CN108864217B

CN108864217B - 一种石榴皮安石榴苷的纯化方法

Info

Publication number: CN108864217B
Application number: CN201810871327.4A
Authority: CN
Inventors: 马桂芝; 高晓黎; 邱慧敏
Original assignee: Xinjiang Medical University
Current assignee: Xinjiang Medical University
Priority date: 2018-08-02
Filing date: 2018-08-02
Publication date: 2021-03-30
Anticipated expiration: 2038-08-02
Also published as: CN108864217A

Abstract

本发明提供了一种石榴皮安石榴苷的纯化方法，采用大孔吸附树脂进行纯化，得到的石榴皮安石榴苷中的安石榴苷含量可达85～95％，且工艺的稳定性好，为安石榴苷抗肿瘤作用的进一步研究奠定试验基础；本发明将大孔吸附树脂柱的柱体积放大23倍，通过放大试验确定了纯化工艺，所得的安石榴苷含量和出膏率，与实验室小试的结果基本一致，表明本发明的纯化工艺稳定可行，可进一步进行中试研究，为后续安石榴苷的进一步开发利用奠定试验基础。

Description

一种石榴皮安石榴苷的纯化方法

技术领域

本发明涉及多酚物质分离纯化技术领域，尤其涉及一种石榴皮安石榴苷的纯化方法。

背景技术

石榴在药理研究方面，多以石榴提取物和石榴汁等混合物作为研究对象，针对纯度较高的单一活性成分的研究较少。随着近年来对安石榴苷生理活性的深入研究，市场对安石榴苷的需求也逐渐增大，但安石榴苷的制备、分离纯化工艺仍是以多次柱色谱反复分离获得，需要消耗大量溶剂，同时又耗时、耗力。

大孔吸附树脂(macroporous adsorption resins)是20世纪70年代末发展起来的一类有较好吸附性能的有机高聚物吸附剂，是一种不溶于酸、碱及各种有机溶剂的有机高分子聚合物。大孔吸附树脂主要是利用其吸附性和分子筛相结合的原理，有选择地吸附目标物质，去除杂质。目前大孔吸附树脂主要被用于植物活性成分，如皂苷类、黄酮类、生物碱类、酚酸、多糖、蒽醌等成分的分离纯化。相对于纯化工艺繁琐、费时费力、浪费溶剂的其他柱色谱法来说，大孔吸附树脂具有较多优点，例如其物理化学稳定性高、吸附容量大、选择性好、不溶于酸碱以及各种有机溶剂、吸附速度快、解吸条件温和、再生处理方便、使用周期长、成本低及适用于大规模生产等优点，使它在天然药物有效成分分离纯化方面的应用前景广阔，并显示出其独特的效果。

然而，现有技术中在使用大孔吸附树脂进行石榴皮中安石榴苷分离纯化时，多采用反复柱色谱及高效毛细管电泳相结合的技术，纯化工艺复杂，成本高，耗时长，纯化产物的产量低，不适合进行工业化生产。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新疆石榴皮中安石榴苷的纯化方法，从而简化纯化工艺、提高纯化产物的产量，易于工业化生产。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种石榴皮安石榴苷的纯化方法，包括以下步骤：

将石榴皮安石榴苷粗提液上样于大孔吸附树脂柱，然后进行静态吸附，得到吸附有石榴皮安石榴苷粗提物的大孔吸附树脂柱；

对所述吸附有石榴皮安石榴苷粗提物的大孔吸附树脂柱依次进行除杂和洗脱，得到石榴皮安石榴苷纯化物。

优选的，所述石榴皮安石榴苷粗提液的质量浓度为10.0～21.0mg/mL，pH值为1.5～4.5。

优选的，所述大孔吸附树脂柱中填充的大孔吸附树脂为HPD500型大孔吸附树脂。

优选的，所述上样的速度为1.0～4.0BV/h，上样量为1～8BV。

优选的，所述静态吸附的时间为3～24h。

优选的，所述除杂所采用的试剂依次为蒸馏水和体积分数为2～7％的乙醇溶液。

优选的，所述蒸馏水的体积为1～9BV，所述乙醇溶液的体积为1～9BV。

优选的，所述洗脱所采用的洗脱剂为乙醇溶液，所述乙醇溶液的体积分数为8～15％，所述乙醇溶液的体积为1～9BV。

优选的，所述洗脱的速度为1～5BV/h。

优选的，所述洗脱后还包括：对所得洗脱液依次进行减压浓缩和干燥。

本发明提供了一种石榴皮安石榴苷的纯化方法，以大孔吸附树脂为吸附剂，利用特定洗脱溶剂进行一次性纯化操作，设备简单，耗时短，成本低，制备量大，得到的石榴皮安石榴苷中的安石榴苷含量可达85～95％以上，有望作为药用原料的中试放大生产工艺，为安石榴苷活性研究与开发奠定试验基础；

本发明的方法纯化步骤简单、成本低；

本发明将大孔吸附树脂柱的柱体积放大23倍，放大试验确定了纯化工艺，所得的安石榴苷含量和出膏率，与实验室小试的结果基本一致，表明本发明的纯化工艺稳定可行，可进一步进行中试研究，为后续安石榴苷的进一步开发利用奠定试验基础。

附图说明

图1为本发明实施例1中安石榴苷对照品的高效液相色谱图；

图2为本发明实施例1中石榴皮安石榴苷待测样品的高效液相色谱图。

具体实施方式

本发明将石榴皮安石榴苷粗提液上样于大孔吸附树脂柱，然后进行静态吸附，得到吸附有石榴皮安石榴苷粗提物的大孔吸附树脂柱。在本发明中，所述石榴皮安石榴苷粗提液的质量浓度优选为10.0～21.0mg/mL，更优选为20.8mg/mL，pH值优选为1.5～4.5，更优选为2.0。

在本发明中，所述石榴皮安石榴苷粗提液的制备方法，优选包括以下步骤：采用体积分数为55～65％的乙醇溶液对石榴皮进行提取，得到石榴皮安石榴苷粗提液。在本发明中，所述石榴皮优选为新疆石榴皮。在本发明的实施例中，具体是将新疆石榴皮粉碎过80目筛，将得到的筛下石榴皮粉末加入到体积分数为55～65％的乙醇溶液中，在料液比为1：20～25、室温条件下进行提取25～35min，并将提取产物依次进行过滤和减压浓缩，将所得浓缩液与蒸馏水混合，得到石榴皮安石榴苷粗提液。在本发明中，所述减压浓缩的温度优选为45～55℃。本发明优选使用滤布进行所述过滤。本发明优选使用质量浓度为1.2mol/L的盐酸调节所述石榴皮安石榴苷粗提液的pH值。

本发明优选采用湿法装柱制备所述大孔吸附树脂柱。在进行所述湿法装柱前，本发明优选采用体积分数为95％的乙醇对大孔吸附树脂进行溶胀24h。完成所述湿法装柱后，本发明优选将所得大孔吸附树脂柱用体积分数为95％的乙醇洗脱，至所得洗脱液与蒸馏水的混合液(体积比为1:5)不呈白色浑浊；并采用紫外分光光度法，以体积分数为95％的乙醇作为空白对照，直至洗脱液于200～800nm波长范围内无吸收，用蒸馏水洗至无醇味，抽滤至干，得到大孔吸附树脂柱。

在本发明中，所述大孔吸附树脂优选为HPD500型大孔吸附树脂；所述上样的速度优选为1.0～4.0BV/h，更优选为2.0BV/h，上样量优选为1～8BV，更优选为5.0BV。在本发明中，所述静态吸附的时间优选为3～24h，更优选为12h，得到吸附有石榴皮安石榴苷粗提物的大孔吸附树脂柱。

得到吸附有石榴皮安石榴苷粗提物的大孔吸附树脂柱后，本发明对所述吸附有石榴皮安石榴苷粗提物的大孔吸附树脂柱依次进行除杂和洗脱，得到石榴皮安石榴苷纯化物。在本发明中，所述除杂所采用的试剂优选依次为蒸馏水和体积分数为2～7％的乙醇溶液(更优选为体积分数为5％的乙醇溶液)；所述蒸馏水的体积优选为1～9BV，更优选为7.0BV；所述乙醇溶液的体积优选为1～9BV，更优选为5.0BV。在本发明中，所述洗脱所采用的洗脱剂优选为乙醇溶液，所述乙醇溶液的体积分数优选为8～15％，更优选为10％；所述乙醇溶液的体积优选为1～9BV，更优选为6.0BV；所述洗脱的速度优选为1～5BV/h，更优选为4.0BV/h。在本发明中，所述洗脱后优选还包括对所得洗脱液依次进行减压浓缩和干燥。本发明对所述减压浓缩和干燥的方式没有特殊的限定，选用本领域技术人员熟知的方式进行减压浓缩和干燥即可。

本发明优选采用高效液相色谱法测定石榴皮安石榴苷纯化物中安石榴苷的含量，具体方法为：

1)色谱条件：色谱柱：Agilent SB-C₁₈(4.6mm×250mm，5μm)；流动相A：0.1％三氟乙酸溶液；流动相B：甲醇，梯度洗脱：0～10min 5％～20％B，10～25min 20％～45％B，25～35min45％～65％B，35～40min 65％～65％B；流速:1.0mL/min；检测波长：370nm；柱温：30℃；进样体积：10μL。

2)对照品溶液的配制

取安石榴苷对照品约0.015g，精密称定，加甲醇溶解，定容至25mL，得到600μg/mL的对照品溶液。

3)待测样品溶液的配制

取石榴皮安石榴苷纯化物粉末0.027g，精密称定，加甲醇溶解，定容至25mL，称定重量，超声处理20min(功率500W，频率40kHz)，放至常温，再次称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.22μm微孔滤膜过滤，得到待测样品溶液。

4)测定方法

精密吸取对照品溶液及待测样品溶液各10μL，分别注入高效液相色谱仪，进行测定，记录峰面积，计算安石榴苷含量。

下面结合实施例对本发明提供的新疆石榴皮中安石榴苷的纯化方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

将新疆石榴皮粉碎后过80目筛，将得到的石榴皮粉末按料液比1：24加入到体积分数为60％的乙醇中，在室温条件下浸提30min，纱布滤过，将所得滤液在50℃条件下进行减压浓缩至无醇味，将所得浓缩液加水稀释成质量浓度为20.8mg/mL的溶液，用质量浓度为1.2mol/L的盐酸调节其pH值为2.0，得到石榴皮安石榴苷粗提液；

将大孔吸附树脂在体积分数为95％的乙醇溶液中进行溶胀24h，湿法装柱，用体积分数为95％的乙醇洗脱至洗脱液与蒸馏水的混合液(体积比1:5)不呈白色浑浊；并采用紫外分光光度法，以体积分数为95％的乙醇作为空白对照，直至洗脱液于200～800nm波长范围内无吸收，用蒸馏水洗至无醇味，抽滤至干，得到大孔吸附树脂柱；

将所述石榴皮安石榴苷粗提液(5BV)以2BV/h的速度上样于所述大孔吸附树脂柱，在室温条件下，置于振荡器(120次/min)振荡12h，进行静态吸附，得到吸附有石榴皮安石榴苷粗提物的大孔吸附树脂柱，然后依次用7BV的蒸馏水和5BV乙醇溶液(体积分数5％)对吸附有石榴皮安石榴苷粗提物的大孔吸附树脂柱进行除杂，再用6BV体积分数为10％的乙醇以5BV/h的速度洗脱，收集洗脱液，将所得洗脱液经减压浓缩、冷冻干燥，得到石榴皮安石榴苷纯化物。

针对实施例1得到的石榴皮安石榴苷纯化物，本发明采用高效液相色谱法对其进行含量测定。

1、测定安石榴苷的含量：

采用高效液相色谱法计算石榴皮安石榴苷纯化物中安石榴苷的含量：

1)色谱条件：色谱柱：Agilent SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相A：0.1％三氟乙酸溶液；流动相B：甲醇，梯度洗脱：0～10min 5％～20％B，10～25min 20％～45％B，25～35min45％～65％B，35～40min 65％～65％B；流速:1.0mL/min；检测波长：370nm；柱温：30℃；进样体积：10μL。

2)对照品溶液的配制

3)待测样品溶液的配制

4)测定方法

图1和图2分别为安石榴苷对照品以及待测样品的高效液相色谱图，由图可知，安石榴苷对照品和待测样品的色谱峰均可达到基线分离，分离度大于1.5，保留时间适中，能够实现石榴皮安石榴苷的含量测定。

经过计算，本发明方法得到的石榴皮安石榴苷纯化物中安石榴苷的含量可达85.21％，显著提高了安石榴苷的含量。

2、稳定性试验

按照本发明的纯化方法，进行3份平行试验，计算安石榴苷百分含量(％)及得膏率(％)，得膏率公式如下：

得膏率(％)＝m₁/M×100％

其中：m₁-石榴皮安石榴苷的质量(g)；M-石榴皮多酚粗提物的质量(g)。

经过计算，石榴皮安石榴苷粗提物三次纯化试验所获纯化物中安石榴苷的平均百分含量为85.21％(n＝3)、RSD＝1.80％；平均得膏率为4.05％(n＝3)、RSD＝1.86％，表明本发明的纯化工艺稳定可行(具体结果见表1)。

表1验证试验结果(n＝3)

3、实验室放大试验研究

按照本发明上述实验室纯化方法进行实验室放大验证研究，将大孔吸附树脂柱的柱体积放大23倍，平行3份试验，计算安石榴苷百分含量(％)及得膏率(％)，具体结果见表2。

根据表2可知，安石榴苷的平均百分含量为85.73％(n＝3)、RSD＝1.75％；平均得膏率为4.01％(n＝3)、RSD＝1.99％，表明本试验的纯化工艺从实验室小试到实验室放大后所得结果，可以证明此工艺稳定可行，为中试放大试验提供试验基础。

表2实验室放大工艺验证结果(n＝3)

由以上实施例可知，本发明提供了一种新疆石榴皮中安石榴苷的纯化方法，采用大孔吸附树脂进行纯化，得到的石榴皮安石榴苷中的安石榴苷含量可达85～95％，且工艺的稳定性好，为安石榴苷抗肿瘤作用的进一步研究奠定试验基础；本发明将大孔吸附树脂柱的柱体积放大23倍，重复小试试验确定的纯化工艺，所得的安石榴苷含量和出膏率，与实验室小试的结果基本一致，表明本发明的纯化工艺稳定可行，可进一步进行中试研究，为后续安石榴苷的进一步开发利用奠定试验基础。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种石榴皮安石榴苷的纯化方法，包括以下步骤：

对所述吸附有石榴皮安石榴苷粗提物的大孔吸附树脂柱依次进行除杂和洗脱，得到石榴皮安石榴苷纯化物；

所述石榴皮安石榴苷粗提液的制备包括以下步骤：采用体积分数为55～65％的乙醇溶液对石榴皮进行提取，得到石榴皮安石榴苷粗提液；

所述大孔吸附树脂柱中填充的大孔吸附树脂为HPD500型大孔吸附树脂；

所述石榴皮安石榴苷粗提液的质量浓度为20.8mg/mL，pH值为1.5～4.5；

所述静态吸附的时间为3～24h；

所述除杂所采用的试剂依次为蒸馏水和体积分数为2～7％的乙醇溶液；

所述蒸馏水的体积为1～9BV，所述乙醇溶液的体积为1～9BV；

所述洗脱所采用的洗脱剂为乙醇溶液，所述乙醇溶液的体积分数为10％，所述乙醇溶液的体积为1～9BV；

所述洗脱的速度为1～5BV/h。

2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述上样的速度为1.0～4.0BV/h，上样量为1～8BV。

3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述洗脱后还包括：对所得洗脱液依次进行减压浓缩和干燥。