述丹参与纯水的比例为1g：120mL。
优选地，步骤（1）中所述离心的具体条件为：离心转速5000-10000 rpm、离心时间15min。
优选地，步骤（4）中所述冷冻干燥的条件为在-80℃中冷冻10-12h。
优选地，步骤（2）中，装填色谱柱时，所述色谱柱为100×4.6 mm i.d.的不锈钢色谱柱或者10 ×20 mm i.d的饼型色谱柱。
本发明的优点在于：本发明所提供的高效疏水相互作用色谱介质，与以往的介质相比较，不但能降低丹酚酸B的分离成本，减少了有机溶剂的使用，对环境无污染，而且还可以从丹参中获得高纯度的丹酚酸B，并且丹酚酸B的质量回收率高。
附图说明
图1 实施例4制备的活化硅胶、环氧硅胶、3-苯基丙胺键合硅胶的固体紫外图；
图2 在高效疏水相互作用模式下，实施例6-8分离提取丹酚酸B的色谱图；
图3 在高效疏水相互作用模式下，对丹酚酸B标准品和实施例8中丹参粗提液分离的色谱图。
具体实施方式
实施例1
1. 一种高效疏水相互作用色谱介质，结构式如下：
，
其中，R为
。
所述高效疏水相互作用色谱介质的制备方法，包括以下步骤：
（1）硅胶活化：将孔径为90-100Å，粒径为5～10 μm的硅胶微球加入体积浓度为20%的盐酸溶液中，在120℃下回流4h，冷却后，用蒸馏水洗涤抽滤至中性，在100℃真空干燥箱中干燥24h，即得到活化硅胶；
（2）制备环氧化硅胶：按照1g：50mL将步骤（1）得到的活化硅胶加入无水甲苯中，超声处理3min，然后在搅拌条件下向其中缓慢加入硅烷偶联剂γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷，所述活化硅胶和硅烷偶联剂的质量体积比为1g:1mL，升温至100℃，回流并搅拌10h，然后用甲醇、水、甲醇洗涤抽滤，重复5次，在60℃下真空干燥12h，即得到环氧硅胶；
（3）环氧开环制备高效疏水相互作用色谱介质：将苯乙胺与步骤（2）得到的环氧化硅胶加入1，4-二氧六环中，超声处理3min，80℃回流并搅拌8h，然后用甲醇、水、甲醇洗涤抽滤，重复5次，真空干燥，即可；其中，苯乙胺、环氧化硅胶、1，4-二氧六环的比例为0.3mL：1g：50mL。
实施例2
1. 一种高效疏水相互作用色谱介质，结构式如下：
，
其中，R为
。
所述高效疏水相互作用色谱介质的制备方法，包括以下步骤：
（1）硅胶活化：将孔径为90-100Å，粒径为5～10 μm的硅胶微球加入体积浓度为50%的盐酸溶液中，在120℃下回流4h，冷却后，用蒸馏水洗涤抽滤至中性，在150℃真空干燥箱中干燥12h，即得到活化硅胶；
（2）制备环氧化硅胶：按照1g：50mL将步骤（1）得到的活化硅胶加入无水甲苯中，超声处理5min，然后在搅拌条件下向其中缓慢加入硅烷偶联剂γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷，所述活化硅胶和硅烷偶联剂的质量体积比为1g:2 mL，升温至120 ℃，回流并搅拌9h，然后用甲醇、水、甲醇洗涤抽滤，重复5次，在60℃下真空干燥12h，即得到环氧硅胶；
（3）环氧开环制备高效疏水相互作用色谱介质：将苯乙胺与步骤（2）得到的环氧化硅胶加入1，4-二氧六环中，超声处理5min，80℃回流并搅拌8h，然后用甲醇、水、甲醇洗涤抽滤，重复5次，真空干燥，即可；其中，苯乙胺、环氧化硅胶、1，4-二氧六环的比例为0.3mL：1g：50mL。
实施例3
1. 一种高效疏水相互作用色谱介质，结构式如下：
，
其中，R为
。
所述高效疏水相互作用色谱介质的制备方法，包括以下步骤：
（1）硅胶活化：将孔径为90-100Å，粒径为5～10 μm的硅胶微球加入体积浓度为20%的盐酸溶液中，在120℃下回流3.5h，冷却后，用蒸馏水洗涤抽滤至中性，在120℃真空干燥箱中干燥18h，即得到活化硅胶；
（2）制备环氧化硅胶：按照1g：50mL将步骤（1）得到的活化硅胶加入无水甲苯中，超声处理4min，然后在搅拌条件下向其中缓慢加入硅烷偶联剂γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷，所述活化硅胶和硅烷偶联剂的质量体积比为1g:1 mL，升温至90℃，回流并搅拌8h，然后用甲醇、水、甲醇洗涤抽滤，重复5次，在60℃下真空干燥12 h，即得到环氧硅胶；
（3）环氧开环制备高效疏水相互作用色谱介质：将苯乙胺与步骤（2）得到的环氧化硅胶加入1，4-二氧六环中，超声处理4min，80℃回流并搅拌8h，然后用甲醇、水、甲醇洗涤抽滤，重复5次，真空干燥，即可；其中，苯乙胺、环氧化硅胶、1，4-二氧六环的比例为0.3mL：1g：50mL。
实施例4
1. 一种高效疏水相互作用色谱介质，结构式如下：
，
其中，R为
。
所述高效疏水相互作用色谱介质的制备方法，包括以下步骤：
（1）硅胶活化：将孔径为90-100Å，粒径为5～10 μm的硅胶微球加入体积浓度为20%的盐酸溶液中，在120℃下回流4h，冷却后，用蒸馏水洗涤抽滤至中性，在120℃真空干燥箱中干燥18h，即得到活化硅胶；
（2）制备环氧化硅胶：按照1g：50mL将步骤（1）得到的活化硅胶加入无水甲苯中，超声处理5min，然后在搅拌条件下向其中缓慢加入硅烷偶联剂γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷，所述活化硅胶和硅烷偶联剂的质量体积比为1g:2 mL，升温至90 ℃，回流并搅拌8h，然后用甲醇、水、甲醇洗涤抽滤，重复5次，在60℃下真空干燥12h，即得到环氧硅胶；
（3）环氧开环制备高效疏水相互作用色谱介质：将3-苯基丙胺与步骤（2）得到的环氧化硅胶加入1，4-二氧六环中，超声处理3-5min，80℃回流并搅拌7h，然后用甲醇、水、甲醇洗涤抽滤，重复5次，真空干燥，即可；其中，3-苯基丙胺、环氧化硅胶、1，4-二氧六环的比例为0.3mL：1g：50mL。
实施例5
将实施例1制备的色谱介质，做元素分析，结果见表1。
表1是实施例1制备的活化硅胶，环氧硅胶，苯乙胺硅胶的元素分析表
从表1中可以看出与未键合配基的环氧化基质相比，配基键合后其C、H、N元素的含量均得到了增加，其中N元素为新增加的元素（一般认为低于0.3%为误差，硅胶中测出有0.322%的N可能原因是由于硅胶吸附了空气中氮气所致）。由元素分析的结果可以计算出其配基密度为0.68 mmol/g(N)，0.70 mmol/g(C)。制备的物质结构与实施例1所述的结构式相对应；
对实施例2-3做相同的检测，其元素分析结果与实施例1基本相同，证明实施例2-3制备的物质结构与其所述的结构式相对应；
将实施例4制备的色谱介质，做固体紫外，结果见图1，图中横坐标为波长(Wavelength)，纵坐标为吸收值（Absorbance）。由图1中可以看出，活化硅胶（1）及环氧化硅胶（2）在波长210 nm和260 nm附近紫外吸收较弱；而与3-苯基丙胺反应后，3-苯基丙胺键合硅胶（3）在210 nm和260 nm左右产生较强紫外吸收。因此，结果证明，3-苯丙胺配基已经成功键合于硅胶基质上。制备的物质结构与实施例4所述的结构式相对应。
实施例6
将实施例3提供的高效疏水相互作用色谱介质用于高效液相色谱从丹参中提取丹酚酸B，具体如下：
（1）丹酚酸B粗提样品的制备：将丹参切片，加入纯水中，所述丹参与纯水的比例为1g：120 mL，在50℃下浸泡12h，然后搅拌2h，静置，用纱布过滤后，再将得到的滤液在转速10000rpm下离心15min，所得上清液即为丹酚酸B粗提样品；
（2）色谱柱装填：采用湿法匀浆装柱，称取所述高效疏水相互作用色谱介质1.5 g，以甲醇为匀浆液超声5 min后，在30-40 Mpa下，装填规格为100×4.6 mm i.d.不锈钢色谱柱，30min后卸下，连接到色谱仪上，在流速1-2 mL/min下用三次蒸馏水冲洗1 h；
（3）高纯度丹酚酸B的制备：丹酚酸B粗提样品直接进样至步骤（2）得到的色谱柱中，收集色谱馏分；色谱条件如下：采用流动相A为3 mol/L (NH4)2SO4、10 mmol/L KH2PO4、pH 7.0；流动相B为10 mmol/L H2O，pH7.0；流速为2.0 mL/min；采用0-100% 流动相B线性梯度洗脱30 min，100% 流动相B延长10 min；检测波长286 nm；进样量为100μL；从丹参粗提样品中分离的丹酚酸B色谱图见图2中曲线1，图2中，横坐标为保留时间（time），纵坐标为波长286nm处的紫外吸收值（mAU）；
（4）丹酚酸B成品制备：将步骤（3）收集的色谱馏分在-80℃中冷冻干燥10h，得到丹酚酸B成品。
实施例7
将实施例4提供的高效疏水相互作用色谱介质用于高效液相色谱从丹参中提取丹酚酸B，具体如下：
（1）丹酚酸B粗提样品的制备：将丹参切片，加入纯水中，所述丹参与纯水的比例为1g：120 mL，在45℃下浸泡14h，然后搅拌2h，静置，用纱布过滤后，再将得到的滤液在转速5000rpm下离心15min，所得上清液即为丹酚酸B粗提样品；
（2）色谱柱装填：采用湿法匀浆装柱，称取所述高效疏水相互作用色谱介质1.5 g，以甲醇为匀浆液超声5 min后，在30-40 Mpa下，装填规格为100×4.6 mm i.d.不锈钢色谱柱，30min后卸下，连接到色谱仪上，在流速1-2 mL/min下用三次蒸馏水冲洗1 h；
（3）高纯度丹酚酸B的制备：丹酚酸B粗提样品直接进样至步骤（2）得到的色谱柱中，收集色谱馏分；色谱条件如下：采用流动相A为2 mol/L (NH4)2SO4、10 mmol/L KH2PO4、pH 7.0；流动相B为10 mmol/L KH2PO4，pH7.0；流速为1.5 mL/min；采用0-100% 流动相B线性梯度洗脱30 min，100% 流动相B延长10 min；检测波长286 nm；进样量为100μL；从丹参粗提样品中分离的丹酚酸B色谱图见图2中曲线2；
（4）丹酚酸B成品制备：将步骤（3）收集的色谱馏分在-80℃中冷冻干燥12h，得到丹酚酸B成品。
实施例8
将实施例4提供的高效疏水相互作用色谱介质用于高效液相色谱从丹参中提取丹酚酸B，具体如下：
（1）丹酚酸B粗提样品的制备：将丹参切片，加入纯水中，所述丹参与纯水的比例为1g：120mL，在45℃下浸泡18h，然后搅拌2h，静置，用纱布过滤后，再将得到的滤液在转速5000rpm下离心15min，所得上清液即为丹酚酸B粗提样品；
（2）色谱柱装填：采用湿法匀浆装柱，称取所述高效疏水相互作用色谱介质2.0 g，以甲醇为匀浆液超声5 min后，在30-40 Mpa下，装填规格为10×20 mm i.d.饼型色谱柱，30 min后卸下，连接到色谱仪上，在流速1-2 mL/min下用三次蒸馏水冲洗1 h；
（3）高纯度丹酚酸B的制备：丹酚酸B粗提样品直接进样至步骤（2）得到的色谱柱中，收集色谱馏分；色谱条件如下：采用流动相A为2 mol/L (NH4)2SO4、10 mmol/L KH2PO4、pH 7.0；流动相B为10 mmol/L KH2PO4或H2O，pH7.0；流速为1.5 mL/min；采用0-100% 流动相B线性梯度洗脱30 min，100% 流动相B延长10 min；检测波长286 nm；进样量为1000μL；从丹参粗提样品中分离的丹酚酸B色谱图见图2中曲线3；
（4）丹酚酸B成品制备：将步骤（3）收集的色谱馏分在-80℃中冷冻干燥12h，得到丹酚酸B成品。
一. 丹酚酸B成品的鉴定
1. 实施例8提取的丹酚酸B的鉴定
在实施例8丹参粗提液中丹酚酸B的色谱条件下，将酚酸B标准品直接进样到进样到实施例8步骤（2）得到的色谱柱中，色谱条件如下（同实施例8）：采用流动相A为3 mol/L (NH4)2SO4、10 mmol/L KH2PO4、pH 7.0；流动相B为10 mmol/L KH2PO4，pH7.0；流速为1.5 mL/min；采用0-100% 流动相B线性梯度洗脱30 min，100% 流动相B延长10 min；检测波长286 nm；进样量为100μL；结果见图3，图中横坐标为保留时间（time），纵坐标为波长286nm处的紫外吸收值（mAU）；1-丹酚酸B标准品；2-为实施例8提取的丹酚酸B；
由图3可知，实施例8提取的丹酚酸B与丹酚酸B标准品的保留时间一致，证实实施例8确实可以提取得到丹酚酸B；
采用外标法以丹酚酸B标准品制作标准曲线得到回归方程，计算得到实施例8提取得到的丹酚酸B成品的纯度为98%，质量回收率为94%；
2. 实施例6、7提取的丹酚酸B的鉴定
分别在实施例6、7丹参粗提液中丹酚酸B的色谱条件下，将酚酸B标准品直接分别进样到进样到实施例6、7步骤（2）得到的色谱柱中，色谱条件分别同实施例6、7，结果显示，实施例6、7提取的丹酚酸B分别与相应色谱条件下的丹酚酸B标准品的保留时间一致，证实实施例6、7确实可以提取得到丹酚酸B；
采用外标法以丹酚酸B标准品制作标准曲线得到回归方程，计算得到实施例6提取得到的丹酚酸B成品的纯度为98.6%，质量回收率为95.1%；实施例7提取得到的丹酚酸B成品的纯度为98.4%，质量回收率为94.8%。
Claims (9)
1.一种高效疏水相互作用色谱介质，其特征在于：所述高效疏水相互作用色谱介质的结构式如下：
，
其中，R为
或者。
2.权利要求1所述高效疏水相互作用色谱介质的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）硅胶活化；
（2）制备环氧化硅胶：按照1g：50mL将步骤（1）得到的活化硅胶加入无水甲苯中，超声处理3-5min，然后在搅拌条件下向其中缓慢加入硅烷偶联剂γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷，所述活化硅胶和硅烷偶联剂的质量体积比为1g:1mL~1g:2 mL，升温至90-120 ℃，回流并搅拌8-10h，然后用甲醇、水、甲醇洗涤抽滤，重复洗涤抽滤5次，在60℃下真空干燥12h，即得到环氧硅胶；
（3）环氧开环制备高效疏水相互作用色谱介质：将苯乙胺或者3-苯基丙胺与步骤（2）得到的环氧化硅胶加入1，4-二氧六环中，超声处理3-5min，80℃回流并搅拌7~8h，然后用甲醇、水、甲醇洗涤抽滤，重复5次，真空干燥，即可；其中，苯乙胺或者3-苯基丙胺、环氧化硅胶、1，4-二氧六环的比例为0.3mL：1g：50mL。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述硅胶活化的步骤具体如下：将孔径为90-100Å，粒径为5～10 μm的硅胶微球加入体积浓度为20%的盐酸溶液中，在120℃下回流4-6h，冷却后，用蒸馏水洗涤抽滤至中性，在100~150℃真空干燥箱中干燥12~24h，即得到活化硅胶。
4.权利要求1所述高效疏水相互作用色谱介质的应用，其特征在于：所述应用为将所述高效疏水相互作用色谱介质应用于高效液相色谱来从丹参中提取丹酚酸B。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于：所述从丹参中提取丹酚酸B的方法具体如下：
（1）丹酚酸B粗提样品的制备：将丹参切片，加入纯水中，在45-55℃下浸泡12-18h，然后搅拌2h，静置，用纱布过滤后，再将得到的滤液离心，所得上清液即为丹酚酸B粗提样品；
（2）色谱柱装填：采用湿法匀浆装柱，称取1.5-2.0 g所述高效疏水相互作用色谱介质，以甲醇为匀浆液超声5 min后，在30-40 MPa下，装填色谱柱，30 min后卸下，连接到色谱仪上，在流速1-2 mL/min下用水冲洗三次，每次冲洗1 h；
（3）高纯度丹酚酸B的制备：丹酚酸B粗提样品直接进样至步骤（2）所得的色谱柱中，收集色谱馏分，色谱条件如下：采用流动相A为2-3 mol/L (NH4)2SO4、10 mmol/L KH2PO4、pH7.0；流动相B为10 mmol/L KH2PO4或H2O，pH7.0；流速为1.5-2.0 mL/min；采用0-100% 流动相B线性梯度洗脱30 min，100% 流动相B延长10 min；检测波长286 nm；进样量为100-1000μ L；
（4）丹酚酸B成品制备与鉴定：将步骤（3）收集的色谱馏分冷冻干燥，得到丹酚酸B成品。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于：步骤（1）中所述丹参与纯水的比例为1g：120mL。
7.根据权利要求5所述应用，其特征在于：步骤（1）中所述离心的具体条件为：离心转速5000-10000 rpm、离心时间15min。
8.根据权利要求5所述应用，其特征在于：步骤（4）中所述冷冻干燥的条件为在-80℃中冷冻10-12h。
9.根据权利要求5所述应用，其特征在于：步骤（2）中，所述色谱柱为100×4.6 mm i.d.的不锈钢色谱柱或者10 ×20 mm i.d的饼型色谱柱。
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-
2019
- 2019-04-22 CN CN201910322499.0A patent/CN109939659A/zh active Pending
Patent Citations (6)
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