KR100628334B1

KR100628334B1 - 백두옹의 항암효과를 증진시키는 방법 및 이 방법으로제조된 항암 조성물

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Publication number: KR100628334B1
Application number: KR1020050032120A
Authority: KR
Inventors: 김송배; 안병준; 김혜영; 김종석; 김종욱; 방성철; 이지현
Original assignee: 김송배
Priority date: 2004-07-30
Filing date: 2005-04-18
Publication date: 2006-09-27
Also published as: JP2008508263A; EP1776127A1; US20080268072A1; WO2006016747A1; CN101010093A; CA2575447A1; KR20060047198A

Abstract

본 발명은 백두옹을 추출하기 전에 백두옹 자체가 가지는 효소로 발효 및 숙성하여 효소가수분해시켜서 항암효과가 거의 없으면서, 다량으로 존재하는 백두옹 사포닌인 3-O-[O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[O-β-D-글루코피라노실-(1→4)]-α-L-아라비노피라노실] 헤데라제닌 28-O-α-L-람노피라노실-(1→4)-O-β-D-글루코피라노실-(1→6)-β-D-글루코피라노실 에스터(코드명 : SB365-O)를 항암효과가 강력한 백두옹 사포닌인 3-O-[O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[O-β-D-글루코피라노실-(1→4)]-α-L-아라비노피라노실] 헤데라제닌(코드명 : SB365)으로 변환시킨 후에 추출하여 백두옹 조성물, 및 이 백두옹 조성물에 보조성분으로서 인삼(Panax ginseng), 감초(Glycyrrhizae radix), 팔월찰(Pericarp of Akebia quinata) 및 유백피(Ulmi cortex)에서 선택된 보조생약의 추출물을 함께 함유하는 조성물을 제공하는 것이며, 본 발명의 조성물은 탁월한 항암효과가 있다.

백두옹, 효소가수분해, 백두옹 사포닌, SB365, 항암효과

Description

백두옹의 항암효과를 증진시키는 방법 및 이 방법으로 제조된 항암 조성물{A method of improving anticancer effect of Pulsatillae radix and a composition prepared by the method}

도 1은 용매비(메탄올:물)에 따른 SB365의 함량 변화를 나타낸 그래프이며,

도 2는 물의 양과 온도가 SB365의 생성에 미치는 영향을 나타낸 그래프이며,

도 3은 온도에 따른 SB365의 함량의 변화를 나타낸 그래프이며,

도 4는 숙성 시간에 따른 SB365의 함량 변화를 나타낸 그래프이며,

도 5는 시간에 따른 SB365의 생성과 SB365-0의 감소 경향을 나타낸 그래프이다.

본 발명은 백두옹의 항암효과를 증진시키는 방법 및 이 방법으로 제조된 항암조성물에 관한 것이다.

백두옹(Pulsatillae radix)은 미나리아재비과(Ranunculaceae)에 속하는 할미 꽃(Pulsatilla koreana)(배기환, 한국식물도감, 1999)의 뿌리를 건조한 것이다. 백두옹(白頭翁)의 한방적 용도는 청열, 양혈, 해독의 효능이 있고 소염, 수렴, 지혈, 지사약으로써 열독성 혈리, 말라리아, 비출혈, 치출혈, 인종(咽腫)을 치료한다. 꽃을 백두옹화(白頭翁花)라고 하며 학질, 두창(頭瘡)을 치료한다. 잎을 백두옹엽(白頭翁葉)이라고 하며 요슬통풍(腰膝風痛), 부종 및 심장통을 치료한다. 약리작용으로는 백두옹을 물로 달인 액은 아메바성 적리균에 대한 항균작용이 있고, 트리코모나스에 대해 살충작용이 있으며 사포닌(saponin)성분은 항암작용이 있는 것으로 보고되어 있다.

건조시킨 백두옹에는 약 9%의 사포닌(saponin)이 함유되어 있으며 현재까지 분리된 성분은 프로토아네모닌(protoanemonin), 아네모닌(anemonin), 레눈쿨린(renunculin), 헤데라제닌(hederagenin), 베툴리닌산(betulinic acid) 및 올레아놀산(oleanolic acid) 유도체와 그 배당체 등이 보고 되었다. 이들 작용에 대해 많은 연구가 이루어지지 않았으나, 그 중에서 프로토아네모닌(protoanemonin)은 미토톡시사티(mitotoxicity)를 갖고 있는 것으로 보고되어 있다(Vonderbank, F., Pharmazie, 5, 210, 1950). Li 등 (Li, R. Z. 등, Yao Hsueh Hsueh Pao. 28, 32631, 1993)은 라눈쿨린(ranunculin)이 KB 세포 등에 세포독성을 갖는다고 보고하고 있으며 세포독성기전으로는 DNA 폴리메라제(DNA-polymerase) 저해라고 보고하였다.

본 발명자들은 이 생약으로부터 신생혈관 형성과 암세포의 성장을 억제하는 물질을 이미 분리한 바 있다.(특허 제 0315200호, 김용 planta med). 또한 위의 물 질을 추출하고 남은 수용분에서 항암성 사포닌(saponin)을 분리하였으며, SB365라고 명명한 이 물질은 LL/2암에 걸린 BDF1 마우스에 대하여 암성장 저지율 80%를 보여 강한 항암물질임이 증명되었다(Y.Kim et.al.; Comparison of the antitumor activity of SB31^®-Injection with those of some clinically used antitumor agents. Archives of Pharmacal Research. 2004.1. submitted, 대한민국 특허출원 제 2002-0043016호). 또한 백두옹으로부터 총 17개의 사포닌을 분리하여 이들 개개는 물론 이들을 혼합한 처방들에 대한 항암성을 평가한 바 있다(대한민국 특허출원 제2004-0032280호).

백두옹을 주성분으로 하는 항암 조성물 및 백두옹의 항암성분에 관하여서는 여러 특허문헌에 기재되어 있다.

예를 들면, 본 발명자가 발명한 특허등록 제72982호(특허 공고 제1994-234호)에는 백두옹을 활성성분으로 함유하는 항암작용을 가지는 약학적 조성물이 개시되어 있다. 또한, 본 발명의 발명자들이 발명한 특허출원 제2002-0043016호(공개번호 제 2004-9172호)에는 백두옹의 항암활성성분이 다음 구조식 I의 3-O-[O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[O-β-D-글루코피라노실-(1→4)]-α-L-아라비노피라노실]헤데라제닌)( 코드명 : SB 365)인 백두옹 사포닌 D(Pulsatilla saponin D)임을 밝혀내고, 이 SB 365를 활성성분으로 함유하는 항암조성물이 개시되어 있다. 이 SB365는 아드리아마이신보다도 NCI-H23에 대한 암성장억제율이 더 높은 것으로 나타났다.

SB365

그러나 강력한 항암활성을 가지는 백두옹 사포닌인 3-O-[O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[O-β-D-글루코피라노실-(1→4)]-α-L-아라비노피라노실]헤데라제닌(SB365)은 그 함량이 매우 적으며, 대부분의 백두옹 사포닌은 3-O-[O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[O-β-D-글루코피라노실-(1→4)]-α-L-아라비노피라노실]헤데라제닌 28-O-α-L-람노피라노실-(1→4)-O-β-D-글루코피라노실-(1→6)-β-D-글루코피라노실 에스터의 형태로 존재하며(코드명 : SB365-0)( Viqar U. A. Spectroscopic data of saponins press: CRC, 2000; Vol. 3. pp 2520; Kang S. S., Saponins from the root of Pulsatilla koreana, Arch. Pharm. Res. 12(1), 42-47, 1989), 이 물질은 SB 365의 물질의 아그리콘의 17-위치의 카르복실기에 단당류가 3개 에스테르결합에 의하여 결합된 에스테르이다. 그 구조식은 다음과 같다.

SB365-O

이 SB365-O는 항암효과가 없으며, 통상의 백두옹의 추출조건하에서는 에스테르 형태로 그대로 추출되어 항암력이 거의 없는 문제점이 있었다. 실제로 백두옹에서 SB365-O를 분리하여 가수분해함으로써 SB365를 얻는 문헌도 있으나, 이과정은 경제성이 없다. 또 원래의 용매추출물 자체를 산 또는 알칼리 가수분해하여도 SB365를 얻을 수 있을 것이나 산 또는 알칼리 조건하에서는 백두옹의 기타 성분에도 화학반응을 일으킬 수 있기 때문에 이들 방법의 사용에도 문제점이 있다. 이에 본 발명자들은 오랜 연구를 행한 결과, 본 발명을 완성하였다.

본 발명자들은 오랜 연구를 통하여, 백두옹에는 이 에스테르결합을 분해시키 는 효소가 존재하여, 일정시간동안 일정비율의 물과 함께 발효 및 숙성시키면(이하 "숙성"이라 한다.), SB365-O의 에스테르가 가수분해되어 SB365가 생성되어 결과적으로 백두옹의 추출물의 항암력을 획기적으로 향상시키는 놀라운 사실을 발견하여 본 발명을 완성하였다. 그 반응식은 다음과 같다.

본 발명은 백두옹의 항암성 물질인 SB365(대한민국특허출원 제10-2002-0043016호)가 최대로 생성되는 생성조건을 설정하고, 이 조건에서 얻은 백두옹 및 백두옹을 포함한 생약 복합제제를 만드는 것을 그 목적으로 한다.

SB365의 최적 생성 조건은 백두옹 일정량에 대한 물의 양과 숙성 시간 및 온도를 정하여 설정한다. 또한 최적조건의 설정이전에 SB365(Pulsatilla saponin D, 3-O-[O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[O-β-D-글루코피라노실-(1→4)]-α-L-아라비노피라노실] 헤데라제닌)와 이의 기질인 SB365-0(Pulastilla saponin H, 3-O-[O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[O-β-D-글루코피라노실-(1→4)]-α-L-아라비노피라노실] 헤데라제닌 28-O-α-L-람노피라노실-(1→4)-O-β-D-글루코피라노실-(1→6)-β-D-글 루코피라노실 에스터: Viqar U. A. Spectroscopic data of saponins press: CRC, 2000; Vol. 3. pp 2520; Kang S. S., Saponins from the root of Pulsatilla koreana, Arch. Pharm. Res. 12(1), 42-47, 1989)와의 양적 관계를 분석하여 기질과 반응물의 화학을 정립한다.

여기서는 자연 친화적 조건 즉 백두옹 자체가 제공하는 반응 매질과 기전을 이용하여 SB365를 얻고자 한 것이 본 원의 주요 특징의 하나이다.

숙성의 대상은 SB31^®　(상품명; 에스비주사약. 신규 항암성을 가지는 약학제제 및 제조 방법; 한국특허 제72982호, 미국특허 제 6071521호), 이를 구성하는 백두옹, 인삼, 감초와 이에 더하여 팔월찰, 유백피이다. 백두옹, 감초, 인삼의 각개 숙성 추출물을 얻어 이를 SB31^®의 구성 생약의 비율대로 환산하여 처방을 만들고 이것과 SB31^®과의 항암성을 비교함으로써 보다 진전된 항암처방을 만드는 것이 본 발명의 목표이다.

가. 백두옹으로부터 SB365의 다량 생산을 위한 조건

배당체를 가지는 식물세포는 이를 분해하는 효소, 즉 글리코시다제(glycosidases)를 함유하고 있다. 배당체 추출에 있어서 천연 그대로의 구조를 유지하려면 추출 조작 전에 이 효소를 불활성화하는 것이 선결 조건이다. 통상의 유기용매 추출조건에서는 이 효소가 불활성화되어 작용하지 않는다. 본 발명에서는 이와는 반대로 백두옹에 다량 포함되어 있는 기질인 SB365-0을 가수 분해함으로써 가수분해 산물인 SB365를 천연 상태 보다 더 많은 양을 확보하고자 하였다. 또한 본 발명중 발효 및 숙성 부분은 본 연구진들이 출원한 공지 문헌의 내용(진통제 조성물; 한국특허출원 제10-2003-0008090호)을 더욱 구체화 내지 수정 발전시킨 것이다.

실험예 1 : 백두옹의 메탄올/물 혼합용매에서의 숙성

일반적으로 유기용매 존재 하에서는 효소의 작용이 불가능하다. 숙성은 물의 존재 하에서 일어남으로 숙성 효과를 관찰하기 위하여서는 용매 추출물과 물 추출물간의 차이를 연구하는 것이 중요하다.

백두옹 분말을 여러 농도의 메탄올로 일정시간 숙성시킨 다음, 3회 씩 추출한 다음 그 추출물을 만들고 SB365의 피크에 해당하는 HPLC상의 면적 백분율을 비교하였다. 그 결과를 표 1 및 도 1에 나타내었다.

표 1과 도 1에서 확인되는 바와 같이, 물로만 숙성시키고 추출한 추출물에 비하여 메탄올을 함유한 혼합 수용액에서의 숙성 및 추출한 추출물은 모두 극소량의 SB365를 함유함을 알 수 있다. 더구나 순 메탄올로 숙성시키고 추출한 추출물과 20 % 메탄올 추출물간에 함량차이가 없다. 이는 순수한 물중에서는 백두옹의 가수분해 효소가 작용하며, 이 효소는 소량의 메탄올의 존재에도 매우 민감하여 그 활성이 소실됨을 뜻한다. 이를 숫자개념으로 바꾸면 물만 사용하여 숙성한 경우가 (MeOH : H₂O=0:100) 메탄올 및 그 수용액으로 숙성할 때보다 18 ~ 44 배의 더 많은 SB365를 얻을 수 있음을 말한다. 이는 결론적으로 SB365를 최대로 생성시키기 위하여는 백두옹을 물만으로 숙성시켜함을 뜻한다.

표 1. 용매비에 따른 SB365의 HPLC피크 면적

실험예 2 : 물의 양과 SB365의 생성관계

앞에서 관찰하였듯이 물의 존재가 백두옹의 숙성에 있어서 매우 중요한 인자임으로 여기에서는 이를 보다 정량적으로 연구하고자 하였다.

우선, 발효온도는 임의로 40℃, 시간은 1시간으로 정하고 백두옹과 물의 양과의 관계를 관찰하였다. 그 결과를 표 2와 도 2에 나타내었다. 표 2와 그림 2에서 볼 수 있듯이 백두옹에 대하여 중량비로 2배의 물을 가할 때 SB365의 생성은 가장 왕성하였다. 백두옹과 물의 비가 1:2 인 조건은 효소와 SB365-O의 전구물질의 농도, 염류 및 pH 등 반응조건이 백두옹 세포내의 자연 상태와 가장 근접하므로 효소 작용의 최적 조건이라 판단된다. 백두옹 무게(g) 1 에 대한 물의 양(ml) 2의 비율은 건조 백두옹 분말에 가하여 조작할 수 있는 최소한의 물의 양이다. 물의 양은 중량기준으로 백두옹 1에 대하여 2～20배의 양, 바람직하게는 3～10배의 양으로 하고 교반기로 교반하면서 숙성시킨다. 참고로 물의 효과를 최대한 올리기 위해서는 반죽상태가 고르게 되어야 한다. 반죽은 잘 섞어 주고, 숙성이 진행되는 동안에도 10분 단위로 섞어 주는 것이 좋다. 또한 물의 휘산을 방지하기 위하여 습도가 70 ~ 90%가 유지되어 있는 챔버(chamber)에서 숙성시키는 것이 중요하다.

표 2와 도 2에서 보면 물의 양이 증가함에 따라 SB365의 생성량이 감소하는 경향을 보인다. 물량이 2 ml에서 5 ml 까지는 백두옹 1g당 SB365 함량이 24.9 ~ 23.4 mg/g 으로 많은 양의 물질이 생성되다가 6 ml 부터는 감소하는 경향을 보였다. 이는 백두옹 자체로 구성된 반응 메디움이 희석됨으로 인하여 가수분해 효소의 활성이 떨어지기 때문인 것으로 생각된다. 그러나 백두옹 1에 대하여 물의 양 10배까지는 백두옹 숙성에 있어서 실제적인 변화를 주지 않는 것으로 판단된다. 표2와 도 2에는 표시되지 않는 내부 데이터에 의하면 물의 양이 20 ml에 이르면 물질 생성량이 급격히 줄어든다. 표 2의 백두옹 1 g 당 SB365 함량은 공지의 방법 (신규 항암활성을 가지는 약학제제 및 제조방법; 대한민국특허 제 72982호, 미국특허 제 6071521호)에 의한 함량보다 훨씬 높다.

표 2. 물 첨가량에 따른 SB365 함량변화

실험예 3 : 숙성온도와 SB365의 생성과의 관계

본 실험예에서는 수집한 백두옹의 여러 원료를 혼합한 것을 사용하였다.

실험예 2에서 숙성을 위한 물의 최적량을 확정하고, 예비적 온도 스케일에서 반응 온도 범위를 정하였다. 본 절에서는 백두옹 혼합 원료에 대해 숙성 온도를 1℃ 단위로 나누어 숙성시킨 다음 SB365의 생성량을 측정한 결과를 제시하였다. 위 도 2 에서 보면 40℃ 에서 이미 SB365가 급격히 증가하기 시작함으로 여기서는 시작 온도를 37℃로 하여 실험하였다. 그 결과를 다음의 표 3과 도 3에 나타내었다. SB365의 함량이 온도의 상승에 따라 점차 상승하다가 40℃에 이르러 최대 함량(15.44 mg/g)이 생성되었다. 40℃가 넘으면 그 양은 감소하였으나 42℃에 이르러서도 14.6 mg/g의 매우 많은 양이 생성되었다. 따라서 실제로 사용할 수 있는 온도 범위는 38 ~ 42℃이다. 42℃ 이상의 온도에서는 생성된 SB365가 줄어드는 현상은 물질이 파괴되거나 효소의 활성이 줄어들기 때문인 것으로 해석할 수 있다.

표 3. 온도에 따른 SB365의 함량 변화

실험예 4 : 숙성시간과 SB365의 생성의 변화

백두옹 원료는 실험예 3의 것과 동일한 것을 사용하였다.

숙성을 위한 물의 양과 온도가 확정되었음으로 SB365의 최대 생성을 위한 최 적의 숙성시간을 발견하는 작업을 행하였다. 그 결과를 다음의 표 4와 도 4에 나타내었다. 표 4 및 도 4에서 보는 바와 같이 20분에서는 SB365의 생성이 9.1 mg이던 것이 90분 숙성에서는 16.3 mg, 180분에서는 20.1 mg이 생성되었다. 20분대의 양에 비하여 180분에서는 2배 이상이 증가되었다가 180분 이후에는 물질양이 감소되는 경향 보인다. 그러나 240분대에서도 19.2 mg이 생기는 것으로 보아 실제로는 이 시간대까지도 숙성에 적용할 수 있다. 발효 및 숙성온도는 20분~12시간, 바람직하게는 90분~240분, 가장 바람직하게는 약 180분이다.

결론적으로 최적 발효시간은 180분이며, 실제로 사용할 수 있는 최적 숙성 시간의 범위는 90 - 240분이다. 240분 이후에는 SB365의 양이 감소하는 경향을 보이는데, 이는 이 시간 이후에 SB365의 파괴 또는 효소가 불활성화 됨을 말해 준다.

표4. 숙성 시간에 따른 SB365의 함량 변화

1. 상기 실험 등에 의거한 백두옹 숙성의 결론

백두옹 분말 일정량을 숙성함에 있어서 물의 첨가량은 2배가 가장 적합하였다. 그러나 물의 양을 4 - 10배로 증가시켜도 비교적으로 상당히 많은 양의 SB365가 생성됨을 알 수 있다. 최적온도는 40℃이나 38 - 42℃의 온도 범위에서 경제성이 있는 물질량이 생성되었다. 실시예에서 행한 바와 같이 물의 양을 2배로하고 39℃에서 3시간 숙성한 백두옹으로부터 정량한 SB365의 수율은 20.1 mg/g - 24.5 mg/g으로, 공지의 SB31^®　의 경우(신규 항암성을 가지는 약학제제 및 제조 방법; 한국특허 제 0722982호, 미국특허 제 6071521호)에서 얻은 수율 보다 3-5배가 높다. 본 발명의 방법으로 백두옹을 숙성시키고 추출한 백두옹 추출물을 'Pu-ex' 라 고 표시하였다.

2. SB365의 생성의 화학

SB365의 생성량은 온도와 시간에 비례적이고, 물의 양에 반비례적 방향으로 진행되는 것으로 보아 이는 분명 가수분해 효소가 관여하는 화학적 반응임이 틀림없다. 본 연구자들은 이 효소반응을 보다 구체적으로 보기 위하여 SB365의 전구물질로 생각되는 물질 SB365-0을 순수 분리하였다. 실험 1에 따라 SB365는 아세토니트릴:물=36:64의 용매조건에서 잘 분리되며 29-30분대의 리텐션 타임(retention time : RT)을 나타냈다. 또한 실험 1의 HPLC 조건 중 용매를 아세토니트릴:물=25:75로 하면 SB365-0 피크가 잘 분리되었으며 이의 리텐션 타임은 15-16분대였다.

SB365와 SB365-0의 리텐션 타임(RT)을 확정한 다음 윈료 1g에 대하여 물 2g을 가한 후 [가-2절]과 같은 방법으로 39℃에서 시간 별로 SB365의 생성과 SB365-0의 양적 감소를 관찰하였다. 그 결과를 다음의 표 5와 도 5에 나타내었다. 도 5에서 보면 SB355의 생성과 SB365-0의 감소는 반비례적 관계에 있으며, 이로써 SB365-0가 이 반응의 기질임이 틀림없고, 초기 반응 속도(initial rate)가 빠르고 시간이 흐름에 따라 일정 속도에 머무는 것으로 보아 이는 전형적인 효소반응임을 알 수 있다.

3. 이상의 실험결과로부터, 백두옹 1에 대하여 물의 양 2 내지 20배량, 숙성온도는 37 ~ 43℃. 숙성시간은 20분 ~ 360분에서 숙성이 가능함을 알 수 있다.

표 5. 발효시간에 따른 SB365 와 SB365-0의 피크면적의 변화

나. 숙성 백두옹으로부터 SB365의 용매추출물

숙성된 백두옹 반죽에 메탄올을 가하여 전체가 30～90 % 메탄올 용액이 되게 하여 교반한 후, 원심분리하여 여과한다. 남은 식물체에는 30～90 % 메탄올로 2회 더 추출한다. 1회 추출 용매의 양은 백두옹 1에 대하여 3 - 5배량으로 한다. 가장 바람직하게는 4배량이 적합하다.

30～90 % 메탄올 추출액을 합하여 감압 건고하고 여기에 99 % 이상의 순 메탄올을 백두옹 1에 대하여 20 - 50배를 가하여 흔들어 준 다음 방치하여 당류 및 고분자 등의 불용 분은 제거한다. 메탄올 용해분은 건고한다. 건고물의 수율은 백 두옹 1 g당 평균 580 mg이며 메탄올 엑기스로서 그 자체와 이를 혼합한 처방을 항암제로 사용한다.

에탄올, 이소프로판올, 부탄올을 추출 용매로 같은 백분율로 사용하는 경우에는 엑기스 양의 평균치는 각각 478 mg, 501 mg, 411 mg 이었고, 극성이 높은 메탄올이 가장 높은 수율을 냈다.

본 발명에서는 주활성성분인 백두옹을 숙성시키고 추출한 추출물 이외에 보조성분으로서 인삼(Panax ginseng, 人蔘), 감초(Glycyrrhiza glabra, 甘草), 팔월찰(Pericarp of Akebia quinata, 八月札, 일명 林下婦人) 및 유백피(Ulmi cortex, 楡白皮)에서 선택된 생약의 추출물을 1종이상을 혼합하여 항암효과를 증진시킬 수 있다.

인삼(Panax ginseng)은 항 스트레스작용, 항 당뇨작용 등 다양한 약리효과를 갖고 있다. 그러나 인삼이 기능성 식품으로서의 항암효과 외에 항암제로서의 이용에 관한 연구 보고는 없다. 다만 인삼이 함유하는 디아세치렌 유도체(diacetylenes)가 강한 세포독성을 보인다는 연구가 있으나(안 등) 이들 또한 생체 암에 대한 항암성 연구는 되어 있지 않다.

감초는 한방에서 보신, 중화, 익기(益氣), 진통, 해독, 진해, 소종의 목적으로 사용한다. 감초의 간장 보호 작용 등에 관한 연구는 다양하게 행하여졌으나 생 체암에 대한 항암성 연구는 되어 있지 않다. 본 원에서는 감초가 저독성인 반면 해독의 효과가 있음에 착안하여 이를 처방에 가하였다.

팔월찰은 으름덩굴(Akebia quinata)의 과일이며 한방에서는 요통, 늑간통, 위기통(胃氣痛), 뇨로결석, 월경불순, 하리 등에 처방 된다. 주성분으로는 akebia saponin을 함유하고 있다. 팔월찰은 hederagenin, oleanolic acid를 아글리콘으로 한 사포닌 생약이어서 백두옹의 항암성에 대하여 상승효과를 발휘할 가능성이 있다.

유백피는 느릅나무 류(Ulmus species)의 수피 및 근피이며 한방에서는 利水消腫의 목적으로 사용한다. 최근의 한 문헌에서는 유백피 엑기스가 전신성 및 국부 과민 반응을 방지한다고 보고하고 있다[Kim HM, Shin HY, Choi IY, Lee EH, Lee EJ. Action of Ulmi radicis cortex extract on systemic and local anaphylaxis on rats. Gen. Pharmacol. 31, 483-488(1998)]. 문헌에 消腫의 효과가 있는 것으로 되어 있고 이 생약자체가 특별한 독성을 보이지 않는 것으로 기재되어 있다.

다음에 실시예로서 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

실시예 1

물의 양에 따른 SB365의 양적변화 :

원료 백두옹 분말 1g을 정확하게 측량하여 원심 분리관에 넣고, 일정량의 증류수로 반죽한다. 본 실험에서는 건조 백두옹 분말에 가항 조작할 수 있는 최소한의 물의 양 2 ml에서부터 10 ml까지 1 ml의 단위로 실험하였다. 반죽 즉시 이를 40℃ 항온 조건에서 1시간 동안 발효한다. 여기에 30 ml의 메탄올을 넣고 10분간 초음파 진탕한 후, 3000rpm에서 20분간 원심분리하여 상층액을 모은다. 상층액이 비워진 원심 분리관에 추가로 30ml의 메탄올을 넣고 10분간 초음파 진탕한 후, 3000rpm에서 20분간 원심분리하여 그 상층액을 처음 원심분리한 상층액과 합하여 감압건고 한다. 완전히 건고되면 여기에 HPLC용 메탄올 30ml을 정확하게 넣어 용해하고, 0.45μm membrane filter로 여과하여 검액으로 한다. 이를 HPLC로 정량 한다.

백두옹 1g당 SB365의 함량(mg) = 표준액 중의 SB365의 양(mg/ml) × (AT/AS) × 30(ml)

이동상의 용매 조건: 아세토니트릴 : 물 = 36 : 64

실시예 2

온도의 변화에 따른 SB365의 양적변화 :

원료 백두옹 혼합 분말 1 g을 정확하게 측량하여 원심 분리관에 넣고, 2 ml의 증류수로 반죽한다. 이를 인큐베이터로 조작된 각각의 온도 조건에서 1시간동안 발효한다. 여기에서는 37℃부터 42℃까지 온도를 1℃ 단위로 높여가며 실험 하였 다. 정확히 1시간 후 여기에 30 ml의 메탄올을 넣고 10분간 초음파 진탕한 후, 3000rpm에서 20분간 원심 분리하여 상층액을 모은다. 상층액이 비워진 원심 분리관에 추가로 30 ml의 메탄올을 넣고 10분간 초음파 진탕한 후, 3000rpm에서 20분간 원심 분리하여 그 상층액을 처음 원심 분리한 상층액과 합하여 감압건고 한다. 완전히 건고되면 여기에 HPLC용 메탄올 10 ml을 정확하게 넣어 용해하고, 이를 0.45 μm membrane filter로 여과하여 vial에 담아 HPLC로 정량 한다.

백두옹 1g당 SB365의 함량(mg) = 표준액 중의 SB365의 양(mg/ml) × (AT/AS) × 10(ml)

이동상의 용매 조건: 아세토니트릴 : 물 = 35 : 65

실시예 3

시간경과에 따른 SB365의 양적변화 :

원료 백두옹 혼합 분말 1 g 을 정확하게 측량하여 원심 분리관에 넣고, 2 ml의 증류수로 반죽한다. 이를 39℃ 항온조건에서 각각의 시간조건에 따라 발효한다. 여기에 30 ml의 메탄올을 넣고 30분간 초음파 진탕한 후, 3000rpm에서 20분간 원심 분리하여 상층액을 모은다. 상층액이 비워진 원심 분리관에 추가로 30 ml의 메탄올을 넣고 30분간 초음파 진탕한 후, 3000rpm에서 20분간 원심 분리하여 그 상층액을 처음 원심 분리한 상층액과 합하여 감압건고한다. 완전히 건고되면 여기에 HPLC용 메탄올 5 ml을 정확하게 넣어 용해하고, 이중 5 ml을 취하여 0.45 μm membrane filter로 여과하여 vial에 담아 HPLC로 정량 한다.

백두옹 1g당 SB365의 함량(mg) = 표준액 중의 SB365의 양(mg/ml) × (AT/AS) × 5(ml)

이동상의 용매 조건: 아세토니트릴 : 물 = 35 : 65

실시예 4

SB365-O로부터 SB365의 생성 :

백두옹 분말 1g을 정확하게 측량하여 원심 분리관에 넣고, 2ml의 증류수로 반죽한다. 이를 최적조건인 39℃ 항온 조건에서 3시간동안 발효한다. 여기에 30 ml의 메탄올을 넣고 10분간 초음파 진탕한 후, 3000 rpm에서 20분간 원심 분리하여 상층액을 모은다. 상층액이 비워진 원심 분리관에 추가로 30ml의 메탄올을 넣고 10분간 초음파 진탕한 후, 3000rpm에서 20분간 원심분리하여 그 상층액을 처음 원심분리한 상층액과 합하여 감압건고 한다. 완전히 건고되면 여기에 HPLC용 메탄올 30 ml을 정확하게 넣어 용해하고, 0.45μm membrane filter로 여과하여 이를 검액으로 한다. 이를 vial에 담아 HPLC로 정량 한다.

이동상의 용매 조건: 아세토니트릴 : 물 = 36 : 64

실시예 5

백두옹을 함유한 생약제의 숙성(GGG-ex의 제조)(처방 6) :

원료 백두옹 분말 3 g, 미삼 분말 1.5 g, 감초 분말 0.45 g을 잘 혼합하고 여기에 증류수 10 ml를 가한 후 잘 반죽한 다음 250 ml 크기의 비이커에 넣어 거즈로 싸고 비커는 뚜껑을 덮어 39℃ 항온, 습도 90% 이상의 incubator에 넣는다. 3시간이 지난 후 여기에 50 ml 의 메탄올을 가하고 10분간 교반한 다음 여과하고 식물잔체에는 80% 메탄올 50 ml 씩으로 2회 추출한다. 추출액은 합하고 이를 감압 건고한 다음 여기에 순 메탄올 60 ml를 가하여 흔들어 준 다음 0.45 μm membrane filter로 여과하여 불용분을 제거한다. 메탄올 용액은 감압 건고한다. 이의 평균 수율은 2.13 g이다. 이를 생리식염수 300 ml에 용해시키고 0.22μm millidisk cartrige filter를 사용하여 세균 여과고 주사제로 사용한다. 장기 보관용으로는 동결건조한다.

실시예 6

인삼엑기스의 제조(G-ex의 제조)

미삼 분말 1 g에 물 2 ml를 가하고 반죽한 다음 처방 4와 같은 조건에서 숙성하고 숙성된 미삼분말에 메탄올 10 ml를 가하고 흔들어 추출하였다. 남은 식물체에는 80 % 메탄올 5 ml 씩으로 2회 추출하였다. 추출물을 건고하여 G-ex 431 mg를 얻었다.

실시예 7

감초엑기스의 제조(Gg-ex의 제조)

감초 분말 1g을 취하여 위의 실시예 6과 동일하게 처리하여 Gg-ex 470 mg을 얻었다.

실시예 8

팔월찰 엑기스의 제조(Q-ex의 제조)

팔월찰 분말 1g을 취하여 위의 실시예 6과 동일하게 처리하여 Q-ex 553 mg을 얻었다.

실시예 9

유백피 엑기스의 제조(U-ex의 제조)

유백피 분말 1 g을 취하여 위의 실시예 6과 동일하게 처리하여 U-ex 367 mg을 얻었다.

본 발명의 방법으로 제조된 항암효과가 증강된 백두옹 엑기스는 단독 또는 인삼(Panax ginseng), 감초(Glycyrrhizae radix), 팔월찰(Pericarp of Akebia quinata) 및 유백피(Ulmi cortex)에서 선택된 보조생약의 추출물과 함께 약제학적으로 허용되는 통상의 보조제와 함께 주사제, 정제, 캡슐제, 산제, 액제, 시럽제, 소프트캡슐제 등으로 제제화할 수 있다.

제제실시예(처방)

제제실시예 1(처방 1의 구성)

실시예 1에서 얻어진 백두옹의 Pu-ex 250 mg을 생리식염수 50 ml에 용해시키고 이를 0.22μm millidisk cartrige filter를 사용하여 세균 여과한 다음 사용한다. 편의상 10개의 앰풀에 넣어서 보관한다. 마우스 당 이 액 0.2 ml를 주사한다.

제제실시예 2(처방 2의 구성)

공지 문헌(신규 항암성을 가지는 약학제제 및 제조 방법; 한국특허 제 72982호, 미국특허 제 6071521호)의 실시예로 제조된 조성물(SB31 : 상품명)

제제실시예 3(처방 3의 구성)

Pu-ex 250 mg, G-ex 90 mg, Gg-ex 30 mg을 생리식염수 50 ml에 용해하고 세균 여과하여 사용한다.

제제실시예 4(처방 4의 구성)

Pu-ex 250 mg, Q-ex 120 mg, Gg-ex 30 mg을 생리 식염수 50 ml에 용해하고 세균 여과하여 사용한다.

제제실시예 5(처방 5의 구성)

Pu-ex 230 mg, U-ex 80 mg, Gg-ex 30 mg을 생리식염수 50 ml에 용해하고 세균 여과하여 사용한다.

제제실시예 6(처방 6의 구성)

실시예 5에서 얻어진 조성물.

실험예 5

처방의 구성 및 항암성

Pu-ex를 바탕으로 하여 위에서 얻은 타 생약 엑기스를 가하여 다음과 같이 항암처방을 구성하였다.

처방 구성의 물량 비와 투여량은 SB31^®(신규 항암성을 가지는 약학제제 및 제조 방법; 한국특허 제 0722982호, 미국특허 제 6071521호)의 처방(백두옹 3, 미삼 1.5, 감초 0.45)에 따랐으며, 해당 량의 엑기스를 가하여 5.0 ml 생리식염수에 용해하고 세균 여과하여 사용한다.

각 엑기스 수율과 5 ml 주사액 중의 엑기스의 양을 계산하여 표 6에 나타내었다.

표 6. 생약 1 g 당 엑기스의 수율 및 vial당(5 ml) 엑기스의 함유량

처방 1 내지 처방 6에서의 5ml 바이알중의 생약의 함량은 다음의 표 7과 같다.

표 7. 처방의 구성 및 항암성

처방의 해설

처방 1은 숙성시킨 백두옹 엑기스(Pu-ex)만을 사용한 처방으로 항암성에 있어서 공지의 SB31^®(처방2) 보다 훨씬 우수한 항암성을 나타낸다. 처방 6은 SB31^®　의 구성 생약을 비율대로 혼합한 후 2배의 물을 가한 다음 위의 최적 조건으로 숙성시킨 후 메탄올로 추출한 엑기스이다. 이 점이 사실상 숙성 없이 물만으로 추출한 SB31^®과 다르다. 이 사실로부터 숙성 처방 6이 SB31^® 보다 우수한 항암성을 보임을 알 수 있다.

처방 4와 5는 처방 3의 미삼엑기스(G-ex) 대신 으름엑기스(Q-ex) 및 유피엑 기스(U-ex)를 계산 량의 비율로 혼합한 처방이다. 원 처방인 SB31^®이나 이의 응용처방인 처방 3이나 처방 6보다 그 항암성에 있어서 열등하다.

결론적으로 용매 처리하여 얻은 GGG-ex는 처방 3인 SB31^®보다 우수한 항암 효과를 보임으로 이들에 대한 전임상 및 임상연구가 요구된다. 그리고 전체적 측면에서 판단하여 볼 때 위 처방 모두가 임상항암제보다 질적으로나 그 작용에 있어서 우수함으로 이들을 항암제로 사용할 수 있다고 본다.

독성

또 한가지 중요한 사실은 숙성과 용매처리로 얻은 처방들은 종전의 물 추출방법으로 얻은 제제에 비하여 이상 반응이 적다는 것이다. 그러나, 숙성후 물추출은 이상반응은 약간 나타나나, 항암성은 우수하였다.

처방증 SB365의 함량

각 처방 5ml에는 0.80 - 1.53 mg 범위의 SB365를 함유한다.

인체 투여량

SB31^®　의 제1상 임상결과를 참고하면, 위의 처방은 모두 바이알당 생리식염수 5ml를 가하여 녹이고 이를 점적주사 한다. 최적투여량은 12.15 ml/m² 내지 29.1 ml/m² 범위가 좋고 가장 적합한 투여량은 21.87 ml/m²이다.

실험예 7

SB365의 일반적 정량법

검 액 : 백두옹 분말 1 g을 정확하게 측량하여 원심 분리관에 넣고, 일정량의 증류수로 반죽한다. 이를 인큐베이터에서 선택된 온도 및 시간에서 발효시킨다. 여기에 30 ml의 메탄올을 넣고 10분간 초음파 진탕한 후, 3000rpm에서 20분간 원심 분리하여 상층액을 모은다. 상층액이 비워진 원심분리관에 추가로 30 ml의 80 % 메탄올을 넣고 10분간 초음파 진탕한 후, 3000rpm에서 20분간 원심분리하여 그 상층액을 처음 것과 합하여 감압건고 한다. 완전히 건고되면 여기에 일정량의 HPLC용 메탄올을 넣어 용해하고, 이를 0.45 μm membrane filter로 여과하여 vial에 담아 검액으로 한다.

표준액 : 정량용 SB365 표준품 약 5 mg을 정밀하게 달아 메탄올에 녹여 정확하게 50 ml로 하여 표준액으로 한다.

조 작 : 검액 및 표준액을 가지고 다음 조건으로 액체크로마토그래프 법에 따라 시험하여 SB365의 피크면적 AT 및 AS을 이용하여 구한다.

백두옹 g 당 SB365의 함량(mg) = 표준액 중의 SB365의 양(mg/ml) × (AT/AS) × 최종 용매 사용량(ml)

조작조건:

검출기 : 자외부흡광광도계 (측정파장 210nm)

칼 럼 : Watchers ODS-BP

이동상 : 아세토니트릴, 물 혼합액 (35:65 또는 36:64)

유 속 : 1ml/min

주입량 : 20ul

실험예 8

항암효과의 측정

1. 실험 동물:

실험에 사용한 마우스는 4 주령의 체중이 20 - 23 g의 건강한 수컷 BDF-1으로서, 대한실험동물센터에서 공급받아 사용하였다.

2. BDF-1의 사육:

사육기간 동안, 온도는 22 ± 2 ℃, 습도는 65 ± 5%로 유지하였으며, 12 시간을 주기로 명암을 주었다. 물과 먹이는 제한 없이 공급하였으며, 사료는 항생제 무첨가 마우스용사료를 사용하였다.

3. 동물실험 방법:

테루히로(Teruhiro)의 방법으로 BDF-1의 왼쪽 앞 겨드랑이 피하에 LL/2 (Lewis lung carcinoma cell) 1 × 106 세포/마우스를 이식하였다. 이식한지 24 시간이 경과하였을 때, 각 군을 5 마리씩 나눈 후, 매일 체중변화를 점검하면서 2 주간 복강 주사하였다. 대조군의 암 부피(tumor volume)가 약 2 ㎤되었을 때부터 암 크기를 측정한, 다음 아래의 계산식으로 암 부피를 구하여 각 시료의 항암효과를 측정하였다.

암의 부피(tumor volume, ㎣) = 길이(㎜) × 넓이2(㎟) / 2

투여량

본원발명에서 얻어진 백두옹의 Pu-ex 250 mg을 생리식염수 50 ml에 용해시키고 이를 0.22μm millidisk cartrige filter를 사용하여 세균 여과한 다음 사용한다. 편의상 10개의 앰풀에 넣어서 보관한다. 마우스 당 이 액 0.2 ml를 주사한다.

본 실험의 결과는 표 7에 나타내었다.

본 발명은 백두옹을 추출하기 전에 백두옹 자체가 가지는 효소로 숙성 및 효소가수분해시켜서 항암효과가 거의 없으면서, 다량으로 존재하는 백두옹 사포닌인 3-O-[O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[O-β-D-글루코피라노실-(1→4)]-α-L-아라비노피라노실] 헤데라제닌 28-O-α-L-람노피라노실-(1→4)-O-β-D-글루코피라노실-(1→6)-β-D-글루코피라노실 에스터(코드명 : SB365-O)를 항암효과가 강력한 백두옹 사포닌인 3-O-[O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[O-β-D-글루코피라노실-(1→4)]-α-L-아라비노피라노실] 헤데라제닌(코드명 : SB365)으로 변환시킨 후에 각종의 용매로 추출하여 백두옹 추출물을 제공하는 것이며 본 발명에 의하여 백두옹의 항암효과를 크게 증강시킬 수 있다.

Claims

백두옹(Pulsatillae radix)을 중량으로 백두옹 1에 대하여 물 2 ~ 20배량, 발효 및 숙성온도 37 ~ 43℃에서 20분 ~ 360분간 발효 및 숙성시켜서 항암효과가 거의 없으면서, 다량으로 존재하는 백두옹 사포닌인 3-O-[O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[O-β-D-글루코피라노실-(1→4)]-α-L-아라비노피라노실] 헤데라제닌 28-O-α-L-람노피라노실-(1→4)-O-β-D-글루코피라노실-(1→6)-β-D-글루코피라노실 에스터(코드명 : SB365-O)를 가수분해시켜서, 항암효과가 강력한 백두옹 사포닌인 3-O-[O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[O-β-D-글루코피라노실-(1→4)]-α-L-아라비노피라노실] 헤데라제닌(코드명 : SB365)으로 변환시킨 후에 추출하여 백두옹의 항암효과를 크게 증강시키는 방법.
백두옹(Pulsatillae radix)을 중량으로 백두옹 1에 대하여 물 2 ~ 20배량, 발효 및 숙성온도 37 ~ 43℃에서 20분 ~ 360분간 발효 및 숙성시켜서 항암효과가 거의 없으면서, 다량으로 존재하는 백두옹 사포닌인 3-O-[O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[O-β-D-글루코피라노실-(1→4)]-α-L-아라비노피라노실] 헤데라제닌 28-O-α-L-람노피라노실-(1→4)-O-β-D-글루코피라노실-(1→6)-β-D-글루코피라노실 에스터(코드명 : SB365-O)를 가수분해시켜서, 항암효과가 강력한 백두옹 사포닌인 3-O-[O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[O-β-D-글루코피라노실-(1→4)]-α-L-아라비노피라 노실] 헤데라제닌(코드명 : SB365)으로 변환시킨 후에 추출하여 백두옹의 항암효과가 크게 증강된 조성물.
제 2항의 항암효과가 증강된 추출물을 주성분으로 함유하고 여기에 인삼(Panax ginseng), 감초(Glycyrrhizae radix), 팔월찰(Pericarp of Akebia quinata) 및 유백피(Ulmi cortex)에서 선택된 보조생약의 추출물을 함유하는 항암효과가 증강된 조성물.
청구항 2 또는 3의 조성물을 유효성분으로 함유하고 여기에 통상의 약학적 보조제와 함께 약학적 제제로 제조한 약학적 제제.