CN104800252B - 一种具有肿瘤抑制作用的精制多酚及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从南湖菱壳制备具有肿瘤抑制作用的精制多酚及其制备方法和应用，所述方法的步骤包括：1)南湖菱壳阴干、粉碎、过筛；2)粗提物的制备；3)精制多酚的制备。本发明提供的精制多酚在体外细胞实验中对A549、MDA‑MB‑231、MCF‑7、LOVO肿瘤细胞具有很好的抑制作用。本发明利用南湖菱废弃物菱壳为原料，以现代提取分离手段和药理活性筛选相结合的方法制备得活性组分，变废为宝，有望开发抗肿瘤药物。
Description
技术领域
本发明涉及一种菱壳精制多酚及其制备方法和应用，具体说是涉及一种具有肿瘤抑制作用的南湖菱壳精制多酚及其制备方法和应用，属于植物天然产物技术领域。
背景技术
植物多酚，又名单宁、鞣质，是一类广泛存在于植物体内的、分子中具有多个酚羟基的次生代谢产物的总称。有关它的药用价值如抗氧化、抑菌、抗衰老、抗肿瘤、抗病毒以及对心脑血管疾病和癌症的治疗作用，一直是国内外科研人员研究的热点。南湖菱(Trapaacornis Nakano)又称青菱、馄饨菱、元宝菱，为菱科Trapaceae一年生水生草本植物，形似元宝，为无角菱，主要生长在嘉兴南湖水域，是嘉兴的一种特色农产品。由于其皮薄肉嫩、汁多甜脆、清香可口的特点，很受当地居民的喜欢。目前南湖菱的种植面积达万亩以上，菱角上市具有季节性，短期内大量的菱壳如果不能被有效利用，不仅导致环境污染，也浪费了社会资源。
随着南湖菱产业的发展，如何充分利用其非食用部分菱壳的药用价值成为一项迫在眉睫的研究课题。上世纪70年代浙江大学食品学院秦文清教授调查发现了南湖菱壳汤在民间作为偏方用于辅助治疗消化系统和生殖系统癌症的成功应用，并利用分子遗传学的方法证明了菱壳水浸出物的抗癌变作用。大量的研究表明植物果实的外壳含有丰富的多酚，沈生荣利用有机溶剂提取法从南湖菱壳中获得四部分提取物，其中多酚含量较高的乙酸乙酯提取物的提取率为28.85％，且多酚在该提取物中仅占238mg GAE/g。(沈生荣等，食品工业科技，2013,34(2)：139-142)，同时该团队利用半仿生提取法获得的提取物在浓度0.05g原药/ml浓度下对胃癌SGC7901细胞的抑制率为37％(专利：CN 101869587A)。
综合近年的研究成果发现如下问题：(1)对于南湖菱菱壳抗肿瘤活性的测试是应用的粗提物，其中会含有大量的杂质成分如多糖、蛋白质和色素类，这些成分的存在会影响药物使用的质量控制和安全性，不利于实际生产。(2)对应的粗提物在提取时采用的是毒性较大有机溶剂如石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等，这也不利于工业化的大生产。基于以上问题寻找一种工艺简单、环保、成本低的制备南湖菱壳具有肿瘤抑制活性的精制多酚的方法对于解决菱壳的实际生产应用尤为重要。
发明内容：
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种具有肿瘤抑制作用的南湖菱壳精制多酚及其制备方法和应用。
基于上述目的，一方面，本发明提供一种菱壳精制多酚的方法。本发明菱壳精制多酚的制备步骤如下：
1)、菱壳的预处理：剥开南湖菱果实，留下外壳，在通风阴凉的地方晾晒至干，然后用植物粉碎机粉碎后过60目筛，收集粉末即为原料，放置阴凉干燥处备用；
2)、粗提物的制备：将步骤1)所得的原料按照料液比1:10-1:30(g/ml)加入浓度为30-80％的乙醇溶液，然后于室温下闪式提取20-40s，过滤并收集滤液，滤渣再重复提取1-3次后合并滤液，滤液3000r/min离心10min，收集上清液，减压浓缩得粗提物；
3)、精制多酚的制备：将步骤2)所得的多酚提取物用少量水溶解后直接进入D101大孔吸附树脂柱，先用2个柱体积水淋洗，然后采用体积分数30-60％乙醇水溶液洗脱，洗脱体积为柱体积的2-4倍。收集洗脱液，减压浓缩得精制多酚。最后，以Folin-Ciocalteu法测定多酚含量。
优选的，所述步骤2)和3)中精制多酚制备过程中样品溶液需避光处理。
优选的，所述步骤2)中闪式提取是利用JABE-50T型闪式提取器(河南智晶生物科技公司)，转速1000r/min。
另一方面，提供按照本发明的方法提取的精制多酚的用途。所述按照上述方法制备的南湖菱壳精制多酚在制备抗肿瘤药物的应用，其中所属的肿瘤为乳腺癌和肺癌，其中，精制多酚的浓度为200-300μg/mL。优选的，当肿瘤为肺癌的时候，精制多酚的浓度为200-300μg/mL。
有益技术效果
与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果：(1)本发明精制多酚制备过程中涉及的溶剂为水和乙醇，对环境、设备和操作人员都比较安全，有利于工业化大生产。(2)本发明精制多酚的制备采用了大孔吸附树脂，通过富集作用摒弃了杂质成分，使有效成分的含量提高，有利于后期产品的质量控制。(3)本发明精制多酚的制备过程中使用了闪式提取器，该仪器通过高速机械剪切力和超动分子渗滤技术，在室温下实现菱壳中有效成分的快速提取。(4)本发明制备得到的精制多酚原料易得且来源于天然，工艺简单，成本低，提取条件温和，有利于工业化大生产，能够实现对南湖菱的综合利用，提高产品附加值、节约资源、减少环境污染，同时也为医药、食品、化工行业提供天然活性物质。
实施例子
以下结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实例。
实施例1
一种南湖菱壳精制多酚的制备方法，步骤如下：
(1)菱壳的预处理：剥开南湖菱果实，留下外壳，在通风阴凉的地方晾晒至干，然后用植物粉碎机粉碎后过60目筛，收集粉末即为原料，放置阴凉干燥处备用。
(2)粗提物的制备：将步骤1)所得的原料按照料液比1:20(g/ml)加入浓度为50％的乙醇溶液，然后于室温下闪式提取20s，过滤并收集滤液，3000r/min离心10min，收集上清液，减压浓缩得粗提物。
(3)精制多酚的制备：将步骤2)所得的多酚提取物用少量水溶解后直接进入D101大孔吸附树脂柱，先用2个柱体积水淋洗，然后采用体积分数30％乙醇水溶液洗脱，洗脱体积为柱体积的2倍。收集洗脱液，减压浓缩得精制多酚，提取率为12.7％，经测定多酚含量达893mg GAE/g。
实施例2
一种南湖菱壳精制多酚的制备方法，步骤如下：
(1)菱壳的预处理：剥开南湖菱果实，留下外壳，在通风阴凉的地方晾晒至干，然后用植物粉碎机粉碎后过60目筛，收集粉末即为原料，放置阴凉干燥处备用。
(2)粗提物的制备：将步骤1)所得的原料按照料液比1:30(g/ml)加入浓度为50％的乙醇溶液，然后于室温下闪式提取30s，过滤并收集滤液，滤渣再重复提取2次，合并滤液，3000r/min离心10min，收集上清液，减压浓缩得粗提物。
(3)精制多酚的制备：将步骤2)所得的多酚提取物用少量水溶解后直接进入D101大孔吸附树脂柱，先用2个柱体积水淋洗，然后采用体积分数50％乙醇水溶液洗脱，洗脱体积为柱体积的2倍。收集洗脱液，减压浓缩得精制多酚，提取率为15.9％，经测定多酚含量达947mg GAE/g。
实施例3
一种南湖菱壳精制多酚的制备方法，步骤如下：
(1)菱壳的预处理：剥开南湖菱果实，留下外壳，在通风阴凉的地方晾晒至干，然后用植物粉碎机粉碎后过60目筛，收集粉末即为原料，放置阴凉干燥处备用。
(2)粗提物的制备：将步骤1)所得的原料按照料液比1:30(g/ml)加入浓度为70％的乙醇溶液，然后于室温下闪式提取40s，过滤并收集滤液，滤渣再重复提取2次，合并滤液，3000r/min离心10min，收集上清液，减压浓缩得粗提物。
(3)精制多酚的制备：将步骤2)所得的多酚提取物用少量水溶解后直接进入D101大孔吸附树脂柱，先用2个柱体积水淋洗，然后采用体积分数60％乙醇水溶液洗脱，洗脱体积为柱体积的3倍。收集洗脱液，减压浓缩得精制多酚，提取率为18.1％，经测定多酚含量达924mg GAE/g。
实施例4
一种南湖菱壳精制多酚的制备方法，步骤如下：
(1)菱壳的预处理：剥开南湖菱果实，留下外壳，在通风阴凉的地方晾晒至干，然后用植物粉碎机粉碎后过60目筛，收集粉末即为原料，放置阴凉干燥处备用。
(2)粗提物的制备：将步骤1)所得的原料按照料液比1:20(g/ml)加入浓度为60％的乙醇溶液，然后于室温下闪式提取30s，过滤并收集滤液，滤渣再重复提取1次，合并滤液，3000r/min离心10min，收集上清液，减压浓缩得粗提物。
(3)精制多酚的制备：将步骤2)所得的多酚提取物用少量水溶解后直接进入D101大孔吸附树脂柱，先用2个柱体积水淋洗，然后采用体积分数40％乙醇水溶液洗脱，洗脱体积为柱体积的4倍。收集洗脱液，减压浓缩得精制多酚，提取率为16.3％，经测定多酚含量达915mg GAE/g。
表1：不同试验条件下的提取率和多酚含量
| 项目 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 |
| 原料菱壳重量(g) | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 |
| 步骤2得粗提物重量(g) | 1.15 | 1.40 | 1.42 | 1.26 |
| 步骤3得精制多酚重量(g) | 0.635 | 0.795 | 0.855 | 0.815 |
| 精制多酚提取率(％) | 12.7 | 15.9 | 17.1 | 16.3 |
| 精制物中多酚含量(mg GAE/g) | 893 | 947 | 924 | 915 |
实施例5
菱壳精制多酚对肿瘤细胞的抑制作用
(1)试剂及材料
四唑蓝(3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide,MTT,Sigma Chem.Co.,St.Louis,MO,USA)；二甲亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO,Sigma Chem.Co.,St.Louis,MO,USA，PCode:101388398)；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS,吉诺生物医药技术有限公司，批号：14102401)；RPMI.1640培养液(吉诺生物医药技术有限公司，批号：14102008)；人Ⅱ型肺上皮细胞A549和人乳腺癌细胞MCF-7来自中国科学院上海细胞所；人乳腺癌细胞MDA-MB-231和人结肠癌细胞LOVO由浙江大学医学院惠赠。
(2)细胞培养
取A549、MDA-MB-231、MCF-7、LOVO在含有10％胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)的RPMI-1640培养液(含青霉素、链霉素各100U/mL)中连续培养(5％CO2,37℃孵箱)。用常规的胰酶/EDTA消化传代。
(3)实验方法：MTT法测定细胞存活率
将从实施例3中制备得到的精制多酚配制成500μg/mL的储备液，0.22nm无菌滤膜过滤除菌后置于-20℃储存备用。临用前用无菌水稀释成10、20、50、100、200、300μg/mL系列浓度。
取对数生长期的细胞，经胰蛋白酶消化后，用含10％胎牛血清(fetal bovineserum,FBS)的1640培养基调整细胞密度为1.0×105个/mL·孔，接种于96孔培养板(NalgeNunc International,Naperville,IL,USA)，每孔1.0mL，置37℃，5％CO2孵箱培养24h，待细胞完全贴壁后，加入不同浓度的药液，以未处理的空白细胞为对照，每组设4个复孔。正常1640培养基继续培养24h，然后每孔加10μL MTT(5.0mg/mL)溶液，置于37℃，5％CO2孵箱继续培养4h，弃上清液，每孔加入二甲基亚砜150μL，振荡10min，用多功能酶标仪测定490nm处吸光度，计算肿瘤细胞增殖抑制率，并从中求出样品的半数抑制浓度(IC50)。肿瘤细胞生长抑制率(％)＝(ODcontrol－ODtreat)/ODcontrol×100％其中，ODcontrol表示空白对照组吸光度，ODtreat表示实验组吸光度。
表2 南湖菱壳精制多酚对受试肿瘤细胞株的抑制率及IC50(实施3)
实施例子6
根据与实施例5同样的试验，采用实施例1、2、和4中的精制多酚配制成500μg/mL的储备液，0.22nm无菌滤膜过滤除菌后置于-20℃储存备用。临用前用无菌水稀释成10、20、
表3 南湖菱壳精制多酚对受试肿瘤细胞株的抑制率及IC50(实施1)
表4 南湖菱壳精制多酚对受试肿瘤细胞株的抑制率及IC50(实施2)
表5 南湖菱壳精制多酚对受试肿瘤细胞株的抑制率及IC50(实施4)
50、100、200、300μg/mL系列浓度。结果发现对细胞株表现出不同的抑制率，这可能与不同的提取方法获得的物质的活性不同引起的，具体结果如上表3-5所示。
Claims (1)
1.一种南湖菱壳精制多酚在制备抗肿瘤药物中的用途，其中所述的肿瘤为乳腺癌，其中，精制多酚的浓度为200-300μg/mL；其中所述的菱壳精制多酚的方法由下列步骤组成：
1)、菱壳的预处理：剥开南湖菱果实，留下外壳，在通风阴凉的地方晾晒至干，然后用植物粉碎机粉碎后过60目筛，收集粉末即为原料，放置阴凉干燥处备用；
2)、粗提物的制备：将步骤1)所得的原料按照料液比1:10-1:30g/ml加入浓度为50-70％的乙醇溶液，然后于室温下闪式提取20-40s，过滤并收集滤液，滤渣再重复提取1-3次后合并滤液，滤液3000r/min离心10min，收集上清液，减压浓缩得粗提物；
3)、精制多酚的制备：将步骤2)所得的多酚粗提物用少量水溶解后直接进入D101大孔吸附树脂柱，先用2个柱体积水淋洗，然后采用体积分数40-60％乙醇水溶液洗脱，洗脱体积为柱体积的2-4倍；收集洗脱液，减压浓缩得精制多酚；其中，所述步骤2)和3)中精制多酚制备过程中样品溶液需避光处理，其中步骤2)中所述的乙醇溶液的浓度为50％，70％或60％；其中，闪式提取是利用JABE-50T型闪式提取器，转速1000r/min；其中步骤3)中所述的乙醇溶液的浓度为40％，60％或50％。
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