CN102178688B - 一种常春藤皂苷类成分的制备方法及其抗肿瘤的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种常春藤皂苷类成分3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)[β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-α-L-吡喃阿拉伯糖常春藤皂苷的制备方法及其该成分抗肿瘤的用途。本发明还涉及来自白头翁(Pulsatillachinensis(Bunge)Regel)根茎的含有该化合物的提取物作为抗上述肿瘤的用途。上述肿瘤包括肝癌、胃癌、胶质瘤、乳腺癌、宫颈癌、白血病、结肠癌、淋巴癌等。
Description
技术领域
本发明属于医药、兽药技术领域，涉及一种常春藤皂苷类成分3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)[ β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-α-L-吡喃阿拉伯糖 常春藤皂苷的制备方法及其该成分抗肿瘤的用途，如用于肝癌、胃癌、胶质瘤、乳腺癌、宫颈癌、白血病、结肠癌、淋巴癌等。
本发明还涉及来自白头翁 (Pulsatilla chinensis (Bunge) Regel) 根茎的含有该化合物的提取物作为抗上述肿瘤的用途。
背景技术
白头翁药材取自毛茛科白头翁属植物白头翁的干燥根，味苦，性寒。归胃、大肠经，具清热解毒，凉血止痢之功。用于热毒血痢，阴痒带下，阿米巴痢。据文献报道，白头翁中含原白头翁素（Protoanemonin）、白头翁素（Anemonin）、白头翁灵（Okinalin，C32H46O2）、白头翁英（Okinalein，C4H602）等，近年来国内外学者从白头翁属植物中分离鉴定出几十种五环三萜皂苷成分，这些皂苷主要为齐墩果烷型和羽扇豆烷型两种。白头翁属植物具有广泛的药理及生物活性，主要表现在抗肿瘤、抗炎抗菌、抗病毒、细胞凋亡、抗生物酶、杀虫、杀精等作用。
经过反复研究发现，白头翁的水提液、醇提液及其碱水解产物均具有抗肿瘤活性，尤其是碱水解产物，活性更强，经过进一步成分分析研究，发现其中均含有一系列的常春藤皂苷类成分。
韩国人金松倍申请的专利（CN 1308000C）中所涉及的抗肿瘤药理活性均为肺癌模型。从《中国肿瘤生物治疗杂志》杂志2005年第12卷第1期的文献“V1-28胶囊辅助环磷酰胺治疗荷载LLC肿瘤小鼠的实验研究”、《第三军医大学学报》杂志2007年第29卷第11期的文献“不同活化表型的巨噬细胞对Lewis肺癌细胞增殖和侵袭的影响”、《中国肿瘤临床》杂志2007年第34卷第2期的文献“I L-1 2瘤苗联合放疗对小鼠Lewis肺癌作用研究”等文献可以看出，LLC为Lewis lung cancer 的简写，即为Lewis 肺癌。 “Increased PEA3/E1AF and decreased Net/Elk-3, both ETS proteins, characterize human NSCLC progression and regulate caveolin-1 transcription in Calu-1 and NCI-H23 NSCLC cell lines”等文献可以看出，NCI-H23为人非小细胞肺癌细胞系。
因此CN 1308000C涉及的抗肿瘤专利实际上只是抗肺癌的实体瘤，并不涉及除肺癌以外的其他实体瘤。
CN 1308000C也缺乏治疗肺癌以外的其他实体瘤的实验依据。
另外BTW58组分、化合物I经过我们的实验，证明对人肾癌、人鼻咽癌等体内裸鼠异体移植瘤无明显的抗癌活性。
CN 1308000C将抗肺癌的实验数据推测为可抗所有实体瘤也缺乏实验依据。
发明内容
本发明利用现代分离技术及鉴定手段对白头翁进行系统的化学成分分离，从中分离得到一种常春藤皂苷类成分：3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)[ β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-α-L-吡喃阿拉伯糖 常春藤皂苷，通过体外抗肿瘤活性筛选研究，发现该化合物具有显著的抗肿瘤作用，然而，该成分在白头翁药材中的含量不高；同时研究发现，白头翁的水提物和醇提物均具有一定的抗肿瘤作用，而其碱水解产物的活性明显强于水解前，成分分析发现，碱水解后产物中3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)[ β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-α-L-吡喃阿拉伯糖 常春藤皂苷的含量较水解前大大提高。白头翁药材资源丰富，水解产物活性明确，制备工艺简单易行，适合工业化大量生产，可作为制备抗肿瘤药物，具有广阔的市场前景和开发价值。
本发明的技术方案如下：
1、3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)[ β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-α-L-吡喃阿拉伯糖 常春藤皂苷在制备抗肿瘤药物中的应用。
2、含有3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)[ β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-α-L-吡喃阿拉伯糖 常春藤皂苷的白头翁提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。
3、3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)[ β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-α-L-吡喃阿拉伯糖 常春藤皂苷在制备抗肝癌、胃癌、胶质瘤、乳腺癌、宫颈癌、白血病、结肠癌、淋巴癌药物中的应用。
4、含有3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)[ β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-α-L-吡喃阿拉伯糖 常春藤皂苷的白头翁提取物在制备抗肝癌、胃癌、胶质瘤、乳腺癌、宫颈癌、白血病、结肠癌、淋巴癌药物中的应用。
5、3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)[ β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-α-L-吡喃阿拉伯糖 常春藤皂苷的制备方法，包括以下步骤：
第一步，将白头翁药材粉碎成粗粉，用水或0.1-95%乙醇浸泡0.5-2h，6-12倍量加热回流提取2-3次，每次1-3h，过滤，合并滤液。上述滤液于50-70℃减压浓缩至0.5-1.0g生药材/mL，无醇味，0-4℃冷藏过夜，析胶，滤过，即得白头翁提取物。
第二步，白头翁提取物水溶液中加入氢氧化钠溶液调到PH10-13，加热沸腾4-10小时，每30-60分钟测PH，保持在PH10-13，放冷，加盐酸溶液，调PH 3-7，离心，去沉淀，即得白头翁提取物水解液
第三步，白头翁提取物水解液，经过D101或AB-8或ADS-17大孔树脂吸附，依次用水、30-40%乙醇、50-80%乙醇、95%乙醇洗脱，收集50-80%乙醇洗脱部分,即得BTW58组分。经抗肿瘤药理实验，证明BTW58组分为白头翁抗肿瘤有效部位。
第四步、白头翁抗肿瘤有效部位经ODS反相硅胶柱，用甲醇和水（3:7-10:0）的混合液进行梯度洗脱，梯度洗脱液依次有五组，其体积配比分别为
第一组甲醇5份：水5份；
第二组甲醇6份：水4份；
第三组甲醇7份：水3份；
第四组甲醇8份：水2份；
第五组甲醇9份：水1份；
第五步、收集甲醇8份：水2份的洗脱部分，经Sephadex LH-20柱甲醇-水7：3洗脱，得到化合物I，经对照品比较及LC/MS/MS测试，该化合物为3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)[ β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-α-L-吡喃阿拉伯糖 常春藤皂苷。
本发明所涉及的肿瘤是除肺癌以外的实体瘤。
本发明所述的常春藤皂苷类成分是单一成分的化合物，其化学名称为3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)[ β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-α-L-吡喃阿拉伯糖 常春藤皂苷。
春藤皂苷。
附图说明：
图1是3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)[ β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-α-L-吡喃阿拉伯糖 常春藤皂苷的分子结构式；
图2是BTW58组分的HPLC分析图；
图3是3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)[ β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-α-L-吡喃阿拉伯糖 常春藤皂苷的核磁共振碳谱图。
具体实施例：
3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)[ β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-α-L-吡喃阿拉伯糖 常春藤皂苷的制备方法为：
实施案例1
第一步，将白头翁药材粉碎成粗粉，用水浸泡0.5-2h，6-12倍量加热回流提取2-3次，每次1-3h，过滤，合并滤液。上述滤液于50-70℃减压浓缩至0.5-1.0g生药材/mL，0-4℃冷藏过夜，析胶，滤过，即得白头翁提取物。
第二步，白头翁提取物水溶液中加入氢氧化钠溶液调到PH10-13，加热沸腾4-10小时，每30-60分钟测PH，保持在PH10-13，放冷，加盐酸溶液，调PH 3-7，离心，去沉淀，即得白头翁提取物水解液
第三步，白头翁提取物水解液，经过D101或AB-8或ADS-17大孔树脂吸附，依次用水、30-40%乙醇、50-80%乙醇、95%乙醇洗脱，收集50-80%乙醇洗脱部分,即得BTW58组分。经抗肿瘤药理实验，证明BTW58组分为白头翁抗肿瘤有效部位。
第四步、白头翁抗肿瘤有效部位经ODS反相硅胶柱，用甲醇和水（3:7-10:0）的混合液进行梯度洗脱，梯度洗脱液依次有五组，其体积配比分别为
第一组甲醇5份：水5份；
第二组甲醇6份：水4份；
第三组甲醇7份：水3份；
第四组甲醇8份：水2份；
第五组甲醇9份：水1份；
第五步、收集甲醇8份：水2份的洗脱部分，经Sephadex LH-20柱甲醇-水7：3洗脱，得到化合物I，经对照品比较及LC/MS/MS测试，该化合物为3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)[ β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-α-L-吡喃阿拉伯糖 常春藤皂苷。
实施案例2
第一步，将白头翁药材粉碎成粗粉，用10-45%乙醇浸泡0.5-2h，6-12倍量加热回流提取2-3次，每次1-3h，过滤，合并滤液。上述滤液于50-70℃减压浓缩至0.5-1.0g生药材/mL，无醇味，0-4℃冷藏过夜，析胶，滤过，即得白头翁提取物。
第二步，白头翁提取物水溶液中加入氢氧化钠溶液调到PH10-13，加热沸腾4-10小时，每30-60分钟测PH，保持在PH10-13，放冷，加盐酸溶液，调PH 3-7，离心，去沉淀，即得白头翁提取物水解液
第三步，白头翁提取物水解液，经过D101或AB-8或ADS-17大孔树脂吸附，依次用水、30-40%乙醇、50-80%乙醇、95%乙醇洗脱，收集50-80%乙醇洗脱部分,即得BTW58组分。经抗肿瘤药理实验，证明BTW58组分为白头翁抗肿瘤有效部位。
第四步、白头翁抗肿瘤有效部位经ODS反相硅胶柱，用甲醇和水（3:7-10:0）的混合液进行梯度洗脱，梯度洗脱液依次有五组，其体积配比分别为
第一组甲醇5份：水5份；
第二组甲醇6份：水4份；
第三组甲醇7份：水3份；
第四组甲醇8份：水2份；
第五组甲醇9份：水1份；
第五步、收集甲醇8份：水2份的洗脱部分，经Sephadex LH-20柱甲醇-水7：3洗脱，得到化合物I，经对照品比较及LC/MS/MS测试，该化合物为3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)[ β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-α-L-吡喃阿拉伯糖 常春藤皂苷。
实施案例3
第一步，将白头翁药材粉碎成粗粉，用45-95%乙醇浸泡0.5-2h，6-12倍量加热回流提取2-3次，每次1-3h，过滤，合并滤液。上述滤液于50-70℃减压浓缩至0.5-1.0g生药材/mL，无醇味，0-4℃冷藏过夜，析胶，滤过，即得白头翁提取物。
第二步，白头翁提取物水溶液中加入氢氧化钠溶液调到PH10-13，加热沸腾4-10小时，每30-60分钟测PH，保持在PH10-13，放冷，加盐酸溶液，调PH 3-7，离心，去沉淀，即得白头翁提取物水解液
第三步，白头翁提取物水解液，经过D101或AB-8或ADS-17大孔树脂吸附，依次用水、30-40%乙醇、50-80%乙醇、95%乙醇洗脱，收集50-80%乙醇洗脱部分,即得BTW58组分。经抗肿瘤药理实验，证明BTW58组分为白头翁抗肿瘤有效部位。
第四步、白头翁抗肿瘤有效部位经ODS反相硅胶柱，用甲醇和水（3:7-10:0）的混合液进行梯度洗脱，梯度洗脱液依次有五组，其体积配比分别为
第一组甲醇5份：水5份；
第二组甲醇6份：水4份；
第三组甲醇7份：水3份；
第四组甲醇8份：水2份；
第五组甲醇9份：水1份；
第五步、收集甲醇8份：水2份的洗脱部分，经Sephadex LH-20柱甲醇-水7：3洗脱，得到化合物I，经对照品比较及LC/MS/MS测试，该化合物为3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)[ β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-α-L-吡喃阿拉伯糖 常春藤皂苷。
实施例4、
第一步，将白头翁药材粉碎成粗粉，用0.1%乙醇浸泡0.5-2h，6-12倍量加热回流提取2-3次，每次1-3h，过滤，合并滤液。上述滤液于50-70℃减压浓缩至0.5-1.0g生药材/mL，无醇味，0-4℃冷藏过夜，析胶，滤过，即得白头翁提取物。
第二步，白头翁提取物水溶液中加入氢氧化钠溶液调到PH10-13，加热沸腾4-10小时，每30-60分钟测PH，保持在PH10-13，放冷，加盐酸溶液，调PH 3-7，离心，去沉淀，即得白头翁提取物水解液
第三步，白头翁提取物水解液，经过D101或AB-8或ADS-17大孔树脂吸附，依次用水、30-40%乙醇、50-80%乙醇、95%乙醇洗脱，收集50-80%乙醇洗脱部分,即得BTW58组分。经抗肿瘤药理实验，证明BTW58组分为白头翁抗肿瘤有效部位。
第四步、白头翁抗肿瘤有效部位经ODS反相硅胶柱，用甲醇和水（3:7-10:0）的混合液进行梯度洗脱，梯度洗脱液依次有五组，其体积配比分别为
第一组甲醇5份：水5份；
第二组甲醇6份：水4份；
第三组甲醇7份：水3份；
第四组甲醇8份：水2份；
第五组甲醇9份：水1份；
第五步、收集甲醇8份：水2份的洗脱部分，经Sephadex LH-20柱甲醇-水7：3洗脱，得到化合物I，经对照品比较及LC/MS/MS测试，该化合物为3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)[ β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-α-L-吡喃阿拉伯糖 常春藤皂苷。
实施例5、
第一步，将白头翁药材粉碎成粗粉，用20%乙醇浸泡0.5-2h，6-12倍量加热回流提取2-3次，每次1-3h，过滤，合并滤液。上述滤液于50-70℃减压浓缩至0.5-1.0g生药材/mL，无醇味，0-4℃冷藏过夜，析胶，滤过，即得白头翁提取物。
第二步，白头翁提取物水溶液中加入氢氧化钠溶液调到PH10-13，加热沸腾4-10小时，每30-60分钟测PH，保持在PH10-13，放冷，加盐酸溶液，调PH 3-7，离心，去沉淀，即得白头翁提取物水解液
第三步，白头翁提取物水解液，经过D101或AB-8或ADS-17大孔树脂吸附，依次用水、30-40%乙醇、50-80%乙醇、95%乙醇洗脱，收集50-80%乙醇洗脱部分,即得BTW58组分。经抗肿瘤药理实验，证明BTW58组分为白头翁抗肿瘤有效部位。
第四步、白头翁抗肿瘤有效部位经ODS反相硅胶柱，用甲醇和水（3:7-10:0）的混合液进行梯度洗脱，梯度洗脱液依次有五组，其体积配比分别为
第一组甲醇5份：水5份；
第二组甲醇6份：水4份；
第三组甲醇7份：水3份；
第四组甲醇8份：水2份；
第五组甲醇9份：水1份；
第五步、收集甲醇8份：水2份的洗脱部分，经Sephadex LH-20柱甲醇-水7：3洗脱，得到化合物I，经对照品比较及LC/MS/MS测试，该化合物为3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)[ β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-α-L-吡喃阿拉伯糖 常春藤皂苷。
实施例6、
第一步，将白头翁药材粉碎成粗粉，用65%乙醇浸泡0.5-2h，6-12倍量加热回流提取2-3次，每次1-3h，过滤，合并滤液。上述滤液于50-70℃减压浓缩至0.5-1.0g生药材/mL，无醇味，0-4℃冷藏过夜，析胶，滤过，即得白头翁提取物。
第二步，白头翁提取物水溶液中加入氢氧化钠溶液调到PH10-13，加热沸腾4-10小时，每30-60分钟测PH，保持在PH10-13，放冷，加盐酸溶液，调PH 3-7，离心，去沉淀，即得白头翁提取物水解液
第三步，白头翁提取物水解液，经过D101或AB-8或ADS-17大孔树脂吸附，依次用水、30-40%乙醇、50-80%乙醇、95%乙醇洗脱，收集50-80%乙醇洗脱部分,即得BTW58组分。经抗肿瘤药理实验，证明BTW58组分为白头翁抗肿瘤有效部位。
第四步、白头翁抗肿瘤有效部位经ODS反相硅胶柱，用甲醇和水（3:7-10:0）的混合液进行梯度洗脱，梯度洗脱液依次有五组，其体积配比分别为
第一组甲醇5份：水5份；
第二组甲醇6份：水4份；
第三组甲醇7份：水3份；
第四组甲醇8份：水2份；
第五组甲醇9份：水1份；
第五步、收集甲醇8份：水2份的洗脱部分，经Sephadex LH-20柱甲醇-水7：3洗脱，得到化合物I，经对照品比较及LC/MS/MS测试，该化合物为3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)[ β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-α-L-吡喃阿拉伯糖 常春藤皂苷。
实施例7、
第一步，将白头翁药材粉碎成粗粉，用95%乙醇浸泡0.5-2h，6-12倍量加热回流提取2-3次，每次1-3h，过滤，合并滤液。上述滤液于50-70℃减压浓缩至0.5-1.0g生药材/mL，无醇味，0-4℃冷藏过夜，析胶，滤过，即得白头翁提取物。
第二步，白头翁提取物水溶液中加入氢氧化钠溶液调到PH10-13，加热沸腾4-10小时，每30-60分钟测PH，保持在PH10-13，放冷，加盐酸溶液，调PH 3-7，离心，去沉淀，即得白头翁提取物水解液
第三步，白头翁提取物水解液，经过D101或AB-8或ADS-17大孔树脂吸附，依次用水、30-40%乙醇、50-80%乙醇、95%乙醇洗脱，收集50-80%乙醇洗脱部分,即得BTW58组分。经抗肿瘤药理实验，证明BTW58组分为白头翁抗肿瘤有效部位。
第四步、白头翁抗肿瘤有效部位经ODS反相硅胶柱，用甲醇和水（3:7-10:0）的混合液进行梯度洗脱，梯度洗脱液依次有五组，其体积配比分别为
第一组甲醇5份：水5份；
第二组甲醇6份：水4份；
第三组甲醇7份：水3份；
第四组甲醇8份：水2份；
第五组甲醇9份：水1份；
第五步、收集甲醇8份：水2份的洗脱部分，经Sephadex LH-20柱甲醇-水7：3洗脱，得到化合物I，经对照品比较及LC/MS/MS测试，该化合物为3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)[ β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-α-L-吡喃阿拉伯糖 常春藤皂苷。
研究发现，在白头翁的乙醇提取物中，含有3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)[ β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-α-L-吡喃阿拉伯糖 常春藤皂苷，但含量明显低于经碱水解后的BTW58组分。
实施案例3中的BTW58组分和化合物I的得率及含量均高于实施案例1和2，同时，与韩国人金松倍申请的专利（CN 1308000C）及金松培申请的专利（CN 101010093A）中的制备工艺不同，我们碱水解工艺简单可行，生产成本低，收率较高，适合工业化大生产。
BTW58组分HPLC分析：
色谱柱，未加预柱,压力偏大：Kromasil（C18,250*4.6mm，5um）；流速：1ml/min；柱温：35℃；进样量：20ul；洗脱系统：甲醇-水系统
ELSD：SHIMADZU ELSD-LT Ⅱ;柱温：40℃；Press：350Kpa
梯度条件：时间（min） 甲醇（%）
0.01 65
10 70
30 70
50 100
55 100
55.01 STOP
化合物I结构解析：
白色无定形粉末，硫酸乙醇显紫红色斑点，醋酐-浓硫酸反应阳性，Molish反应阳性，提示该化合物可能为皂苷类化合物。化合物I用2N TFA完全酸水解得到常春藤皂苷元和单糖，糖经衍生化后进行GC分析，检测到L-阿拉伯糖、L-鼠李糖和D-葡萄糖的存在。
13C NMR谱共显示47个碳信号，包括30个苷元碳信号。其中苷元碳信号与常春藤苷元基本一致。3位碳向低场位移至δ 81.2，28位羰基碳信号在δ 180.2，说明该化合物的糖是连在苷元的3位上。13C NMR谱中出现了3个糖信号，结合NMR数据和水解衍生化后的GC分析结果，证明其分别为L-阿拉伯糖、L-鼠李糖和D-葡萄糖。另外，13C NMR谱中显示，在δ 106.9，104.5和101.8位置出现3个糖对应的端基碳信号。经过上述分析，并和公开的文献[Opinya A.Ekabo, Norman R. Farnsworth, Henderson T., et al. J Nat Prod, 1996,59:431-434]中的数据进行比较，证明化合物I的结构为3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)[ β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-α-L-吡喃阿拉伯糖 常春藤皂苷。13C NMR谱数据归属见表1。
表1 化合物I的碳谱数据（ Pyridine-d6）
抗肿瘤药理研究：
从整体、细胞水平，体内体外实验相结合，全面观察了BTW58组分及化合物I的抗肿瘤作用，体外实验结果表明，BTW58组分、化合物I对体外人肝癌SMMC-7721、胶质瘤、胃癌、乳腺癌、白血病等17种肿瘤细胞均有较好的抑制作用，其对各种受试细胞的半效抑制浓度(IC50)范围:1.48—18.1μg/ml，基本上都小于10ug/ml；体内试验表明，BTW58组分、化合物I对人肝癌、胶质瘤、胃癌、乳腺癌、白血病、宫颈癌、结肠癌等体内裸鼠异体移植瘤呈现较强的抗癌活性，而对人肾癌、人鼻咽癌等体内裸鼠异体移植瘤无明显的抗癌活性。
1. 化合物I及BTW58组分对体外人17肿瘤细胞的半效抑制浓度
采用MTT法，选择15种人肿瘤细胞系，考察不同浓度的化合物I及BTW58组分对人肿瘤细胞增殖的影响。收集对数期各肿瘤细胞，调整细胞悬液浓度至1×106个/mL，于96孔板每孔加入100 μL，置于5% CO2，37℃孵箱中孵育24 h后，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的药物皂苷（1.5625、3.125、6.25、12.5、25μg/mL），每个浓度设5个复孔。待药物与细胞作用48 h后，计算药物对细胞生长的抑制率（%）。
实验结果提示，化合物I及BTW58组分对各种受试细胞的生长抑制效应均呈现出良好的浓度依赖关系，对各种受试细胞的半效抑制浓度(IC50)范围:1.48—18.1μg/ml见表2 ，从实验结果可以看出BTW58组分及化合物I对这些细胞生长半效抑制浓度基本上均小于10ug/ml，与顺铂效果相当，有些细胞株如胶质瘤U251、SHG-44、小鼠黑色素瘤B16等抑制效果均优于顺铂，综合各受试细胞的半效抑制浓度的结果，可以提示在体外对肝癌SMMC-7721、胶质瘤、胃癌、乳腺癌、白血病等细胞株的生长抑制作用较显著。
表2 化合物I及BTW58组分对各种受试细胞生长的半效抑制浓度（IC50,μg/mL）
2. 利用小鼠移植性肿瘤模型研究了化合物I及BTW58组分对肝癌H22的影响。
取接种H22肉瘤细胞7d的小鼠,脱颈椎处死,无菌条件下抽取腹水,用无菌生理盐水调整瘤细胞浓度为2×107 /ml,每只小鼠右侧腋窝消毒后皮下接种0.2 ml瘤细胞悬液。小鼠接种瘤细胞24 h后开始给药,正常组及荷瘤模型组每天灌服PBS 0.5ml/只;阳性对照组腹腔注射环磷酰胺40mg/kg,隔日1次; 化合物I 50mg/kg、BTW58组分100mg/kg，连续给药14天。最后一次给药后24 h ,称量各组KM鼠的体重、胸腺重量、胸腺重量，剥离肿瘤组织称重,并无菌取脾脏称重。
实验结果提示，BTW58组分能明显降低H22小鼠瘤重，抑制率高达75.6%; 化合物I亦能明显降低H22小鼠瘤重，对小鼠肝癌生长的抑制率高达80.42%，与环磷酰胺效果相当。见表3。
表3 化合物I及BTW58组分对H22荷瘤鼠瘤重及抑瘤率的影响（n=10，
± s）
| 组别 | 剂量（mg/kg) | 瘤重（g) | 抑瘤率 |
| 对照组 | / | 1.89±0.76 | / |
| BTW58组分组 | 100 | 0.46±0.38** | 75.7% |
| 化合物I组 | 50 | 0.37±0.26** | 80.4% |
| CTX组 | 40 | 0.18±0.15** | 90.5% |
注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01
3. 利用小鼠移植性肿瘤模型研究了化合物I及BTW58组分对S180的影响
取接种S180肉瘤细胞7d的小鼠,脱颈椎处死,无菌条件下抽取腹水,用无菌生理盐水调整瘤细胞浓度为2×106 /ml,每只小鼠右侧腋窝消毒后皮下接种0.2 ml瘤细胞悬液。小鼠接种瘤细胞24 h后开始给药,正常组及荷瘤模型组每天灌服PBS 0.5ml/只;阳性对照组腹腔注射环磷酰胺40mg/kg,隔日1次; 化合物I 50mg/kg、BTW58组分100mg/kg，连续给药14天。最后一次给药后24 h ,称量各组KM鼠的体重、胸腺重量、胸腺重量,剥离肿瘤组织称重,并无菌取脾脏称重。
实验结果提示，BTW58组分能明显降低S180小鼠瘤重，抑制率高达64.1%; 化合物I亦能明显降低H22小鼠瘤重，对小鼠肝癌生长的抑制率高达65.4%，与环磷酰胺效果相当。见表2。
表3化合物I及BTW58组分对S180荷瘤鼠瘤重及抑瘤率的影响（n=10，
± s）
| 组别 | 剂量（mg/kg) | 瘤重（g) | 抑瘤率 |
| 模型组 | / | 2.37±0.68 | / |
| BTW58组分组 | 100 | 0.85±0.74* | 64.1% |
| 化合物I组 | 50 | 0.82±0.31** | 65.4% |
| CTX组 | 40 | 0.25±0.42** | 89.5% |
注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01
4.利用体内裸鼠异体移植瘤模型观察化合物I及BTW58组分对人肝癌SMMC-7721的影响
从人癌种鼠皮下无菌取出肿瘤块，用生理盐水冲洗净血液，选择生长良好的肿瘤组织剪成小块，约米粒大小，将小组织块接种于裸鼠右侧腋窝皮下，接种后待移植肿瘤生长至一定大小后（100mm3以上）开始分组给药，按瘤体积分组，分模型组、阳性药环磷酰胺组（40mg/kg，ip）、化合物I 50mg/kg、BTW58组分100mg/kg，每组各7只。实验结束时，剥取瘤块，称瘤重，计算瘤重抑制率。
结果表明，化合物I及BTW58组分抑瘤率达75%和72.4%,效果优于环磷酰胺（61.1%）效果相当，与模型组比较有显著差异，可见化合物I及BTW58组分对肝癌均有较好的抑制作用。
表4 化合物I及BTW58组分对SMMC-7721动物瘤重及抑瘤率的影响（n=7，
± s）
| 组别 | 剂量（mg/kg) | 瘤重（g) | 抑瘤率 |
| 模型组 | / | 1.57±0.31 | / |
| BTW58组分组 | 100 | 0.39±0.24** | 75% |
| 化合物I组 | 50 | 0.43±0.21 | 72.4% |
| CTX组 | 40 | 0.61±0.24** | 61.1% |
注：* 与模型组比较P＜0.05 **与模型组比较P＜0.01
5. 利用体内裸鼠异体移植瘤模型观察化合物I及BTW58组分对人胶质瘤SHG-44的影响
从人癌种鼠皮下无菌取出肿瘤块，用生理盐水冲洗净血液，选择生长良好的肿瘤组织剪成小块，约米粒大小，将小组织块接种于裸鼠右侧腋窝皮下，接种后待移植肿瘤生长至一定大小后（100mm3以上）开始分组给药，按瘤体积分组，分模型组、阳性药环磷酰胺组（40mg/kg，ip）、化合物I 50mg/kg、BTW58组分100mg/kg，每组各7只。实验结束时，剥取瘤块，称瘤重，计算瘤重抑制率。
见表，化合物I及BTW58组分抑瘤率达79.3%、84.9%,效果优于环磷酰胺（66.5%），与模型组比较有显著差异，可见化合物I及BTW58组分对胶质瘤有较好的抑制作用。
表5 化合物I及BTW58组分对SHG-44动物瘤重及抑瘤率的影响（n=7，
± s）
| 组别 | 剂量（mg/kg) | 瘤重（g) | 抑瘤率 |
| 模型组 | / | 1.27±0.15 | / |
| BTW58组分组 | 100 | 0.26±0.13** | 79.3% |
| 化合物I组 | 50 | 0.19±0.19 | 84.9% |
| CTX组 | 40 | 0.42±0.28** | 66.5% |
注：* 与模型组比较P＜0.05 **与模型组比较P＜0.01
6. 利用体内裸鼠异体移植瘤模型观察化合物I及BTW58组分对人胃癌SGC-7901的影响
从人癌种鼠皮下无菌取出肿瘤块，用生理盐水冲洗净血液，选择生长良好的肿瘤组织剪成小块，约米粒大小，将小组织块接种于裸鼠右侧腋窝皮下，接种后待移植肿瘤生长至一定大小后（100mm3以上）开始分组给药，按瘤体积分组，分模型组、阳性药环磷酰胺组（40mg/kg，ip）、化合物I 50mg/kg、BTW58组分100mg/kg，每组各7只。实验结束时，剥取瘤块，称瘤重，计算瘤重抑制率。
见表，化合物I及BTW58组分抑瘤率达60.1%、65.9%,与模型组比较有显著差异，可见化合物I及BTW58组分对胃癌有较好的抑制作用。
表6 化合物I及BTW58组分对SGC-7901动物瘤重及抑瘤率的影响（n=7，
± s）
| 组别 | 剂量（mg/kg) | 瘤重（g) | 抑瘤率 |
| 模型组 | / | 1.38±0.45 | / |
| BTW58组分组 | 100 | 0.55±0.28* | 60.1% |
| 化合物I组 | 50 | 0.47±0.36* | 65.9% |
| CTX组 | 40 | 0.41±0.36* | 70.5% |
注：* 与模型组比较P＜0.05 **与模型组比较P＜0.01
7. 利用体内裸鼠异体移植瘤模型观察化合物I及BTW58组分对 人乳腺癌MCF-7的影响
从人癌种鼠皮下无菌取出肿瘤块，用生理盐水冲洗净血液，选择生长良好的肿瘤组织剪成小块，约米粒大小，将小组织块接种于裸鼠右侧腋窝皮下，接种后待移植肿瘤生长至一定大小后（100mm3以上）开始分组给药，按瘤体积分组，分模型组、阳性药环磷酰胺组（40mg/kg，ip）、化合物I 50mg/kg、BTW58组分100mg/kg，每组各7只。实验结束时，剥取瘤块，称瘤重，计算瘤重抑制率。
见表，化合物I及BTW58组分抑瘤率达62.5%、68.4%,与模型组比较有显著差异，可见化合物I及BTW58组分对乳腺癌有较好的抑制作用。
表7 化合物I及BTW58组分对MCF-7动物瘤重及抑瘤率的影响（n=7，
± s）
| 组别 | 剂量（mg/kg) | 瘤重（g) | 抑瘤率 |
| 模型组 | / | 1.83±1.19 | / |
| BTW58组分组 | 100 | 0.69±0.54* | 62.5% |
| 化合物I组 | 50 | 0.58±0.43* | 68.4% |
| CTX组 | 40 | 0.39±0.25** | 78.6% |
注：* 与模型组比较P＜0.05 **与模型组比较P＜0.01
8. 利用体内裸鼠异体移植瘤模型观察化合物I及BTW58组分对人白血病K562的影响
从人癌种鼠皮下无菌取出肿瘤块，用生理盐水冲洗净血液，选择生长良好的肿瘤组织剪成小块，约米粒大小，将小组织块接种于裸鼠右侧腋窝皮下，接种后待移植肿瘤生长至一定大小后（100mm3以上）开始分组给药，按瘤体积分组，分模型组、阳性药环磷酰胺组（40mg/kg，ip）、化合物I 50mg/kg、BTW58组分100mg/kg，每组各7只。实验结束时，剥取瘤块，称瘤重，计算瘤重抑制率。
见表，化合物I及BTW58组分抑瘤率达85.2%、80.3%,与模型组比较有显著差异，可见化合物I及BTW58组分对白血病有较好的抑制作用。
表8 化合物I及BTW58组分对K562动物瘤重及抑瘤率的影响（n=7，
± s）
| 组别 | 剂量（mg/kg) | 瘤重（g) | 抑瘤率 |
| 模型组 | / | 1.45±1.19 | / |
| BTW58组分组 | 100 | 0.21±0.35** | 85.2% |
| 化合物I组 | 50 | 0.29±0.46** | 80.3% |
| CTX组 | 40 | 0.46±0.27** | 68.2% |
注：* 与模型组比较P＜0.05 **与模型组比较P＜0.01
9. 利用体内裸鼠异体移植瘤模型观察化合物I及BTW58组分对人宫颈癌Hela的影响
从人癌种鼠皮下无菌取出肿瘤块，用生理盐水冲洗净血液，选择生长良好的肿瘤组织剪成小块，约米粒大小，将小组织块接种于裸鼠右侧腋窝皮下，接种后待移植肿瘤生长至一定大小后（100mm3以上）开始分组给药，按瘤体积分组，分模型组、阳性药环磷酰胺组（40mg/kg，ip）、化合物I 50mg/kg、BTW58组分100mg/kg，每组各7只。实验结束时，剥取瘤块，称瘤重，计算瘤重抑制率。
见表，化合物I及BTW58组分抑瘤率达75.9%、78.6%,与模型组比较有显著差异，可见化合物I及BTW58组分对宫颈癌有较好的抑制作用。
表9 化合物I及BTW58组分对人宫颈癌Hela动物瘤重及抑瘤率的影响（n=7，
± s）
| 组别 | 剂量（mg/kg) | 瘤重（g) | 抑瘤率 |
| 模型组 | / | 1.87±1.24 | / |
| BTW58组分组 | 100 | 0.45±0.38* | 75.9% |
| 化合物I组 | 50 | 0.40±0.34* | 78.6% |
| CTX组 | 40 | 0.41±0.46* | 78.1% |
注：* 与模型组比较P＜0.05 **与模型组比较P＜0.01
10.利用体内裸鼠异体移植瘤模型观察化合物I及BTW58组分对人结肠癌HCT-116的影响
从人癌种鼠皮下无菌取出肿瘤块，用生理盐水冲洗净血液，选择生长良好的肿瘤组织剪成小块，约米粒大小，将小组织块接种于裸鼠右侧腋窝皮下，接种后待移植肿瘤生长至一定大小后（100mm3以上）开始分组给药，按瘤体积分组，分模型组、阳性药环磷酰胺组（40mg/kg，ip）、化合物I 50mg/kg、BTW58组分100mg/kg，每组各7只。实验结束时，剥取瘤块，称瘤重，计算瘤重抑制率。
见表，化合物I及BTW58组分抑瘤率达74.5%、76%,与模型组比较有显著差异，可见化合物I及BTW58组分对白血病有较好的抑制作用。
表10 化合物I及BTW58组分对人结肠癌HCT-116动物瘤重及抑瘤率的影响（n=7，
± s）
| 组别 | 剂量（mg/kg) | 瘤重（g) | 抑瘤率 |
| 模型组 | / | 2.04±1.75 | / |
| BTW58组分组 | 100 | 0.52±0.36** | 74.5% |
| 化合物I组 | 50 | 0.49±0.56** | 76% |
| CTX组 | 40 | 0.44±0.43** | 78.4% |
注：* 与模型组比较P＜0.05 **与模型组比较P＜0.01
11. 利用体内裸鼠异体移植瘤模型观察化合物I及BTW58组分对人肾透明细胞腺癌786-O的影响
从人癌种鼠皮下无菌取出肿瘤块，用生理盐水冲洗净血液，选择生长良好的肿瘤组织剪成小块，约米粒大小，将小组织块接种于裸鼠右侧腋窝皮下，接种后待移植肿瘤生长至一定大小后（100mm3以上）开始分组给药，按瘤体积分组，分模型组、阳性药环磷酰胺组（40mg/kg，ip）、化合物I 50mg/kg、BTW58组分100mg/kg，每组各7只。实验结束时，剥取瘤块，称瘤重，计算瘤重抑制率。
结果见下表，化合物I及BTW58组分对肾癌未出现明显的抑瘤作用。
表11 化合物I及BTW58组分对786-O动物瘤重及抑瘤率的影响（n=7，
± s）
| 组别 | 剂量（mg/kg) | 瘤重（g) | 抑瘤率 |
| 模型组 | / | 1.45±1.19 | / |
| BTW58组分组 | 100 | 1.7±1.35 | -17.4% |
| 化合物I组 | 50 | 1.65±1.23 | -13.5% |
| CTX组 | 40 | 0.58±0.25* | 60.2% |
注：* 与模型组比较P＜0.05 **与模型组比较P＜0.01
12. 利用体内裸鼠异体移植瘤模型观察化合物I及BTW58组分对人鼻咽癌CNE的影响
从人癌种鼠皮下无菌取出肿瘤块，用生理盐水冲洗净血液，选择生长良好的肿瘤组织剪成小块，约米粒大小，将小组织块接种于裸鼠右侧腋窝皮下，接种后待移植肿瘤生长至一定大小后（100mm3以上）开始分组给药，按瘤体积分组，分模型组、阳性药环磷酰胺组（40mg/kg，ip）、化合物I 50mg/kg、BTW58组分100mg/kg，每组各7只。实验结束时，剥取瘤块，称瘤重，计算瘤重抑制率。
结果见下表，化合物I及BTW58组分对鼻咽癌未出现明显的抑瘤作用。
表12 化合物I及BTW58组分对CNE动物瘤重及抑瘤率的影响（n=7，
± s）
| 组别 | 剂量（mg/kg) | 瘤重（g) | 抑瘤率 |
| 模型组 | / | 2.14±1.56 | / |
| BTW58组分组 | 100 | 1.53±1.02 | -5.4% |
| 化合物I组 | 50 | 1.55±1.06 | -6.7% |
| CTX组 | 40 | 0.54±0.64* | 62.5% |
注：* 与模型组比较P＜0.05 **与模型组比较P＜0.01
Claims (2)
1.3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)[ β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-α-L-吡喃阿拉伯糖 常春藤皂苷的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
第一步，将白头翁药材粉碎成粗粉，用水或0.1-95%乙醇浸泡0.5-2h，6-12倍量加热回流提取2-3次，每次1-3h，过滤，合并滤液；上述滤液于50-70℃减压浓缩至0.5-1.0g生药材/mL，无醇味，0-4℃冷藏过夜，析胶，滤过，即得白头翁提取物；
第二步，白头翁提取物水溶液中加入氢氧化钠溶液调到PH10-13，加热沸腾4-10小时，每30-60分钟测PH，保持在PH10-13，放冷，加盐酸溶液，调PH 3-7，离心，去沉淀，即得白头翁提取物水解液；
第三步，白头翁提取物水解液，经过D101或AB-8或ADS-17大孔树脂吸附，依次用水、30-40%乙醇、50-80%乙醇、95%乙醇洗脱，收集50-80%乙醇洗脱部分,即得BTW58组分；
经抗肿瘤药理实验，证明BTW58组分为白头翁抗肿瘤有效部位；
第四步、白头翁抗肿瘤有效部位经ODS反相硅胶柱，用甲醇和水（3:7-10:0）的混合液进行梯度洗脱，梯度洗脱液依次有五组，其体积配比分别为
第一组甲醇5份：水5份；
第二组甲醇6份：水4份；
第三组甲醇7份：水3份；
第四组甲醇8份：水2份；
第五组甲醇9份：水1份；
第五步、收集甲醇8份：水2份的洗脱部分，经Sephadex LH-20柱甲醇-水7：3洗脱，得到化合物I，经对照品比较及LC/MS/MS测试，该化合物为3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)[ β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-α-L-吡喃阿拉伯糖 常春藤皂苷。
2.如权利要求1所述的3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)[ β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-α-L-吡喃阿拉伯糖 常春藤皂苷的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
第一步，将白头翁药材粉碎成粗粉，用45-95%乙醇浸泡0.5-2h，6-12倍量加热回流提取2-3次，每次1-3h，过滤，合并滤液；
上述滤液于50-70℃减压浓缩至0.5-1.0g生药材/mL，无醇味，0-4℃冷藏过夜，析胶，滤过，即得白头翁提取物；
第二步，白头翁提取物水溶液中加入氢氧化钠溶液调到PH10-13，加热沸腾4-10小时，每30-60分钟测PH，保持在PH10-13，放冷，加盐酸溶液，调PH 3-7，离心，去沉淀，即得白头翁提取物水解液；
第三步，白头翁提取物水解液，经过D101或AB-8或ADS-17大孔树脂吸附，依次用水、30-40%乙醇、50-80%乙醇、95%乙醇洗脱，收集50-80%乙醇洗脱部分,即得BTW58组分；
经抗肿瘤药理实验，证明BTW58组分为白头翁抗肿瘤有效部位；
第四步、白头翁抗肿瘤有效部位经ODS反相硅胶柱，用甲醇和水（3:7-10:0）的混合液进行梯度洗脱，梯度洗脱液依次有五组，其体积配比分别为
第一组甲醇5份：水5份；
第二组甲醇6份：水4份；
第三组甲醇7份：水3份；
第四组甲醇8份：水2份；
第五组甲醇9份：水1份；
第五步、收集甲醇8份：水2份的洗脱部分，经Sephadex LH-20柱甲醇-水7：3洗脱，得到化合物I，经对照品比较及LC/MS/MS测试，该化合物为3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)[ β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-α-L-吡喃阿拉伯糖 常春藤皂苷。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |