CN103505480A - 石榴皮抗肿瘤多酚有效部位及其制备方法和应用 - Google Patents
石榴皮抗肿瘤多酚有效部位及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103505480A CN103505480A CN201210206095.3A CN201210206095A CN103505480A CN 103505480 A CN103505480 A CN 103505480A CN 201210206095 A CN201210206095 A CN 201210206095A CN 103505480 A CN103505480 A CN 103505480A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- polyphenol
- effective site
- antitumor
- pericarpium granati
- ethanol
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Abstract
本发明公开了一种石榴皮抗肿瘤多酚有效部位,由石榴皮乙醇提取物经大孔树脂分离纯化得到,其中,多酚类成分重量之和占有效部位总重量的50~80%,且多酚类成分中鞣花酸、没食子酸、安石榴苷的重量分别占有效部位总重量的10~25%、0.80~1.2%、35~53%。本发明所具有的优点是:充分利用了石榴皮资源、活性成分含量满足辅助治疗和/或预防肿瘤要求。本发明还公开了该石榴皮抗肿瘤多酚有效部位的制备方法及其在制备辅助治疗和/或预防肿瘤药物制剂中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及医药制药技术领域,尤其是涉及一种石榴皮抗肿瘤多酚有效部位。本发明还公开了该石榴皮抗肿瘤多酚有效部位的制备方法和应用。
背景技术
肿瘤是威胁人类健康的最常见、多发疾病,其发病因素较多,且近些年来肿瘤性癌症在我国的发病率呈明显上升趋势。目前,主要的治疗手段有手术、放疗、化疗、内分泌和靶向治疗,它们各有优势和局限。寻找一种有效、低毒、适用范围广的抑肿瘤性癌症药物成为当前之研究热点。
多酚类物质在哺乳动物细胞中有广泛的生物效应,大量的流行病学研究以及动物试验都证明多酚类物质可以阻止和抑制癌症的发病。表现为:多酚的抗癌作用是多个方面的,可以对癌变的不同阶段进行相应抑制;多酚是一种十分有效的抗诱变剂,能够减少诱变剂的致癌作用,并提高染色体精确修复能力,从而达到提高细胞免疫力和抑制肿瘤细胞生长的目的。
石榴(学名:Punica granatum)为(安)石榴科(Punicaceae)(安)石榴属植物,别名安石榴、珍珠石榴、海石榴,又名若榴、丹若、沃丹、天浆、天浆果、金罂、金庞、涂林,新疆维吾尔语称“阿娜儿”。全世界共有1属[石榴属(Punica L.)],2种,产于地中海及亚洲西部地区。我国引入栽培1种,即,石榴Punica granatum L.,在南北各省都有分布。主要分布在陕西、安徽、山东、四川、新疆、河南、云南等地。新疆是我国最西部的石榴产区,且质量好,年产量大。
石榴主要有效成分是多酚类化合物,有黄酮类化合物(黄酮醇、黄烷醇、花色苷)、浓缩单宁(原花色素类)和水解单宁(鞣花单宁和没食子单宁)。其他的化学成分有有机酸和酚酸、生物碱类、甾类、非甾类雌激素拟雌内酯、磷脂、甘油三脂等。
石榴多酚对异种移植物增殖和人前列腺癌细胞入侵具有较强地抑制作用,通过调节细胞周期分布和诱导凋亡来实现其作用。石榴提取物可对乳腺癌细胞的增殖产生抑制作用,可起到对乳腺癌的化学预防和辅助治疗作用。近年来,穆拉德公司新推出的日用防晒护肤品系列中加入了石榴成分,该公司穆拉德博士认为,石榴所含的成分不仅可以抵御日光辐射,预防皮肤衰老,且可增加产品的SPF水平。
但是,文献调研表明:目前有关石榴的应用技术主要集中于石榴汁的榨取与利用,而榨汁后依然含有大量多酚物质的石榴皮则被当作食品加工的废渣被弃去,造成严重的资源浪费。
发明内容
本发明的目的是提供一种石榴皮抗肿瘤多酚有效部位,它具有充分利用了石榴皮资源,且活性成分含量满足辅助治疗和/或预防肿瘤要求的特点。本发明还公开了该石榴皮抗肿瘤多酚有效部位的制备方法和应用。
为了实现上述目的,本发明所采用的技术方案是:石榴皮抗肿瘤多酚有效部位,由石榴皮乙醇提取物经大孔树脂分离纯化得到,其中,多酚类成分重量之和占有效部位总重量的50~72%,且多酚类成分中鞣花酸、没食子酸、安石榴苷的重量分别占有效部位总重量的10~22%、0.80~0.95%、35~45%。
所述石榴皮乙醇提取物为石榴皮粉碎后过40~80目筛,按料液重量比(即石榴皮以g为单位的重量数值和乙醇以ml为单位的体积数值之比。下同)1∶10~1∶24加入浓度为30~60%乙醇作为提取溶剂,10~40℃浸提15~60min,滤过所得的提取物。
本发明所具有的优点是:1、充分利用了石榴皮资源。本发明的石榴皮抗肿瘤多酚有效部位以食品加工废渣石榴皮为开发利用对象,对石榴皮多酚纯化工艺进行了研究,通过大孔树脂分离纯化技术得到石榴皮多酚有效部位,实现了石榴资源的高效利用。2、活性成分含量满足辅助治疗和/或预防肿瘤要求。有效部位提取物中总多酚重量百分比为50%~72%,其中鞣花酸、没食子酸、安石榴苷的含量分别为10~22%,0.80~0.95%,35~45%。药理实验表明石榴皮多酚有效部位作用48h后,MCF-7细胞G0/G1期细胞增多,S期细胞减少,表示细胞周期被阻滞在G0/G1期。48h内对MCF-7、BEL-7404、PC-3、Caco-2、A375、Hela人源性肿瘤细胞增殖抑制率均大于50%。
该石榴皮抗肿瘤多酚有效部位的制备方法,依次包括以下步骤:
a)将石榴皮乙醇提取物滤过得提取液;
b)将提取液在0.4~0.8MPa、50~70℃条件下减压浓缩至每1mL含石榴皮药材10~30mg的浓缩液。
c)将步骤b)制备的浓缩液加入大孔吸附树脂,上样溶液经1.2mol/L盐酸调pH值为2~3.5,上样量为2BV,以1~2BV/h吸附速度上样,吸附时间3~12h,用6~8BV蒸馏水洗脱树脂,依次用6~12BV30%乙醇、3~6BV50%乙醇洗脱树脂,洗脱速度为1~4BV/h,收集乙醇洗脱液,0.4~0.8MPa、50~70℃条件下减压浓缩;
d)将步骤c)制备的浓缩液放入真空冷冻罐中,冷冻罐中的初始温度为-5~-10℃,然后在4~5h内降至-30~-60℃;将冷冻后的冻干物升温至10~20℃,保持1~3h,所得粉末即为该石榴皮抗肿瘤多酚有效部位。
所述步骤c)中所用6~12BV30%乙醇、3~6BV50%乙醇以6~12BV50%乙醇代替。
所述的石榴皮为为石榴科植物石榴Punica granatum L.的干燥果皮。
该方法能够充分提取石榴皮中的有效成分,简单可行。
本发明的石榴皮抗肿瘤多酚有效部位在制备辅助治疗和/或预防肿瘤药物制剂中的应用。即,该石榴皮抗肿瘤多酚有效部位可以采用中药制剂的常规方法制备成常规剂型。例如:片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、糖浆剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂等。
比如,该石榴皮抗肿瘤多酚有效部位可以制备为糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂等片剂。该片剂中含有效部位0.3g/片、药理上可以接受的辅料0.2g/片。服用方法为:一日三次,一次一片。
比如,该石榴皮抗肿瘤多酚有效部位可以制备为硬胶囊剂、软胶囊剂等胶囊剂。该胶囊剂中含有效部位0.15g/粒、药理上可以接受的辅料0.15g/粒。服用方法为:一日服用三次,一次两粒。
比如,该石榴皮抗肿瘤多酚有效部位可以制备为糖浆剂。该糖浆剂中每10ml含有效部位0.3g,其余为药理上可以接受的辅料。服用方法为:一日服用三次,一次10ml。
本发明的药物具有抑制人肿瘤细胞生长的功能,可用于辅助治疗和/或预防肿瘤。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明:
图1是本发明的石榴皮多酚有效部位作用48h后MCF-7细胞的AnnexinV-FITC和PI双染检测结果图;
图2a是本发明的倒置显微镜观察MCF-7细胞形态结果图;
图2b是本发明的倒置显微镜观察有效部位作用24h后的MCF-7细胞形态结果图;
图3是石榴皮多酚有效部位HPLC指纹图谱的18个共有指纹峰。
图中:
图1中A为对照组MCF-7细胞,B、C、D分别用5mg/ml,20mg/ml,80mg/ml石榴皮多酚有效部位作用48h的MCF-7细胞;
图3中4号峰为α-安石榴苷,5号峰为β-安石榴苷,17号峰为鞣花酸。
具体实施方式
下面通过实施例说明本发明的石榴皮多酚有效部位及其制备:
实施例1:通过以下步骤:
a)将石榴皮30g粉碎后按料液重量体积比1∶8加入240ml80%乙醇作为提取溶剂,5℃浸提10min,滤过。
b)将步骤a)制备的提取液0.4MPa、70℃条件下减压浓缩至每1mL含生药30mg混悬液。
c)将步骤b)制备的浓缩液加入HPD500型大孔吸附树脂,上样溶液经1.2mol/L盐酸调pH值为2,上样量为2BV,以2BV/h吸附速度上样,吸附时间3h,用8BV蒸馏水洗脱树脂,依次用6BV30%乙醇、6BV50%乙醇洗脱,洗脱速度为2BV/h,收集乙醇洗脱液,0.4MPa、70℃条件下减压浓缩。
d)将c)浓缩液放入真空冷冻罐中,冷冻罐中的初始温度为-5℃,然后在4h内降至-60℃;将冷冻后的冻干物升温至10℃,保持1h。取所得粉末即为有效部位。
该有效部位为8g,得率为27%。经含量测定,含多酚类成分重量之和占有效部位总重量的50%,且多酚类成分中鞣花酸、没食子酸、安石榴苷的重量分别占有效部位总重量的10%、0.80%、35%。按以下色谱条件检查,色谱行为符合图3所示石榴皮多酚有效部位HPLC指纹图谱。
色谱柱:Agilent TC-C18(2)(4.6mm×250mm,5μm);流动相为0.1%三氟乙酸(A):甲醇(B),梯度洗脱:0~10min甲醇由5%升为20%,10~25min甲醇由20%升为45%,25~35min甲醇由45%升为65%,35~40min甲醇保持65%;流速1mL/min;柱温30℃;检测波长370nm;进样量10μL。
实施例2:与实施1的区别在于:步骤a)中将石榴皮30g粉碎后按料液重量体积比1∶100加入3000ml80%乙醇作为提取溶剂,70℃浸提100min,滤过。
所得有效部位为8.1g,得率为27%。经含量测定,含多酚类成分重量之和占有效部位总重量的50%,且多酚类成分中鞣花酸、没食子酸、安石榴苷的重量分别占有效部位总重量的10%、0.80%、35%。按实施例1色谱条件检查,色谱行为符合图3所示石榴皮多酚有效部位HPLC指纹图谱。
实施例3:通过以下步骤:
a)将石榴皮30g粉碎后过40目筛,按料液重量体积比1∶10加入300ml30%乙醇作为提取溶剂,10℃浸提15min,滤过。
b)将步骤a)制备的提取液0.4MPa、50℃条件下减压浓缩至每1mL含生药10mg混悬液。
c)将步骤b)制备的浓缩液加入HPD500型大孔吸附树脂,上样溶液经1.2mol/L盐酸调pH值为2,上样量为2BV,以1BV/h吸附速度上样,吸附时间3h,用6BV蒸馏水洗脱树脂,依次用6BV30%乙醇、3BV50%乙醇洗脱树脂,洗脱速度为1BV/h,收集乙醇洗脱液,0.4MPa、50℃条件下减压浓缩。
d)将c)浓缩液放入真空冷冻罐中,冷冻罐中的初始温度为-5℃,然后在4h内降至-30℃;将冷冻后的冻干物升温至10℃,保持1h。取所得粉末即为有效部位。
该有效部位为9g,得率为30%。经含量测定,含多酚类成分重量之和占有效部位总重量的52%,且多酚类成分中鞣花酸、没食子酸、安石榴苷的重量分别占有效部位总重量的11%、0.80%、37%。按实施例1色谱条件检查,色谱行为符合图3所示石榴皮多酚有效部位HPLC指纹图谱。
实施例4:通过以下步骤:
a)将石榴皮30g粉碎后过60目筛,按料液重量体积比1∶16加入480ml50%乙醇作为提取溶剂,30℃浸提45min,滤过。
b)将步骤a)制备的提取液0.6MPa、60℃条件下减压浓缩至每1mL含生药20mg混悬液。
c)将步骤b)制备的浓缩液加入HPD500型大孔吸附树脂,上样溶液经1.2mol/L盐酸调pH值为3.0,上样量为2BV,以2BV/h吸附速度上样,吸附时间9h,用7BV蒸馏水洗脱树脂,依次8BV30%乙醇、5BV50%乙醇洗脱树脂,洗脱速度为3BV/h,收集乙醇洗脱液,0.6MPa、65℃条件下减压浓缩。
d)将c)浓缩液放入真空冷冻罐中,冷冻罐中的初始温度为-6℃,然后在4.5h内降至-40℃;将冷冻后的冻干物升温至15℃,保持2.5h。
得有效部位9.1g,得率为30.3%。经含量测定,含多酚类成分重量之和占有效部位总重量的62%,且多酚类成分中鞣花酸、没食子酸、安石榴苷的重量分别占有效部位总重量的17%、0.93%、44%。按实施例1色谱条件检查,色谱行为符合图3所示石榴皮多酚有效部位HPLC指纹图谱。
实施例5:通过以下步骤:
a)将石榴皮30g粉碎后过80目筛,按料液重量体积比1∶24加入720ml60%乙醇作为提取溶剂,40℃浸提60min,滤过。
b)将步骤a)制备的提取液0.8MPa、70℃条件下减压浓缩至每1mL含生药30mg混悬液。
c)将步骤b)制备的浓缩液加入HPD100型大孔吸附树脂,上样溶液经1.2mol/L盐酸调pH值为3.5,上样量为2BV,以2BV/h吸附速度上样,吸附时间12h,用8BV蒸馏水洗脱树脂,依次用12BV30%乙醇、6BV50%乙醇洗脱树脂,洗脱速度为4BV/h,洗收集乙醇洗脱液,0.8MPa、70℃条件下减压浓缩。
d)将c)浓缩液放入真空冷冻罐中,冷冻罐中的初始温度为-10℃,然后在5h内降至-60℃;将冷冻后的冻干物升温至20℃,保持3h。
得有效部位9.0g,得率为30%。经含量测定,含多酚类成分重量之和占有效部位总重量的58%,且多酚类成分中鞣花酸、没食子酸、安石榴苷的重量分别占有效部位总重量的12%、0.90%、40%。按实施例1色谱条件检查,色谱行为符合图3所示石榴皮多酚有效部位HPLC指纹图谱。
实施例6:与实施例4的区别在于:石榴皮采取石榴科植物石榴Punicagranatum L.的干燥果皮;步骤c)中8BV30%乙醇、5BV50%乙醇的洗脱以6BV50%乙醇代替。
得有效部位9.1g,得率为30.3%。经含量测定,含多酚类成分重量之和占有效部位总重量的80%,且多酚类成分中鞣花酸、没食子酸、安石榴苷的重量分别占有效部位总重量的25%、1.2%、54%。按实施例1色谱条件检查,色谱行为符合图3所示石榴皮多酚有效部位HPLC指纹图谱。
实施例7:与实施例6的区别在于:步骤c)中6BV50%乙醇以12BV50%乙醇代替。
得有效部位9.0g,得率为30%。经含量测定,含多酚类成分重量之和占有效部位总重量的79%,且多酚类成分中鞣花酸、没食子酸、安石榴苷的重量分别占有效部位总重量的25%、1.1%、52%。按实施例1色谱条件检查,色谱行为符合图3所示石榴皮多酚有效部位HPLC指纹图谱。
下面通过实验例进一步说明本发明的石榴皮多酚有效部位的有益效果:
实验例:本发明的石榴皮抗肿瘤多酚有效部位的毒性、药性实验如下:
1.石榴皮多酚有效部位的抗肿瘤活性的试验研究
1.1药物溶液的配制:等量取以上实施例1~7所得石榴皮多酚有效部位,混合均匀后采用灭活培养基溶解。阴性对照为正常培养基溶液。
1.2MTT液配制:250g MTT+50ml D-hank’s→5mg/ml MTT液
1.3方法与结果:
(1)用MTT比色法测定药物对肿瘤细胞的增殖抑制作用:
取对数生长期人源性肿瘤细胞,用0.25%胰蛋白酶消化成单层培养细胞,用含10%新生牛血清的RPMI1640培养液配成单个细胞悬液,调节细胞浓度为5×104个/ml接种于96孔培养板中,每孔体积200μl。将培养板放入CO2孵箱,在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养24h。待大部分细胞贴壁后,药物处理组加入不同浓度样品液,空白对照组加无药血清,每组均设6个样本孔。继续培养。72h后,每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20μl,37℃继续孵育4小时;终止培养,小心吸弃孔内培养上清液,每孔加入150μl DMSO,振荡10min,使甲臢充分溶解。选择490nm波长,在酶联免疫检测仪上测定各孔吸收值,记录结果,按照以下公式计算细胞增殖抑制率。结果见表1。
表110mg/ml石榴皮多酚有效部位48h对6种肿瘤细胞的增殖抑制作用
(2)细胞周期动力学检测:取对数生长期MCF-7细胞,消化、重悬,调节细胞浓度为2×105个/ml接种至6孔板,每孔2ml,继续培养24h后吸弃培养液,分别添加石榴皮多酚有效部位,每孔2ml,每一浓度取3个复孔,继续培养;对照孔加入2ml细胞培养液。继续培养48h,收集细胞,PBS洗2次,PI染液避光染色30min,200目尼龙网过滤,上流式细胞仪进行DNA倍性分析,单光束,激发波长为488nm。MCF-7细胞经3个浓度石榴皮多酚有效部位作用48h后,与对照组一起进行流式细胞检测,对各周期细胞进行定量分析,数据见表2。结果显示,石榴皮多酚有效部位作用48h后,G0/G1期细胞增多,S期细胞减少,表示细胞周期被阻滞在G0/G1期。
与对照组比较,*表示p<0.05
(3)细胞凋亡检测:取对数生长期MCF-7细胞,消化、重悬,调节细胞浓度为2×105个/ml接种至6孔板,每孔2ml,继续培养24h后吸弃培养液,分别添加石榴皮多酚有效部位,每孔2ml,继续培养;对照孔加入2ml细胞培养液。继续培养48h,收集细胞,PBS洗2次,将细胞重悬于400μl的1×bingding buffer中,加入5μl Annexin V-FITC和5μl PI,用PBS设阴性对照。室温下避光反应15min,上流式细胞仪,单束光,激发波长为488nm,分析正常细胞、凋亡细胞、机械损伤细胞和坏死细胞。经FCM检测、相关软件分析发现,加入石榴皮多酚有效部位后,MCF-7细胞出现凋亡,对照组未见明显细胞凋亡。石榴皮多酚有效部位在5mg/ml时作用48h诱发46.9%MCF-7细胞凋亡,20mg/ml时作用48h诱发62.4%MCF-7细胞凋亡,80mg/ml时作用48h诱发70.3%MCF-7细胞凋亡,见图1所示的石榴皮多酚有效部位作用48h后MCF-7细胞的Annexin V-FITC和PI双染检测,说明石榴皮多酚有效部位具有诱导MCF-7细胞凋亡的作用。该图1中:A为对照组MCF-7细胞;B为C、D分别为用5mg/ml,20mg/ml,80mg/ml石榴皮多酚有效部位作用48h的MCF-7细胞。
(4)倒置显微镜观察细胞形态:石榴皮多酚有效部位分别作用于细胞不同时间,倒置显微镜下观察MCF-7细胞形态,结果见图2a所示,表明:传代后约6h MCF-7细胞基本贴壁,贴壁后细胞呈多角形爬壁生长,细胞质内物质分布均匀,呈颗粒样,可见圆形的细胞核。见图2b所示,待细胞铺满瓶底时,细胞之间紧密连接,互相连成片。细胞继续培养时,可复层生长。加入石榴皮多酚有效部位后,倒置显微镜下可见细胞形态发生改变,部分细胞收缩呈类圆形,有大量致密的颗粒物质聚集于细胞膜下,细胞中部密度显著降低几乎观察不到细胞核。细胞贴壁能力下降,细胞之间的连接减少,细胞与细胞之间几乎不能连接成片而出现空隙。
2毒理学实验
2.1急性毒性试验
采用最大耐受量实验法。选用体重18—22g的小鼠40只,分为实验组和对照组,每组20只,雌雄各半。取石榴皮多酚有效部位53.75g加蒸馏水至100ml(达到容许给小鼠灌胃的最大浓度),一日内间隔4h给小鼠按0.2ml/10g剂量经口灌胃2次,并以蒸馏水做对照,累计剂量达21500mg/g,首次灌胃前禁食不禁水16h,灌胃后观察7—14d,记录小鼠中毒表现及死亡情况。经检验,本试验中以21500mg/g剂量的石榴皮多酚有效部位给雌雄昆明种小鼠灌胃后未见明显中毒症状,观察14d无死亡。石榴皮多酚有效部位对小鼠的急性经口毒性试验最大耐受剂量(MTD)>21500mg/g。根据《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)中的急性毒性分级标准,属无毒物。
2.2小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验
采用间隔24h两次经口灌胃法。取体重为25—30g的健康昆明种小鼠50只,随机分为5组,每组10只,雌雄各半。以40mg/kg剂量环磷酰胺为阳性对照,蒸馏水为阴性对照,试验设石榴皮多酚有效部位剂量为2.5、5.0、10.0g/kg的3个剂量组,按0.20ml/10g体积给小鼠间隔24h灌胃2次。末次给样后6h颈椎脱臼处死动物,取股骨骨髓用止血钳挤出骨髓液与玻片一端的小牛血清混匀,常规涂片,干燥后甲醇固定5—10min,当日固定后保存,Gemsa染色10~15min,晾干保存。油镜检测,选择细胞完整、分散均匀,着色适当的区域,每只动物计数1000个嗜多染红细胞,计算微核出现的千分率,按卡方检验作统计学处理。
各组骨髓细胞镜检显微镜图视野中红细胞较多与红细胞直径大小相似,胞浆为灰蓝色的细胞为嗜多染红细胞。嗜多染红细胞在环磷酰胺组中出现较多,其余组中出现较少。微核大小不超过主核的1/3,与主核不相连,多数为一个,也可能有两个或两个以上,此时仍按一个有微核的细胞计算;微核一般呈圆形,边缘光滑,整齐,偶尔也可呈椭圆形、肾形、马蹄形及环形。卡方检验表明,石榴皮多酚有效部位的各剂量组微核率与阴性对照组比较,差异均无统计学意义(p均>0.05),而阳性对照组微核率明显增加,与阴性对照组及各剂量组比较,差异均有统计学意义(p均<0.01),说明石榴皮多酚有效部位在所设剂量范围内对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验结果为阴性,未见有细胞毒性作用。
2.3小鼠精子畸形试验
选雄性昆明种小鼠25只,随机分为5组,每组5只。以40mg/kg剂量环磷酰胺为阳性对照,蒸馏水为阴性对照,试验设石榴皮多酚有效部位剂量为2.5、5.0、10.0g/kg的3个剂量组,按0.20ml/10g体积给小鼠灌胃,每日1次,连续5d,于末次灌胃后第30d处死动物,取两侧附睾,置于放有2ml生理盐水的平皿中,用眼科剪将附睾纵向剪1—2刀,静置3—5min,轻轻摇动,用4层擦镜纸过滤,吸滤液涂片,干燥后甲醇固定5min,2%伊红染色1h,用水轻冲,干燥。选择背景清晰、精子重叠较少的部位。每只动物检查1000个精子,记录精子中的无钩、香蕉形、胖头、尾折叠、无定形、双头、双尾等各种畸形数目并统计畸形率(%),按Wilcoson秩和检验方法作统计学处理。统计结果可以看出阳性对照组发生精子畸变的细胞数目远高于其他各组。经检验,检验结果表明,阳性对照组与阴性对照组以及各剂量组相比,其差异有统计学意义(p<0.01),而阴性对照组与各剂量组之间的差异无统计学意义(p>0.05)。此结果说明石榴皮多酚有效部位对小鼠精子无畸变作用。
以上实验表明石榴皮多酚有效部位属无毒级中药提取物,对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核无明显增多作用,对雄性小鼠生殖细胞无明显遗传损伤作用,对MCF-7、BEL-7404、PC-3、Caco-2、A375、Hela人源性肿瘤细胞的生长有抑制活性。
下面以制剂例说明本发明的石榴皮抗肿瘤多酚有效部位的使用方法:
制剂例1:糖衣片剂
以实施例1的制备方法制取石榴皮多酚有效部位300g;取淀粉200g、硬脂酸镁5g、羧甲基淀粉钠5g;
将石榴皮多酚有效部位、淀粉、硬脂酸镁粉碎、过筛、混合,加入70%乙醇制湿颗粒,50℃干燥,整粒,加入羧甲基淀粉钠,混匀,压制成素片,按一般包糖衣工艺包衣既得1000片。一日服用三次,一次一片。
制剂例2:薄膜衣片剂
素片处方:以实施例2的制备方法制取石榴皮多酚有效部位300g;取淀粉200g,硬脂酸镁5g,羧甲基淀粉钠5g;
薄膜衣处方:羟丙基甲级纤维素3000g,聚乙二醇4000 3000g,蒸馏水30000ml,无水乙醇70000ml;
将石榴皮多酚有效部位、淀粉、硬脂酸镁粉碎、过筛、混合,加入70%乙醇制湿颗粒,50℃干燥,整粒,加入羧甲基淀粉钠,混匀,压制成素片,按一般包薄膜衣工艺包衣既得1000片。
一日服用三次,一次一片。
制剂例3:肠溶衣片剂
素片处方:以实施例3的制备方法制取石榴皮多酚有效部位300g;取淀粉200g,硬脂酸镁5g,羧甲基淀粉钠5g;
肠溶衣处方:95%乙醇100ml,聚丙烯酸树脂Ⅱ号3.5g,、聚丙烯酸树脂Ⅲ号3g,吐温-801.5g,苯二甲酸二乙酯1.0g;
将石榴皮多酚有效部位、淀粉、硬脂酸镁粉碎、过筛、混合,加入70%乙醇制湿颗粒,50℃干燥,整粒,加入羧甲基淀粉钠,混匀,压制成素片,按一般肠溶衣工艺包衣既得1000片。
一日服用三次,一次一片。
制剂例4:胶囊剂
以实施例4的制备方法制取石榴皮多酚有效部位150g;取淀粉150g,硬脂酸镁5g;
将石榴皮多酚有效部位、淀粉过筛、混合,加入70%乙醇制湿颗粒,50℃干燥,整粒,加入硬脂酸镁,混匀,无菌分装入1号胶囊既得1000粒。
一日服用三次,一次两粒。
制剂例5:软胶囊剂
以实施例5或6的制备方法制取石榴皮多酚有效部位15000g;蜂蜡3000g,特丁基对苯二酚20g,花生油100000ml
将花生油加热至65℃后加入特丁基对苯二酚与蜂蜡,混匀,加入有效部位混匀,胶体磨研匀,于制丸剂中压丸后将丸置滚筒中定型,烘干,分装,既得1000粒。
一日服用三次,一次两粒。
制剂例6:糖浆剂
以实施例7的制备方法制取石榴皮多酚有效部位3000g,水30000ml,单糖浆加至100000ml
将有效部位溶于热水,加入50ml糖浆中,混匀,最后加单糖浆到足量。
一日服用三次,一次10ml。
Claims (6)
1.石榴皮抗肿瘤多酚有效部位,其特征在于:所述石榴皮抗肿瘤多酚有效部位由石榴皮乙醇提取物经大孔树脂分离纯化得到,其中,多酚类成分重量之和占有效部位总重量的50~80%,且多酚类成分中鞣花酸、没食子酸、安石榴苷的重量分别占有效部位总重量的10~25%、0.80~1.2%、35~53%。
2.根据权利要求1所述的石榴皮抗肿瘤多酚有效部位,其特征在于:所述石榴皮乙醇提取物为石榴皮粉碎后过40~80目筛,按料液重量体积比1∶10~1∶24加入浓度为30~60%乙醇作为提取溶剂,10~40℃浸提15~60min,滤过所得的提取物。
3.根据权利要求1或2所述的石榴皮抗肿瘤多酚有效部位的制备方法,依次包括以下步骤:
a)将石榴皮乙醇提取物滤过得提取液;
b)将提取液在0.4~0.8MPa、50~70℃条件下减压浓缩至每1mL含石榴皮药材10~30mg的浓缩液;
c)将步骤b)制备的浓缩液加入大孔吸附树脂,上样溶液经1.2mol/L盐酸调pH值为2~3.5,上样量为2BV,以1~2BV/h吸附速度上样,吸附时间3~12h,用6~8BV蒸馏水洗脱树脂后,依次用6~12BV30%乙醇、3~6BV50%乙醇洗脱树脂,洗脱速度为1~4BV/h,收集乙醇洗脱液,0.4~0.8MPa、50~70℃条件下减压浓缩;
d)将步骤c)制备的浓缩液放入真空冷冻罐中,冷冻罐中的初始温度为-5~-10℃,然后在4~5h内降至-30~-60℃;将冷冻后的冻干物升温至10~20℃,保持1~3h,所得粉末即为该石榴皮抗肿瘤多酚有效部位。
4.根据权利要求3所述的石榴皮抗肿瘤多酚有效部位的制备方法,其特征在于:所述步骤c)中所用6~12BV30%乙醇、3~6BV50%乙醇以6~12BV50%乙醇代替。
5.根据权利要求3所述的石榴皮抗肿瘤多酚有效部位的制备方法,其特征在于:所述的石榴皮为石榴科植物石榴Punica granatum L.的干燥果皮。
6.根据权利要求1或2所述的石榴皮抗肿瘤多酚有效部位在制备辅助治疗和/或预防肿瘤药物制剂中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201210206095.3A CN103505480A (zh) | 2012-06-21 | 2012-06-21 | 石榴皮抗肿瘤多酚有效部位及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201210206095.3A CN103505480A (zh) | 2012-06-21 | 2012-06-21 | 石榴皮抗肿瘤多酚有效部位及其制备方法和应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN103505480A true CN103505480A (zh) | 2014-01-15 |
Family
ID=49889252
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201210206095.3A Pending CN103505480A (zh) | 2012-06-21 | 2012-06-21 | 石榴皮抗肿瘤多酚有效部位及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN103505480A (zh) |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106349301A (zh) * | 2016-08-26 | 2017-01-25 | 陕西工业职业技术学院 | 一种石榴皮中安石榴苷的分离纯化方法 |
ES2604303A1 (es) * | 2015-09-04 | 2017-03-06 | Biovet, S.A. | Producto alimenticio para animales que comprende ácido elágico, p-cimenol y aliína, y procedimiento para su obtención |
CN106977559A (zh) * | 2017-03-24 | 2017-07-25 | 深圳职业技术学院 | 一种从石榴皮中同时分离提纯安石榴苷和没食子酸的方法 |
CN108864217A (zh) * | 2018-08-02 | 2018-11-23 | 新疆医科大学 | 一种石榴皮安石榴苷的纯化方法 |
CN110179586A (zh) * | 2019-05-28 | 2019-08-30 | 玉苏甫江·亚森 | 一种石榴皮抑菌卫生巾及其制备方法 |
CN112362763A (zh) * | 2020-07-10 | 2021-02-12 | 新疆维吾尔药业有限责任公司 | 石榴补血糖浆检测方法及其指纹图谱、构建方法及应用 |
CN112494619A (zh) * | 2020-08-27 | 2021-03-16 | 新疆医科大学 | 一种治疗子宫颈癌的中药泡腾片及其制备方法和应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101974043A (zh) * | 2010-11-03 | 2011-02-16 | 西安应化生物技术有限公司 | 一种从石榴皮中制备安石榴苷和鞣花酸的方法 |
CN102453038A (zh) * | 2010-11-03 | 2012-05-16 | 张守力 | 一种石榴皮中鞣花酸的提取方法 |
-
2012
- 2012-06-21 CN CN201210206095.3A patent/CN103505480A/zh active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101974043A (zh) * | 2010-11-03 | 2011-02-16 | 西安应化生物技术有限公司 | 一种从石榴皮中制备安石榴苷和鞣花酸的方法 |
CN102453038A (zh) * | 2010-11-03 | 2012-05-16 | 张守力 | 一种石榴皮中鞣花酸的提取方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
杨滨: "石榴皮多酚的提取及其对人宫颈癌HeLa细胞作用的研究", 《山东医药》 * |
陆雪莹: "新疆石榴皮总多酚有效部位的抗氧化、抗菌及抗肿瘤活性", 《食品科学》 * |
Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ES2604303A1 (es) * | 2015-09-04 | 2017-03-06 | Biovet, S.A. | Producto alimenticio para animales que comprende ácido elágico, p-cimenol y aliína, y procedimiento para su obtención |
CN106349301A (zh) * | 2016-08-26 | 2017-01-25 | 陕西工业职业技术学院 | 一种石榴皮中安石榴苷的分离纯化方法 |
CN106349301B (zh) * | 2016-08-26 | 2020-12-18 | 陕西工业职业技术学院 | 一种石榴皮中安石榴苷的分离纯化方法 |
CN106977559A (zh) * | 2017-03-24 | 2017-07-25 | 深圳职业技术学院 | 一种从石榴皮中同时分离提纯安石榴苷和没食子酸的方法 |
CN108864217A (zh) * | 2018-08-02 | 2018-11-23 | 新疆医科大学 | 一种石榴皮安石榴苷的纯化方法 |
CN110179586A (zh) * | 2019-05-28 | 2019-08-30 | 玉苏甫江·亚森 | 一种石榴皮抑菌卫生巾及其制备方法 |
CN112362763A (zh) * | 2020-07-10 | 2021-02-12 | 新疆维吾尔药业有限责任公司 | 石榴补血糖浆检测方法及其指纹图谱、构建方法及应用 |
CN112494619A (zh) * | 2020-08-27 | 2021-03-16 | 新疆医科大学 | 一种治疗子宫颈癌的中药泡腾片及其制备方法和应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN103505480A (zh) | 石榴皮抗肿瘤多酚有效部位及其制备方法和应用 | |
CN101181317B (zh) | 马齿苋提取物及其制备方法和用途 | |
CN104825500B (zh) | 白肉灵芝提取物、提取方法及其用途 | |
CN101242850A (zh) | 文冠果的提取物和从提取物分离出的化合物的组成,功能和应用,以及它们的制备方法 | |
CN101129475B (zh) | 一种葎草属植物的提取物、其用途和含有该提取物的药物组合物 | |
CN102670764B (zh) | 酸枣的活性部位及其制备方法与应用 | |
CN103272007A (zh) | 芍药属植物提取物及其制备方法和用途 | |
CN112791126B (zh) | 牡丹花蕊提取物及其制备方法与应用 | |
CN104800252B (zh) | 一种具有肿瘤抑制作用的精制多酚及其制备方法和应用 | |
CN106214773B (zh) | 一种对化学性肝损伤有辅助保护功能的组合物及其制备方法 | |
CN111184713A (zh) | 桉烷型倍半萜内酯差向异构体在制备抗乳腺癌药物的应用 | |
CN102617698B (zh) | 一种制备纤细薯蓣皂苷的方法及其用途 | |
CN101824014A (zh) | 银线草中具抗肿瘤活性的化合物及其有效部位和用途 | |
CN107496490B (zh) | 一种淫羊藿红景天制剂及其制备方法 | |
Pournaghi et al. | A review of the genus Caesalpinia L.: emphasis on the cassane and norcassane compounds and cytotoxicity effects | |
CN104873563A (zh) | 桔梗茎叶皂苷的制备及在制备抗肿瘤药物和保健品中应用 | |
CN101028322B (zh) | 毛裂蜂斗菜提取物用于制备防治肿瘤疾病药物的用途 | |
CN101880306A (zh) | 黄腊果皂苷类成分及其制备方法和应用 | |
CN101912514A (zh) | 一种具有抗肿瘤作用的重楼总皂苷胶囊及其制备方法 | |
CN103751225A (zh) | 蛹虫草抗肿瘤活性组分的提取方法及其应用 | |
KR0160108B1 (ko) | 조각자나무로부터 추출한 생약 성분으로 된 항암제 | |
Ezeabara et al. | Flavonoid content of Citrus species grown in Awka, Anambra State, Southeastern Nigeria. | |
CN105901738A (zh) | 一种发酵葡萄提取物及其制备方法与含其制剂 | |
CN110194754A (zh) | 一种蹄叶橐吾脂溶性提取物及其制备方法和用途 | |
CN104069194B (zh) | 一种具有抗癌作用的中药组合物及其制备方法和用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20140115 |