CN103242402B - 一种快速制备高纯度的n6-(2-羟乙基)腺苷的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种从生物体内提取N⁶-(2-羟乙基)腺苷的方法，该方法包括：1）、对菌丝体进行干燥，粉碎获得菌丝体粉末；2）、对粉末进行热回流提取，条件如下：以10%-80%的乙醇作溶剂，40-120℃的温度下提取0.5-5小时获得乙醇提取溶液。3）、经过膜分离，大孔树脂柱纯化，低温甲醇结晶获得高纯度N⁶-(2-羟乙基)腺苷。该技术生产成本低，污染小，得率高，可以成为工业上生产N⁶-(2-羟乙基)腺苷产品的一种新技术。

Description

一种快速制备高纯度的N6-(2-羟乙基)腺苷的方法

技术领域

本发明属于生物农药领域，特别的,本发明涉及一种可以从菌丝中快速提取N⁶-（2-羟乙基）腺苷的方法。

背景

N⁶-（2-羟乙基）腺苷是一种腺苷衍生物，是虫草的特有成分，已成为虫草制品的质量控制指标之一（徐红娟，莫志宏，余佳文，朱华李，毛先兵.蝉花生物活性物质研究进展[J].药学专论，2009,18（4）：19-21）。具有很强的抗紫外辐射、抗血小板凝结（Furuya T,Hirotani M.Matsuzawa M.N6-(2-hydroxyethyl)adenosine,a biologically active compound from cultured mycelia of Cordyceps and Isaria Species[J].Phytochemistry,1993,22(11):2509-2512.180）和镇痛等效用（柴一秋，韦忠民，陈祝安，厉晓腊等.N6-（2-羟乙基）腺苷在制备镇痛药物中的应用[P].中国，ZL200410094511.0.2006-11-8.），潜在医药保健开发潜力的微生物来源的资源（梁宗琦,2007.中国真菌志[M].北京：科学出版社，2007.），但其在抑制肿瘤生长方面的作用报道很少。本发明利用热回流提取，膜分离，大孔树脂分离，结晶技术联用等方法，从蝉拟青霉人工培养物中分离纯化得到高纯度的N⁶-（2-羟乙基）腺苷。

在中国发明专利2004100094511.0中揭示了提取N⁶-(2-羟乙基)腺苷的方法，但是该方法繁琐，利用设备昂贵，条件比较苛刻，不利于大规模化工程生产。在中国专利申请201010566708.5中也披露了一种从蛹虫草的菌丝体中提取N⁶-(2-羟乙基)腺苷的方法，虽然该方法步骤较少，但是必须要经过树脂和液相色谱仪分离纯化，所需要设备仍然昂贵，操作方法复杂，需要专业的人员才能进行，也不能实现大规模的常规生产。这就需要提供一种更简单的方法从生物体内提取N⁶-(2-羟乙基)腺苷活性物质。本发明采用热回流提取，膜分离，大孔树脂分离，结晶技术联用，可以快速高效分离纯化N⁶-(2-羟乙基)腺苷，此法所得的N⁶-(2-羟乙基)腺苷颜色白、纯度高，可达到95%以上，且该方法生产投资和运行成本低，生产的安全性高和可操作性强，适于工业化生产。

发明内容

本研究采用热回流提取，膜分离-大孔树脂联用技术大量得到高纯度的N⁶-(2-羟乙基)腺苷单品，从而为该活性物质在医学或农业上的应用提供必要的前体。

一方面，本发明提供一种从生物体内提取N⁶-(2-羟乙基)腺苷的方法，其特征在于，该 方法包括：1）、将蝉拟青霉子实体、液体培养的菌丝体或带培养基的固体培养菌丝体50-70℃烘干，粉碎过40-100目筛；2）、对粉末进行热回流提取，条件如下：以10%-80%的乙醇作溶剂，40-100℃的温度下提取0.5-5小时获得乙醇提取溶液。

在一些优选的方式中，热回流提取步骤中，溶剂与菌丝体的比例为5-10ml/g。优选的，溶剂与菌丝体的比例为10ml/g。在另一些优选的方式中，作为溶剂的乙醇的浓度为10%-80%；优选的为20-70%；更优选的为30%-70%。最优选的，浓度为50-70%。在另一些实施方式中，回流提取的温度为40-100℃，优选的，温度为50-100℃，较优选的，温度为60-100℃，更优选的，温度为70-90℃，最优选的，温度为80℃。在另一些优选的方式中，提取的时间为1-3小时，优选的为1-2小时，也可是30分钟或1.5小时。一般，回流提取的循环次数为1-5次，在合适的条件下，回流提取的次数为2-3次，也可是2次或更多次。除了乙醇可以作为本发明的提取溶剂外，我们发现甲醇、水等也有较好的得率。

在另一些优选的方式中，对回流提取获得醇溶液进行膜分离纯化。通过膜的分离纯化可以除去提取溶液中的一些杂质，例如蛋白、一些多糖。优选的，先让醇提取液体通过截留分子量为10000的超滤膜，然后再通过截留分子量为3000的膜进行超滤，最后还可以通过用截留分子量为150的纳滤膜浓缩获得浓缩溶液。在另外一些优选的方式中，还可以让以上膜在压力下进行浓缩和纯化，例如在膜上施加0.2-3Mpa的压力进行分离纯化，还可以是1-2Mpa的压力。优选的，对截留分子量为10000和3000的超滤膜施加的压力都为1Mpa；对截留分子量为150纳滤膜的操作压力为2Mpa。

在另外一些优选的方式中，经过膜过滤获得的溶液可以通过大孔树脂进行进一步的浓缩和纯化，大孔树脂可以是型号为AB-8、D101、DM130、DM2、DA201、HN60、HB60或HPD100，优选的AB-8。经过膜浓缩的溶液上大孔树脂纯化，先以水、5%的乙醇溶液洗脱除去杂质，然后以30%的乙醇溶液洗脱，分段收集洗脱液，合并N⁶-(2-羟乙基)腺苷高含量洗脱液。在优选的方式中，对经过大孔树脂纯化获得洗脱液进行低温甲醇结晶。

本发明的N⁶-(2-羟乙基)腺苷可以从生物体中提取，一般生物体包括菌丝体或子实体，这种菌丝体可以是蝉拟青霉固体培养的培养基中获得，也可以从蝉拟青霉液体培养的菌丝体中获得；子实体可以从蝉拟青霉固体培养所长出的子实体中获得。。这些菌丝体或子实体可以来源于人工通过培养基生产而来，也可以取自天然的虫草里的菌丝作为原料。在一些优选的方式中，菌丝体或子实体经过干燥然后粉碎获得粉末。

有益效果

采用热回流提取，膜分离-大孔树脂联用技术得到的N⁶-(2-羟乙基)腺苷不仅颜色淡、纯度高，可达到95%以上；且该技术生产成本低，污染小，可以成为工业上生产N⁶-(2-羟乙基)腺苷产品的一种新技术。

附图说明

图1是本发明一个具体实施例子中N⁶-(2-羟乙基)腺苷检测标准曲线图；

图2是本发明一个具体实施例子中不同的膜孔径在120min内膜通量的变化图；

图3是本发明一个具体实施例子中不同的膜孔径对N⁶-(2-羟乙基)腺苷转移率及除杂率的影响；

图4为AB-8型本发明一个具体实施例子中大孔树脂对N⁶-(2-羟乙基)腺苷的动态吸附容量图。

具体实施方式

以下列举有限的实施例子来说明书本发明是如何实施的，这些说明并不是对本发明的权利要求的限制。

实施例1热回流法从蝉拟青霉中提取N ⁶ -(2-羟乙基)腺苷的工艺

1.材料

带培养基的蝉拟青霉固体培养菌丝体，在60℃下烘干，粉碎过80目筛。N⁶-(2-羟乙基)腺苷标准品（从中科院大连化学物理研究所药物购买）。所有的药品均为市售，除HPLC流动相使用的药品为色谱纯外，其他的药品均为分析纯。

2．热回流提取方法参数的筛选

本试验采用热回流法从带培养基的蝉拟青霉固体培养菌丝体中提取N⁶-(2-羟乙基)腺苷。具体方法为：取干燥粉碎后的菌丝体，用乙醇和水的混合溶液作溶剂，进行2次的热回流提取。我们采用多因素进行试验，我们发现，溶剂中乙醇的浓度（A，%）、料液比（B，ml/g）、提取时间（C,h）、提取温度（D，℃）是影响提取率的重要几个因素。因此，我们设计了一个四因素三水平的正交试验来确定最佳的提取工艺参数。该试验按照L₉（3⁴）正交表进行试验设计，因素水平见表1，试验共作9个处理，每个处理4个重复（表1）。

表1正交试验因素水平表

3.提取液体中N6-(2-羟乙基)腺苷含量的测定

3.1HPLC检测

标准曲线制备。将N⁶-(2-羟乙基)腺苷标准品分别配成25、50、75、100和125μg/ml浓度样液。根据色谱条件（C₁₈色谱柱，4.6mm×150mm，5μm；流动相为甲醇：0.01mol/L磷酸二氢钾溶液＝15：85；流速1.0ml；检测波长260nm；温度25℃；进样量,20μl）进行HPLC检测，并制作标准曲线，见图1。

3.2N⁶-(2-羟乙基)腺苷检测标准曲线的制定

按照上文的色谱条件检测，N⁶-(2-羟乙基)腺苷色谱峰型对称，保留时间充分。获得回归方程为Y=51.668X-104.7，r=0.9993。标准曲线见图1，显示N⁶-(2-羟乙基)腺苷在20-125μg范围内，峰面积与进样量呈现良好的线性关系。

利用以上标准曲线和常规液相色谱方法测得每次不同处理获得的提取液中N⁶-(2-羟乙基)腺苷的含量，从而计算得率。

提取率（%）=提取液中N⁶-(2-羟乙基)腺苷的总质量/菌丝体原料中N⁶-(2-羟乙基)腺苷的总质量×100

结果

通过提取正交试验结果表明：溶剂中乙醇的浓度（A，%）、料液比（B，ml/g）、提取时间（C,h）、提取温度（D，℃）这4个因素都对提取率有显著影响。

考虑到各试验水平对提取率的影响，以及提取的成本消耗，可以确定热回流提取的最佳的提取条件为：A2、B3、C2、D2，即：以50%的乙醇作溶剂，溶剂/菌丝体为10ml/g，80℃，提取2次。

通过对各个因素进行常规的极差分析，从分析结果（表3）可以明显看出，因素D的极差最大，说明在该试验中温度是影响提取率的最主要因素，其次是因素A（即乙醇浓度），然后再是料液比和提取时间。

在这里需要说明的是，其他条件也是可行的，因为现有传统技术中还没有人提出采用热回流的方式从菌丝体中提取N⁶-(2-羟乙基)腺苷物质，同时获得了比较高的得率，不同因素影响下，得率从58%-92%不等。本发明小组首次采用该方法获得比较高的产率，取得了意料之外的效果。所里，一般在回流技术中，温度可以为35-120℃，还可以使50-100℃，最佳的为60-100℃，也可以是70-90℃。另外，乙醇等醇类物质的浓度可以是10-80%，还可以是15-70%，也可以使30-70%，最佳的为50-70%，例如为50%，60%，70%，80%等等。当然料液比和提取时间也可以不同。

表2正交试验结果分析表

表3：各因素的极差分析对比表

实施例2膜纯化N ⁶ -(2-羟乙基)腺苷的工艺研究

1.材料与方法 

高效液相色谱HPLC（Agilent1200）；RNM-1812G膜分离实验设备（杭州瑞纳膜工程有限公司）；截留分子量为10000,3000,1000,150的四种纳米级有机卷式膜（美国通用GE）；大孔树脂AB-8、D101、DM130、DM2、DA201、HN60、HB60、HPD100（沧州宝恩吸附材料科技有限 公司）；N⁶-(2-羟乙基)腺苷对照品（中科院大连化学物理研究所药物）；甲醇、乙醇等均为化学纯（安徽安特生物化学有限公司）。

步骤1.N⁶-(2-羟乙基)腺苷的提取

按实施例1中提取N⁶-(2-羟乙基)腺苷的最佳条件进行提取，工艺如下：以烘干后的带培养基的蝉拟青霉固体培养菌丝体为原料，粉碎过80目筛，以50%的乙醇为溶剂提取N⁶-(2-羟乙基)腺苷，料液体积比为1：10，提取2次，每次提取2h，提取温度为80℃，合并2次醇提取液备用。

步骤2.膜纯化N⁶-(2-羟乙基)腺苷的工艺研究

经实验研究，传统的采用醇沉法去除多糖会损失相当部分的N⁶-(2-羟乙基)腺苷，大大降低其最终的得率。经工艺革新，现采用膜分离技术去除提取液中的多糖及一些大分子物质，达到浓缩纯化的目的。

取步骤1中的N⁶-(2-羟乙基)腺苷的提取溶液进行全回流方式循环运行。因已知N⁶-(2-羟乙基)腺苷的分子量为311，故先采用膜截留分子量＜10000道尔顿的超滤膜去除大部分蛋白质、色素和多糖等大分子物质，然后比较膜截留分子量＜5000道尔顿和＜3000道尔顿的超滤膜膜截留效率，最后用截留分子量＜150的纳滤膜过滤浓缩。同时进行料液质量分数与进出口压力差优化程序。

实验中，以膜通量、N⁶-(2-羟乙基)腺苷转移率与除杂率为主要指标进行优化选择。其中N⁶-(2-羟乙基)腺苷转移率及除杂率公式如下:

转移率=膜滤液总N⁶-(2-羟乙基)腺苷质量/原料液总N⁶-(2-羟乙基)腺苷质量×100%；

除杂率=(原料液总固体质量－过滤液总固体质量)/原料液总固体质量×100%。

结果

膜孔径的选择 

实验选取截留分子量为10000、5000、3000和150的有机卷式膜，取N⁶-(2-羟乙基)腺苷的提取溶液进行全回流方式循环运行，考察膜通量随时间的变化关系，每20min测定一次膜通量，至膜通量基本不变为止，结果如图2和图3所示。图2是所选的不同的膜孔径在120min内膜通量的变化，从图中可以看出随着膜过滤时间的延长膜通量都会有所下降。图3是所选的不同的膜孔径对N⁶-(2-羟乙基)腺苷转移率及除杂率的影响，从图中可以看出超滤膜中，截留分子量为3000的膜比5000的膜在N⁶-(2-羟乙基)腺苷转移率和除杂率两个指标都相 对较高，截留分子量为150的纳滤膜的N⁶-(2-羟乙基)腺苷转移率和除杂率最高。

故选择采用膜截留分子量为10000的超滤膜先去除大部分蛋白质、色素和多糖等大分子物质，然后用截留分子量为3000的膜进行超滤，最后用截留分子量为150的膜进行纳滤纯化。

操作压力的选择

膜过滤过程是由压力推动进行的，操作压差将直接影响有机卷式膜的通量，有机卷式膜过滤过程中存在一临界压力，当操作压力小于临界压力时，操作压力与膜通量呈正比例关系，而大于临界压力时，由于浓差极化的影响，操作压力与膜通量不再存在线性关系，这时操作压力对膜通量的影响不大。采用不同操作压力分别对10000、3000的超滤膜和150的纳滤膜膜通量的变化进行研究。结果表明，操作压力在1MPa时10000和3000超滤膜的膜通量最大，压力增大，膜通量反而降低。操作压力在2MPa时150纳滤膜的膜通量最大，压力增大，膜通量反而降低。故实验操作时选择10000和3000超滤膜的操作压力为1Mpa，150纳滤膜的操作压力为2Mpa。

实施例3大孔树脂纯化N ⁶ -(2-羟乙基)腺苷的工艺研究

将经过纳滤膜浓缩纯化的N⁶-(2-羟乙基)腺苷溶液，采用不同类型的大孔树脂进行静态吸附容量试验和静态吸附－洗脱性能试验，选取最佳大孔树脂类型后，考察大孔树脂对N⁶-(2-羟乙基)腺苷的动态吸附容量，然后对洗脱溶媒浓度和体积进行优化选择。实验中以N⁶-(2-羟乙基)腺苷的收率、纯度为考察指标进行工艺优化。

静态吸附容量试验:

精密量取已处理好的大孔树脂AB-8、D101、DM130、DM2、DA201、HN60、HB60、HPD100各20g，置于250mL三角瓶中，加入经纳滤膜过滤后的N⁶-(2-羟乙基)腺苷溶液100mL，每隔5min振摇10s，持续4h，使其达到饱和吸附，吸取上层液测定N⁶-(2-羟乙基)腺苷的浓度。

静态吸附量=(初始质量浓度－吸附后质量浓度)×吸附液体积/树脂体积。 

静态吸附－洗脱性能试验:

取其中吸附量较高的AB-8、DM130、DA201并达到静态饱和吸附的树脂，滤过，水洗净，吸干表面水分，精密加入50%乙醇100mL，每隔5min振摇10s，持续2h，测定洗脱液中N⁶-(2-羟乙基)腺苷的浓度，并测定其N⁶-(2-羟乙基)腺苷的纯度。

洗脱率=(洗脱液质量浓度×洗脱液体积)/(饱和吸附量×树脂体积)×100%。

结果

不同大孔树脂的静态吸附容量和静态吸附-洗脱性能

考察不同类型大孔树脂对N⁶-(2-羟乙基)腺苷的静态吸附容量和解吸附的性能，结果见表4和表5。由表4可以看出，AB-8和DM130均有较大的吸附容量，由表5可以看出，在解吸附试验中，AB-8树脂的解吸量和洗脱液中N⁶-(2-羟乙基)腺苷的纯度均高于DM130树脂，故确定使用AB-8树脂分离纯化N⁶-(2-羟乙基)腺苷。

表4不同树脂对N⁶-(2-羟乙基)腺苷的静态吸附容量试验

表5不同树脂对N⁶-(2-羟乙基)腺苷的静态吸附-洗脱性能试验

AB-8型大孔树脂对N⁶-(2-羟乙基)腺苷的动态吸附容量

取已预处理的AB-8型大孔树脂100mL(树脂干质量73g)，湿法装柱，N⁶-(2-羟乙基)腺苷溶液以1mL/min的速度上柱，收集过柱流出液，每5mL收集一份，结果确定0～40mL药液为基本吸附区域，相当于最大上样量每克干树脂N⁶-(2-羟乙基)腺苷1.42mg。动态吸附曲线见图4。

洗脱溶媒的考察

取已充分吸附N⁶-(2-羟乙基)腺苷的AB-8树脂100mL装柱，分别以蒸馏水及10%、30%、50%、70%、95%乙醇各400mL恒速洗脱，每个浓度收集为1个流分，分别测定各洗脱液流分中N⁶-(2-羟乙基)腺苷质量，结果见表6。结果表明，30%乙醇可将95%以上的N⁶-(2-羟乙基)腺苷洗脱下来。

表6大孔树脂洗脱溶剂的选择

大孔吸附树脂洗脱体积的确定

取100mL饱和吸附N⁶-(2-羟乙基)腺苷的大孔树脂装柱，均以水洗至无色，再以50%乙醇洗脱，洗脱液每100mL(一个树脂体积)为1个收集单位，至流出液无N⁶-(2-羟乙基)腺苷反应。分别测定每份洗脱液中N⁶-(2-羟乙基)腺苷含量，结果见表7。结果表明，3倍柱体积可洗脱95%以上吸附的N⁶-(2-羟乙基)腺苷。

表7大孔吸附树脂洗脱体积的确定

分段收集，HPLC检测，合并浓缩

将30%乙醇洗脱液以1个树脂体积为1个收集单位进行收集，分别用HPLC检测其中N⁶-(2-羟乙基)腺苷的含量，并将N⁶-(2-羟乙基)腺苷含量高的洗脱液合并，减压浓缩至膏状。

实施例4结晶

把得到的膏状物质进一步干燥至棕黄色固体。再将棕黄色固体在20℃下甲醇溶解，4℃ 下甲醇结晶，得到白色针状晶体。抽滤得晶体，置于冷冻干燥机中冻干，用TCL对晶体成分进行定性分析，HPLC测定其中N⁶-(2-羟乙基)腺苷的纯度在95%以上。

本发明采用热回流提取，膜分离，大孔树脂分离，结晶技术联用，可以快速高效分离纯化N⁶-(2-羟乙基)腺苷，此法所得的N⁶-(2-羟乙基)腺苷颜色白、纯度高，可达到95%以上，且该方法生产投资和运行成本低，生产的安全性高和可操作性强，适于工业化生产。

Claims (5)

1.一种提取N⁶-(2-羟乙基)腺苷的方法，其特征在于，该方法包括：

1)、对菌丝体进行干燥，粉碎获得菌丝体粉末；

2)、对粉末进行热回流提取，条件如下：以50％-70％的乙醇作溶剂，80-100摄氏度的温度下提取1-3小时获得乙醇提取溶液；

其中，该方法还包括对所述的醇提取溶液进行膜分析纯化，其中，先将醇提液先通过截留分子量为10000的超滤膜拦截，后用截留分子量为3000的膜进行超滤，最后用截留分子量为150的纳滤膜浓缩获得浓缩溶液；

其中，对所述的经过膜浓缩的溶液上大孔树脂纯化，先以水、5％的乙醇溶液洗脱除去杂质，然后以30％的乙醇溶液洗脱，分段收集洗脱液，合并N⁶-(2-羟乙基)腺苷高含量洗脱液；

其中，对经过大孔树脂纯化获得洗脱液进行低温甲醇结晶；

其中，大孔树脂的型号为AB-8。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的步骤2)中的热回流提取方法中，溶剂与菌丝体的比例为5-10ml/g。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，对纯化的膜施加压力，其中，对截留分子量为10000和3000的超滤膜施加的压力都为1Mpa；对截留分子量为150纳滤膜的操作压力为2Mpa。

4.根据权利要求1-3之一所述的方法，其中，作为溶剂的乙醇的浓度为50％，提取的温度为80摄氏度。

5.根据权利要求2所述的方法，其中，溶剂与菌丝体的比例为10ml/g,同时进行连续循环提取1-3次。